一种检测猪尿中β-受体激动剂的方法技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种检测猪尿中β-受体激动剂的方
法，尤其是涉及一种同时检测猪尿中26种β-受体激动剂的方法。
背景技术
β-受体激动剂(β-agonists)是一类化学合成的苯乙醇胺类物质，包括特布
他林、沙丁胺醇、齐帕特罗、西马特罗、西布特罗、羟苄羟麻黄碱、克伦赛
罗、溴代克伦特罗、克伦普罗、氯丙那林、莱克多巴胺、妥布特罗、克伦特
罗、羟甲基克伦特罗、溴布特罗、班布特罗、马布特罗、苯氧丙酚胺、马喷
特罗、喷布特罗、苯乙醇胺A、沙美特罗、克伦潘特罗、福莫特罗、菲诺特罗、
异丙肾上腺素等数十种，可分为含取代基的苯胺型(如克仑特罗)、苯酚型(如
沙丁胺醇)、苯二酚型(如特布他林)三大类。
在饲料中添加β-受体激动剂给动物饲喂后具有营养再分配作用，在动物体
内能促进脂肪分解，增加蛋白质的合成，提高酮体的产生，从而增加瘦肉率。
但是如果激动剂的用量大、时间长，在动物体内的蓄积量就会比较大，尤其
是内脏等部位。人食用了这些药物残留的畜禽产品后会出现面色潮红、头痛、
头晕、胸闷、心悸、四肢麻木等不良反应，严重的甚至可能危及生命。因此
国际上很多国家先后立法禁止在畜禽生产上使用该类药物，我国政府也明令
禁止其使用。
β-受体激动剂被动物体摄取后，会在体内发生代谢反应，其代谢产物部分
可通过尿液排出。因此通过检测动物的尿液中β-受体激动剂的含量，能够准
确地了解饲养过程中该类药物的使用情况。目前，国内的检测方法主要有试
纸卡快速筛查法、酶联免疫法、液相色谱法、气质联用法、液质联用法等。
相关国家标准有《农业部1025号公告-11-2008猪尿中β-受体激动剂多残留检
测液相色谱-串联质谱法》、《农业部1031号公告-3-2008猪肝和猪尿中β-
受体激动剂残留检测气相色谱-质谱法》、《农业部1063号公告-3-2008动物
尿液中11种β-受体激动剂的检测液相色谱-串联质谱法》。
然而现有检测方法大都存在如下通量较低、前处理步骤繁琐和成本高等
缺陷。β-受体激动剂包括克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等数十种，目前相
关的国家标准以及技术文献所规定和报道的检测方法所能够同时检测的β-受
体激动剂种类约为5-15种，相对而言通量较低。目前相关的国家标准以及技
术文献所规定和报道的前处理方法中所应用的净化方法多为混合型阳离子交
换(MCX)固相萃取法和亲水亲脂平衡(HLB)固相萃取法，该类方法的净
化原理为吸附-解吸附作用，操作步骤繁琐，且需配置大量淋洗液及洗脱液。
此外，目前检测方法前处理方法中所应用的净化方法中使用的两类固相萃取
柱价格较高，在大量样品的净化过程中成本较高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种检测猪尿
中β-受体激动剂的方法。本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法通量高、
操作步骤简单，成本低。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测猪尿中β-受体激动剂的方法，猪尿样品经含氨水的乙腈稀释，
与无水硫酸钠和氯化钠混匀后离心，取上清液用分散式固相萃取，高速离心
分离沉淀，甲醇-0.1％甲酸水溶液溶解沉淀，微孔滤膜过滤，以液相色谱-串联
质谱测定，内标法定量。
本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法利用分散式固相萃取，吸附
杂质、净化样品，而猪尿样品β-受体激动剂不被吸附，能够一次性检测包括
特布他林、沙丁胺醇、齐帕特罗、西马特罗、西布特罗、羟苄羟麻黄碱、克
伦赛罗、溴代克伦特罗、克伦普罗、氯丙那林、莱克多巴胺、妥布特罗、克
伦特罗、羟甲基克伦特罗、溴布特罗、班布特罗、马布特罗、苯氧丙酚胺、
马喷特罗、喷布特罗、苯乙醇胺A、沙美特罗、克伦潘特罗、福莫特罗、菲
诺特罗、异丙肾上腺素等26种β-受体激动剂，通量明显高于同类型的其他方
法。
其中，所述分散式固相为十八烷基硅烷和N-丙基乙二胺的混合物。优选
的，所述十八烷基硅烷和N-丙基乙二胺的质量比为1:2～3:1，更优选为1:1。
在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法中，按
g/mL计，所述分散式固相与上清液的质量体积比为1:20～1:25。在一些具体实
施例中，所述分散式固相与上清液的质量体积比为1:20～1:25。
在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法中，所
述含氨水的乙腈中氨水的含量为4v/v％。
优选的，所述含氨水的乙腈与猪尿样品的体积比为5:1。
在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法中，按
g/mL计，所述无水硫酸钠与猪尿样品的质量体积比为2:1～6:1。即每毫升猪尿
样品中加入2g-6g无水硫酸钠。优选为，按g/mL计，所述无水硫酸钠与猪尿
样品的质量体积比为4:1。即每毫升猪尿样品中加入4g无水硫酸钠。
在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法中，按
g/mL计，所述氯化钠与猪尿样品的质量体积比为1:2～2:1。即每毫升猪尿样品
中加入0.5g～2g氯化钠。优选为，按g/mL计，所述氯化钠与猪尿样品的质量
体积比为1:1。即每毫升猪尿样品中加入1g氯化钠。
在一些实施方案中，本发明所述检测方法所述与无水硫酸钠和氯化钠混
合具体为涡旋震荡混匀后放入恒温振荡机振荡后超声。
优选的，所述振荡时间为20min，所述超声时间为5min
在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法中，所
述离心为4℃，8000rpm，离心5min。
在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法中，所
述高速离心为4℃，10000rpm，离心10min。
在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法在高速
离心前还包括涡旋的步骤。所述涡旋的时间为2min。
在一些优选实施方案中，本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法在
高速离心后还包括氮吹的步骤。所述氮吹具体为45℃氮吹至干。
本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法中高速离心分离的沉淀采用
甲醇-0.1％甲酸水溶液溶解微孔滤膜过滤后用于液相色谱-串联质谱测定。所述
甲醇-0.1％甲酸水溶液为甲醇与0.1％甲酸水溶液的混合溶液。优选的，所述甲
醇与0.1％甲酸水溶液的体积比为1:9。
在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法中，所
述微孔滤膜孔径为0.22μm。
本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法采用液相色谱-串联质谱测定
猪尿中β-受体激动剂。
其中，在一些实施方案中，所述液相色谱-串联质谱测定方法中所述液相
色谱法色谱条件为以十八烷基硅烷为固定相，以1‰甲酸水溶液为流动相A，
以1‰甲酸乙腈溶液为流动相B，流速为0.2mL/min，30℃，进样5μL，梯度
洗脱。
进一步的，所述液相色谱法中所述梯度洗脱的洗脱程序为B相初始浓度
为8％，0min～8min，8％线性变化至30％；8min～10min，30％线性变化至60％；
10min～12min，60％线性变化至95％；12min～13min，维持95％；13min～13.1min，
95％线性变化至5％。
在一些实施方案中，所述液相色谱-串联质谱测定方法中所述质谱条件为
离子源为ESI(+)，离子源接口电压3.5kV，3.0L/min雾化，20L/min氮气干燥，
以氩气为碰撞气，脱溶剂管温度250℃，加热模块温度450℃，检测器电压1.1
kV，进行多反应监测扫描。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种检测猪尿中β-受体激动剂的方
法。本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法为猪尿样品经含氨水的乙腈
稀释，与无水硫酸钠和氯化钠混匀后离心，取上清液用分散式固相萃取，高
速离心分离沉淀，甲醇-0.1％甲酸水溶液溶解沉淀，微孔滤膜过滤，以液相色
谱-串联质谱测定，内标法定量。本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法
利用分散式固相萃取，吸附杂质、净化样品，而猪尿样品β-受体激动剂不被
吸附，能够一次性检测26种β-受体激动剂，通量明显高于同类型的其他方法，
回收率高，精密度好。同时采用分散式固相萃取一步净化，没有复杂的淋洗、
洗脱步骤，操作简单，萃取剂价格低廉，成本低于现有的固相萃取柱净化法，
而且使用有机试剂量少，有利于保护实验人员的健康。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部
的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性
劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明所述检测方法进
行详细说明。其中，特布他林、沙丁胺醇、齐帕特罗、西马特罗、西布特罗、
羟苄羟麻黄碱、克伦赛罗、溴代克伦特罗、克伦普罗、氯丙那林、莱克多巴
胺、妥布特罗、克伦特罗、羟甲基克伦特罗、溴布特罗、班布特罗、马布特
罗、苯氧丙酚胺、马喷特罗、喷布特罗、苯乙醇胺A、沙美特罗、克伦潘特
罗、福莫特罗、菲诺特罗、异丙肾上腺素26种β-受体激动剂标准品，纯度
≥97.0％。氮气：纯度99.99％。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯。其它试剂如无
特别说明均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的规定。
实施例1、
1、试剂配制
4v/v％氨水乙腈溶液：取4mL氨水于100mL容量瓶，用乙腈定容至100mL。
0.1％甲酸水溶液：取100mL纯水，加入0.1mL甲酸。
β-激动剂贮备液配制：分别精密称取26种β-激动剂类药物对照品，用甲
醇配成26份，浓度各为1mg/mL标准贮备液，-20℃保存。
混合对照工作液：分别吸取26种β-受体激动剂贮备液，置棕色储液瓶中，
用甲醇稀释成浓度为2ppm混合对照液，-20℃保存。
混合对照工作液(内标)：分别吸取4种氘代β-受体激动剂贮备液，置
棕色储液瓶中，用甲醇稀释成浓度为2ppm混合对照液，-20℃保存。
2、仪器和设备
液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾电离源；氮吹仪；离心机：最大转速
大于10000rpm；滤膜0.22μm水系；天平：感量为0.0001g和0.01g各一台；
旋涡振荡器；超声波清洗仪；恒温振荡机。
3、检测方法
3.1、采样和试样制备
抽取有代表性的样品，用四分法缩减取100mL，过0.4mm孔径的分析筛，
混匀，装入试剂瓶中，避光，-20℃储存备用。
3.2、提取
取样品2mL(精确至0.01mL)，加入10mL4v/v％氨水乙腈、8g无水
硫酸钠、2g氯化钠涡旋震荡混匀后放入恒温振荡机振荡20min，超声5min，
4℃，8000rpm，离心5min，取2mL上层清液。
3.3、净化
净化管中加入25mgC18和25mgPSA，取2mL提取的上层清液于净化
管中，涡旋2min，4℃、10000rpm离心，10min，45℃氮吹至干，用1mL甲
醇-0.1％甲酸水溶液(1:9(v/v))溶解，过0.22μm滤膜。
3.4、液相色谱-串联质谱测定
液相色谱条件：
a)色谱柱：ZORBAXEclipseXDB-C18色谱柱(2.1×100mm,2.7μm)
b)流动相：1‰甲酸水溶液(A)、1‰甲酸乙腈溶液(B)
c)流速：0.2mL/min
d)进样体积：5μL
e)柱温：30℃
f)洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为8％，时间程序见表1。
表1梯度洗脱程序
时间(min)
部件
操作
值(％)
8.0
泵
B相浓度
30
10.0
泵
B相浓度
60
12.0
泵
B相浓度
95
13.0
泵
B相浓度
95
13.1
泵
B相浓度
8
15.0
控制器
停止
质谱条件
a.分析仪器：LCMS-8040
b.离子源：ESI(+)
c.离子源接口电压：3.5kV
d.雾化气及干燥气：氮气3.0L/min、20L/min
e.碰撞气：氩气
f.脱溶剂管温度：250℃
g.加热模块温度：450℃
h.检测器电压：1.1kV
i.扫描模式：多反应监测
4、实验结果：
按照上述方法检测猪尿中26种β-受体激动剂在5μg/kg、10μg/kg和
10μg/kg三个浓度上的添加试验的回收率及精密度，结果如下表2所示。
表2回收率及精密度
由表2结果可见，在5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg三个浓度下，26种β-受
体激动剂回收率在53.4％～128.6％之间，精密度RSD在0.4％～16.2％之间，回
收率高，精密度好，符合日常检测猪尿中26种β-受体激动剂的要求。