一种高正品率双尾型金鱼的分子选育方法技术领域
本发明涉及金鱼品种的选育方法，具体地说，涉及一种高正品率双尾型金
鱼的分子选育方法。
背景技术
金鱼(Carassiusauratus)是世界著名三大观赏鱼之一，发源于中国，至今
已有1700多年历史。金鱼色彩鲜艳，婀娜多姿，是美化环境、陶冶情操的活体
艺术品。由于金鱼繁殖周期短，易于饲养和管理，常被作为实验动物，应用于
生物学和医学上的研究。金鱼经济价值巨大，全国有大大小小金鱼场、企业、
公司上万家，年产值近50亿元，金鱼年出口创汇约达2亿美元。我国拥有金鱼
品种资源共有46个品系，315个品种，其中70％是尚未开发的基础品种，发展
潜力巨大。
金鱼起源于草种金鱼(俗称草金)，较原始的草金外观及体形似鲫鱼，保留
了野生型单尾，是现有双尾型金鱼的祖先。与单尾型草金相比，双尾型金鱼在
尾部骨架分裂而形成2个完整的尾鳍。金鱼双尾型性状在自然界属独一无二，
在其它动物中未曾发现过。
金鱼作为我国重要的观赏性经济鱼类，其尾鳍表型性状一直是人工选择和
培育的难点。金鱼尾型性状的变异率较大，遗传很不稳定，有些品种的双尾型
正品率很低，通常在10％以下。也就是说，每繁殖培育出1万尾小鱼，最终能
够达到质量标准要求的只有几百尾。这不仅浪费了大量的人力物力，而且成品
数量不能满足市场的需求。厂家为了凑足数量，常常降低选择标准，严重影响
了中国金鱼在国内外市场上的声誉，破坏了中国金鱼的品牌。低正品率每年造
成很大的人力和物力浪费，直接导致养殖企业效益下滑。
水产动物的尾鳍是由尾轴骨所支撑，尽管硬骨鱼类的尾鳍表现出多样性和
复杂性，但是它们内部尾轴骨的基本结构是一致的，尾椎骨和鳍条都位于尾骨
的中轴线上。研究表明，鱼类的尾鳍的发育受到胚胎背腹化(dorsal–ventral
patterning)调控信号通路如BMP、Wnt-8等基因的调控，但目前不清楚具体是
哪个基因突变诱导金鱼双尾型突变的产生，其遗传机制尚不清楚。
研究金鱼双尾型突变的机制，将有助于在品种繁育的早期淘汰不合要求的
单尾型后代，获得高正品率双尾型后代，提高选育的准确度，以减少后期饲养
单尾型非正品后代而产生的人力、物力消耗，提高经济效益。然而目前关于高
正品率双尾型金鱼的分子选育方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供双尾型金鱼选育或鉴别的方
法。
第一方面，本发明提供了一种高正品率双尾型金鱼的分子选育方法，包括
以下步骤中的任一种：
a)检测金鱼是否为纯合基因型ChordinAG369/G369,T379/T379，其中核苷酸位置
编号基于SEQIDNO.11(双尾型金鱼的CDs序列)；
b)检测金鱼ChordinA蛋白的氨基酸序列是否如SEQIDNO.12所示。
第二方面，本发明提供了一种鉴别鱼尾型的方法，包括以下步骤中的任一
种：
a)检测鱼的ChordinA基因型，如为纯合基因型ChordinAG369/G369,T379/T379，
则为双尾型；如为纯合基因型ChordinAA369/A369,G379/G379、ChordinAG369/G369,
G379/G379、单位点杂合基因型ChordinAA369/A369,G379/T379或双位点杂合基因型
ChordinAA369/G369,G379/T379，则为单尾型；其中核苷酸位置编号基于SEQID
NO.11；
b)检测鱼的ChordinA蛋白的氨基酸序列，其序列如SEQIDNO.12所示
则为双尾型；否则为单尾型。
第三方面，本发明提供了一种双尾型金鱼的培育方法，包括以下步骤中的
任一种：
a)使ChordinA基因的第369位置处的碱基发生A→G的突变，且第379
位置处的碱基发生G→T的突变；
b)使ChordinA基因的第369位置处的碱基发生A→G的突变，且第2外
显子的127氨基酸位置发生终止突变。
第四方面，本发明提供了一种寡核苷酸探针，其长度为15-500bp，且特异
性地针对以下变异位点：鱼ChordinA基因，第369位置处A→G突变或第379
位置处G→T突变，其中核苷酸位置编号基于SEQIDNO.11。
第五方面，本发明提供了一种基因芯片，包括：固相载体，以及如上所述
的寡核苷酸探针。
第六方面，本发明提供了一种检测试剂盒，包括如上所述的寡核苷酸探针。
第七方面，本发明提供了所述的寡核苷酸探针、所述的基因芯片或所述的
检测试剂盒在选育高正品率双尾型金鱼、鉴别鱼尾型或培育双尾型金鱼中的应
用。
第八方面，本发明提供了鱼ChordinA基因或蛋白的用途，用于制备鉴别
鱼尾型的试剂、芯片或试剂盒。
本发明优点在于：
本发明采用分子生物学方法对不同品种金鱼及其杂交鱼进行了ChordinA
基因型研究，发现ChordinA基因的第二外显子特异位点突变决定了金鱼双尾
型的产生。单尾鳍鲤鱼、鲫鱼和团头鲂的ChordinA基因型均为：
AACTCA369GGGAAAAAGG379AG，为纯合基因型ChordinAA369/A369,G379/G379。
单尾金鱼(草金)的ChordinA基因型为：AACTCA369GGGAAAAAGG/T379AG，
为单位点杂合基因型ChordinAA369/A369,G379/T379或纯合基因型
AACTCG369GGGAAAAAGG379AG，ChordinAG369/G369,G379/G379。双尾金鱼品系
的ChordinA基因型均为：AACTCG369GGGAAAAAGT379AG，为纯合基因型
ChordinAG369/G369,T379/T379。而单尾鳍与双尾型金鱼杂交后代ChordinA基因型存
在2种类型，即AACTCA369GGGAAAAAGG/T379AG，为单位点杂合基因型
ChordinAA369/A369,G379/T379，以及AACTCA/G369GGGAAAAAGG/T379AG，为双
位点杂合基因型ChordinAA369/G369,G379/T379。基于此，本发明提供了一种高正品
率双尾型金鱼分子选育方法，通过金鱼后代ChordinA基因型的分析，后代基
因型为纯合ChordinAG369/G369,T379/T379即可判定为双尾型，在早期淘汰不合要求
的单尾ChordinAA369/A369,G379/G379、ChordinAG369/G369,G379/G379、ChordinAA369/A369，
G379/T379或ChordinAA369/G369，G379/T379基因型后代，即可获得高正品率双尾型后代，
提高选育的准确度，达到减少后期饲养单尾型非正品后代而产生的人力、物力
消耗，提高经济效益。基于上述原理，本发明还提供了一种鉴别鱼尾型的方法、
一种双尾型金鱼的培育方法，以及鉴别上述突变的寡核苷酸探针、基因芯片和
试剂盒。
附图说明
图1.金鱼不同品种及各种杂交鱼ChordinA基因的PCR扩增结果。M：
标准分子量；1～3：鹤顶红；4：花琉金；5：红琉金；6：黑龙睛；7：红龙睛；
8：红狮；9：鲤鱼；10：金鱼(♀)与鲤鱼(♂)杂交后代；11：草金；12：红琉金
(♀)与草金(♂)杂交后代：13：野鲫；14～15：红琉金(♀)与野鲫(♂)杂交后代；16：
团头鲂；17：红琉金(♀)与团头鲂(♂)杂交后代。
图2.不同鱼类及其与金鱼的杂交鱼尾型和ChordinA的基因型。A：
Commoncarp鲤鱼(♂)；B：Wildgoldfish草金(♂)；C：Cruciancarp鲫鱼(♂)；
D：Bluntsnoutbream团头鲂(♂)。A1：红琉金(♀)与鲤鱼(♂)杂交后代；B1-B2：
红琉金(♀)与草金(♂)杂交后代；C1-C2：红琉金(♀)与野鲫(♂)杂交后代；D1：
红琉金(♀)与团头鲂(♂)杂交后代。
图3.不同品种金鱼的尾型和ChordinA的基因型。RedcapOranda：鹤顶
红；FlowerRukin：花琉金；RedRukin：红琉金；Blacktelescope：黑龙睛；
Redtelescope：红龙睛；Oranda：红狮。
图4.ChordinA基因测序峰形图。(a)双尾型测序峰形图；(b)单尾纯合型测
序峰形图；(c)单尾杂合型测序峰形图。
图5.ChordinA基因碱基核苷酸序列的比较。
图6.不同探针在单尾鳍和双尾鳍中的整胚原位杂交结果。S1-S8：单尾鳍；
S1，S6-S8：团头鲂胚胎；S2-S5：草金胚胎；T1-T8：双尾鳍(鹤顶红胚胎)；
比例尺＝600μm。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1.材料与方法
1.1实验用鱼、胚胎及质粒
本实验所用金鱼鹤顶红、花琉金、红琉金、黑龙睛、红龙睛、红狮均取自
上海青浦久逸水族科技开发有限公司。鲤鱼、草金、野生鲫鱼、团头鲂这四种
鱼与金鱼的杂交鱼均取自上海海洋大学农业部团头鲂遗传育种中心，斑马鱼取
自上海海洋大学农业部水产种质资源重点实验室斑马鱼鱼房。
1.2实验试剂
购于天根(北京)生物有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒、
Taq酶、dNTP混合物、DNAMarkerⅠ、DNAMarkerⅢ、DNAMarkerD2000、
琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α
等；购于Axygen(美国)公司的DNA胶回收试剂盒；购自宝生物工程(大连)
有限公司的LATaqDNAPolymerase、MightyAmpDNAPolymerase、pMD-19T
载体；购于上海捷瑞生物有限公司的FermentasT4DNA连接酶；购于Promega
公司的SP6酶、T7酶、100mMDTT、RNAasin、5×Transcriptionbuffer、限制
性内切酶SacI、SacII、NotI、XbaI、pGEM-T载体等；购于瑞士Roche的BMPurple
AP显色液；实验中所用到引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
1.3分子检测及测序
剪取约25mg的样品组织(鱼鳍)，按照海洋动物组织基因组DNA提取试
剂盒说明书进行基因组DNA提取。合成ChordinA突变位点基因型检测引物
Chd-F1和Chd-R1(表1)，以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，反
应程序为94℃，5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，40s，30个循环；72℃，
10min，4℃保藏。
表1所用引物的序列
注：F为正向引物，R为反向引物。
配制浓度为1.2％的琼脂糖凝胶进行样品的检测。将PCR扩增产物加入点
样孔，设置电压120V，电流60mA，时间为30min，电泳完成后使用SA-1000
Red凝胶成像系统进行电泳结果拍摄。配制浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行目的
片段的回收，将回收的目的片段PCR产物先与6×Loadingbuffer混匀，后用移
液枪打入点样孔，电泳条件为电压100V，电流50mA，电泳时间30min；电
泳结束后，在256nm紫外灯下观察目的条带DNA的迁移位置，用干净刀片切
下含有目的条带DNA的凝胶，放入干净的1.5mL离心管中，使用琼脂糖凝胶
回收试剂盒回收目的条带DNA。检测回收产物DNA的浓度，并使用浓度为
1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。在T4连接酶的作用下，将回收得到的目的片段
DNA与克隆载体pGEM-T进行连接、转化。步骤：1)将10μL连接后的混合
物与100μL的感受态大肠杆菌DH5α放于冰盒上，在超净工作台中用移液器
轻轻混匀，注意不要产生气泡，再放于冰盒上，然后将冰盒放于4℃冰箱孵育
30min。2)取出放入42℃水浴锅中热激90s，迅速放入-20℃冰箱中急冷5min。
3)取出，在超净工作台中加入890μLLB培养基，放在37℃恒温摇床中，220
rpm摇菌30min直至菌液变浑浊。4)取出放于离心机中，2000rpm，5min将
菌液富集，吸去上层700μL菌液，吸取剩余菌液250μL，涂布在含有Amp+
抗性的LB平板培养基中，用涂布棒涂布均匀。5)将平板倒置于37℃恒温培
养箱中过夜培养(一般约16h)。6)阳性菌落的筛选：用牙签挑取单菌落作为
模板进行PCR扩增。对PCR产物通过1.2％的凝胶电泳检测，每个样品选取
1-2个阳性克隆送上海生工生物有限公司进行测序。根据测序结果分析Chordin
A特异突变位点的基因型。
1.4整胚原位杂交
ChordinA(Chd-F1/R1)、Ntl(Ntl-F/R)、Bmp4(Bmp4-F/R)基因探针引
物设计如表1所示，扩增的目的条带要包括开放阅读框(ORF)和3'非翻译区
(3'-UTR)，以cDNA为模板，设计引物进行PCR扩增。反应程序为：94℃5
min；94℃30s，59℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。将PCR
产物所得目的片段割胶回收，与pGEM-T载体连接，37℃培养，检菌、测序。
原位杂交探针的制备：1)测序后获得目的片段插入质粒，使用质粒抽提
试剂盒提取探针质粒。2)根据目的片段插入质粒的方向，选择合适的限制性
内切酶对重组质粒进行单酶切线性化。酶切反应体系为：质粒浓度在7～8
ng/μL、限制性内切酶4μL、BufferD10μL、BSA1μL，补加DEPC去离子水
至100μL，间断离心混匀，封口膜封住，置于37℃水浴锅中，反应2.5h。3)
用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒是否切开，没有切开继续加入限制性
内切酶，直至切开。4)使用大量DNA产物回收试剂盒回收重组质粒单酶切产
物，30μLDEPC水洗脱，-20℃冰箱备用。5)以单酶切产物为模板合成探针，
注意整个过程中都要使用RNAfree的离心管和枪头。反应体系为：1000ng的
重组质粒单酶切产物、2μL5×transcriptionBuffer、1μLDig-RNALabelingMix、
1μLDTT、0.5μLRNAsein、0.5μLSP6/T7RNApolymerase，加DEPC水至10μL，
37℃水浴锅中，反应4h。6)加入30μLLiCl和30μLRNasefreeWater，离心
混匀后，-20℃冰箱放置约1h。7)14000rpm，4℃离心15min。8)加入1mL70％
乙醇，14000rpm，4℃离心15min。弃上清，超净工作台中晾置5min。9)加
入30μLRNasefreeWater和0.3μLRNase抑制剂(RRI)溶解，-80℃保存。10)
取1μL探针溶于3μLRNasefreeWater中混匀，取2μL用RNasefreeWater
稀释25倍，使用SmartSpecTMPlus分光光度计测探针RNA的浓度，正常值要
大于50ng/mL；取2μL探针沸水煮5min，冰上急冷3min，打开RNA二级
结构。使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测探针RNA的质量，电泳条件：电压150
V，电流50mA，时间15min。
整胚原位杂交：鱼类胚胎先经4％多聚甲醛(PFA)、4℃过夜固定，除去4％
PFA后加入纯甲醇，可长期置于4℃保存。固定胚胎经不同浓度PBST复水，蛋
白酶K消化，4％PFA再固定，60℃预杂交及杂交后，回收探针，与抗体结合，
清洗之后加入BMPurpleAP显色液。胚胎显色后在NikonSMZ1500荧光体视显
微镜下进行拍照。
2.结果
2.1金鱼及其杂交鱼ChordinA基因PCR扩增结果
使用引物Chd-F1和Chd-R1(表1)，对不同品种金鱼及金鱼杂交鱼的亲本
进行PCR扩增，电泳检测结果表明所有的金鱼及金鱼杂交鱼都有约400bp大
小的ChordinA基因特征条带。检测结果如图1所示。
2.2单尾鱼类的尾型与ChordinA基因型的关系
以四种单尾鲤科鱼类鲤鱼、单尾鳍金鱼(草金)、鲫鱼和团头鲂基因组DNA
为模板，通过Chd-F1/Chd-R1引物(表1)PCR扩增，割胶回收得到的产物经
连接、转化、检菌，上海生工生物有限公司测序，结果如图2中A-D所示。
单尾鳍鲤鱼、鲫鱼和团头鲂的ChordinA基因型均为：
AACTCA369GGGAAAAAGG379AG，为纯合基因型ChordinAA369/A369,G379/G379，
而单尾鳍金鱼(草金)的ChordinA基因型为：
AACTCA369GGGAAAAAGG/T379AG，为379位点杂合基因型ChordinAA369/A369,
G379/T379，或者是纯合基因型AACTCG369GGGAAAAAGG379AG，ChordinA
G369/G369,G379/G379。四种单尾鲤科鱼类的ChordinA均可编码943个氨基酸左右的
完整功能蛋白。
2.3双尾金鱼尾型与ChordinA基因型的关系
以双尾金鱼不同品系鹤顶红、花琉金、红琉金、黑龙睛、红龙睛和红狮基
因组DNA为模板，通过Chd-F1/Chd-R1引物(表1)PCR扩增，割胶回收得
到的产物经连接、转化、检菌，上海生工生物有限公司测序，结果如图3所示。
双尾金鱼品系的ChordinA基因型均为：AACTCG369GGGAAAAAGT379AG，
为纯合基因型ChordinAG369/G369,T379/T379。与前述单尾鱼类ChordinA基因相比，
双尾型金鱼ChordinA基因的第369位置处的碱基发生了A→G的突变，第2
外显子的123氨基酸也因此发生了丝氨酸同义突变。同时，双尾型金鱼Chordin
A基因的第379位置处的碱基发生了G→T的突变，第2外显子的127氨基酸
位置则发生了终止突变，导致ChordinA基因只编码126个氨基酸就提前终止，
双尾型金鱼因此也只能产生仅含126个氨基酸的无活性的ChordinA蛋白。由
此可见，ChordinA基因123位置密码子的同义突变和127位置密码子的无义
突变决定了金鱼双尾型的产生。双尾型金鱼ChordinA基因序列如SEQID
NO.11所示，编码的ChordinA蛋白序列如SEQIDNO.12所示。
2.4单尾型与双尾型金鱼杂交后代尾型与ChordinA基因型的关系
以双尾型金鱼作为母本，四种单尾型鲤科鱼类(鲤鱼、草金、鲫鱼和团头
鲂)分别作为父本，它们F1代的表现型及ChordinA基因型如图2中A1、B1、
B2、C1、C2、D1所示。结果进一步表明，后代表现为单尾型还是双尾型取决
于ChordinA基因的2个特异性位点的突变。单尾鳍父本鲤鱼、鲫鱼和团头鲂
的ChordinA基因型均为纯合基因型ChordinAA369/A369,G379/G379，单尾鳍草金的
ChordinA基因型为杂合基因型ChordinAA369/A369,G379/T379，它们均能编码943个
氨基酸的ChordinA蛋白。而双尾金鱼母本基因型为ChordinAG369/G369,T379/T379，
仅能编码短的126个氨基酸。它们的杂交后代仅在ChordinAG369/G369,T379/T379纯
合，并编码短的126个氨基酸时，后代的尾鳍表现为双尾型，如图2中B1。
杂交F1代表现型为单尾的(图2中A1、B2、C1、C2、D1)，基因型表现出杂
合基因型ChordinAA369/G369,G379/T379，均能编码943个氨基酸的ChordinA蛋白，
所以仍表现为单尾型。
2.5ChordinA基因测序峰形图分析
ChordinA基因测序峰形图表明：在双尾鳍金鱼或杂交鱼后代表现型中，
测序后的碱基序列波峰整齐，无杂峰，基因型为纯合ChordinAG369/G369,T379/T379
(图4中a)；在单尾表现型中，则存在两种情况：一种表现为波峰整齐，无杂
峰，碱基基因型为单尾纯合基因型ChordinAA369/A369,G379/G379(图4中b)，另一
种表现为存在套峰，碱基基因型为单尾杂合型位点ChordinAA369/G369,G379/T379(图
4中c)。
2.6ChordinA基因测序结果的核酸序列比对分析
分别以提取的斑马鱼、金鱼、鲤鱼、草金、鲫鱼和团头鲂基因组DNA为
模板，通过Chd-F1和Chd-R1引物PCR扩增，扩增出的目的片段经割胶回收、
连接转化、检菌、测序后，得到6条目的片段序列，在BioEdit软件中进行序
列的比对，结果如图5所示。虚线为内含子区域，实线为ChordinA基因第2
个外显子区域，框内为ChordinA基因18bp的特异性突变序列，箭头为第369
位和第379位特异的碱基突变位点。
2.7整胚原位杂交结果比较
探针引物序列如表1所示，分别对单尾鳍胚胎(团头鲂、草金)和双尾鳍
胚胎(鹤顶红)进行整胚原位杂交的比较，不同探针在单、双尾鳍中的整胚原
位杂交结果不同，实验结果如图6所示。通过比较发现，ChordinAmRNA主
要在胚胎的尾部表达，单尾鳍胚胎(图6中S1、S2)中尾部表达的信号明显
强于双尾鳍胚胎(图6中T1)，这也证实了双尾金鱼ChordinAG369/G369,T379/T379
基因终止突变会导致ChordinAmRNA浓度的下降，仅能编码短的126个氨基
酸ChordinA蛋白，ChordinA蛋白失活有利于双尾鳍性状的形成。不仅如此，
由于ChordinA蛋白调控其它相关基因的表达，导致单、双尾鳍胚胎的MyoD、
MyoG、NtlmRNA在胚胎的背部脊椎部位表达产生显著差异(图6中S3-S6、
T2-T6)。在双尾鳍胚胎(图6中T3)中，还发现胚胎尾部骨骼有发生分叉的
趋势，这说明在胚胎发育的早期，单、双尾鳍的骨骼系统就已开始朝着不同的
方向发生改变。而Bmp4mRNA在单、双尾鳍胚胎的外胚层、中胚层中均有信
号的表达(图6中S7-S8、T7-T8)。整胚原位杂交实验表明，在单、双尾鳍胚
胎ChordinA蛋白的表达差异，会影响多种信号因子的表达，从而产生单尾型
或双尾型性状。
2.8ChordinA基因型指导双尾正品金鱼的选育
进一步开展了ChordinA基因型指导双尾正品金鱼的选育应用。在不同品
系金鱼子代中进行双尾型纯合ChordinAG369/G369,T379/T379后代筛选，6批次的结
果显示(表2)，基因型选育后的正品率均有大幅提高。
表2ChordinA基因型指导双尾正品金鱼的选育应用
3.结论
本发明采用分子生物学的方法针对ChordinA基因对不同品种的金鱼及金
鱼与鲤鱼、草金、鲫鱼、团头鲂之间的杂交后代进行了分子水平的检测与分析，
在这些不同鱼类的基因组DNA中都检测出了一条分子量大小约400bp左右的
目的条带，不仅证明了ChordinA基因的高保守性，同时测序结果比对分析还
证明了ChordinA基因的第2外显子区域含有2个特异碱基核苷酸突变位点决
定了金鱼的双尾型变异。在单尾鳍鱼中，ChordinA基因的第369位碱基是A，
第379位碱基是G，当第369位和第379位碱基分别突变为G和T时，金鱼
则表现为双尾型，双尾型金鱼的ChordinA基因仅编码一个缩短的126个氨基
酸的多肽，仅为野生型943个氨基酸的多肽的13％，因此双尾型金鱼的Chordin
A蛋白是处于失活状态的。进一步实验证明，表现型为双尾鳍的基因型为双位
纯合位点，即ChordinAG369/G369,T379/T379，而表现型为单尾鳍的基因型存在四种
基因型，即纯合ChordinAA369/A369,G379/G379、ChordinAG369/G369,G379/G379、单位点
杂合ChordinAA369/A369,G379/T379或双位点杂合ChordinAA369/G369,G379/T379。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通
技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些
改进和补充也应视为本发明的保护范围。