水解酶法测定不对称二甲基精氨酸及试剂盒技术领域
本发明涉及生物酶法测定不对称二甲基精氨酸(NG，NG’dimethyl-L-arginine，asymmetricdimethylarginine，ADMA)及试剂盒开发。特别地，本发明涉及利用二甲基精氨酸二甲氨基水解酶、鸟氨酸甲氨酰转移酶、氨甲酰激酶将ADMA转化为等物质量的氨，进而通过二乙酰一肟-氨基硫脲比色法或谷氨酸脱氢酶速率法测定氨的含量，推知血清中ADMA的浓度的方法和试剂盒。该发明为简便，准确，灵敏监测不对称二甲基精氨酸提供了重要依据。
背景技术
不对称二甲基精氨酸(aNG，NG’dimethyl-L-arginine，asymmetricdimethylarginine，，ADMA)，也叫非对称二甲基精氨酸，分子式见图1，由Vallance(VallanceP，LeoneA，CalverA，CollierJ，MoncadaS.Lancet339，572-575，1992)1992年首次在血浆和尿液中检测出ADMA。ADMA由含有精氨酸残基的蛋白质在蛋白质精氨酸甲基转移酶(proteinargininemethyltransferases，PRMT)的作用下甲基化，甲基化的蛋白水解后即可释放出ADMA。ADMA能竞争性抑制一氧化氮合酶(NOS)使一氧化氮(NO)生成减少，在体内起内源性NO合成抑制剂的作用。一氧化氮(N0)是血管衍生中的活性物质，具有舒张血管，维持血管张力恒定和调节血压的作用。体内多种因素可引起ADMA水平升高，ADMA的蓄积，导致血管内皮功能障碍。已有研究表明，血浆ADMA水平在心血管疾病出现临床表现之前就已经开始升高。因此，ADMA作为一种前瞻性，独立的心血管病诊断指标具有重大意义。ADMA水平的升高不仅能作为心血管疾病的先兆，还能作为动脉粥样硬化，心衰，高血压，糖尿病，肾衰肝脏衰竭，勃起功能障碍等疾病的一个重要危险因子。
目前，ADMA作为一种新型的内皮功能不全和心血管疾病标志物，引起了国际和国内的广泛重视。
体内90％ADMA的通过二甲基精酸二甲胺水解酶(dimethylargininedimethylaminohydrolase，DDAH)的分解，分解的产物为胍氨酸和二甲胺或单甲胺(Ogawa，T，andKimoto，M.andSasaoka，K.J.，BiolChem264：10205-9，1989；MacAllister，R.J.andParry，H.andKimoto，M.andOgawa，T.，etal.BrJPharmacol119：1533-40，1996)。
DDAH是一种存在于细胞质的胞内酶。本发明的生物酶法也借鉴了体内ADMA的清除模式，即ADMA在DDAH的水解下，分解为瓜氨酸和二甲胺，作为本试剂盒的第一步反应。
ADMA作为如此重要的一个心血管疾病的指示因子，尽快开发出关于ADMA的诊断试剂应用于临床，将造福整个社会。测定生物样品中ADMA浓度的方法，主要有以下几种，高效液相色谱法，液质联用法，酶联免疫法、化学发光法、胶乳增强法以及酶法。
相对来说，高效液相色谱法，液质联用法由于其操作复杂，仪器要求高，耗资耗时耗力不适合临床诊断使用。
德国DLDDiagnostikaGmbH公司(DLDDiagnostikaGmbH，Germany)采用竞争的酶联免疫法测定生物样品中的ADMA，已经将该试剂盒应用到临床。但是，该方法主要的技术瓶颈在于ADMA是一个单个氨基酸，目标分子量太小，不能构成一个抗原表位，也决定了通过常规的抗原抗体反应不能将其检测出来，必须对样品进行预处理，即乙酰化的前处理才能通过酶联免疫法检测出来，操作步骤复杂，不利于仪器自动化和标准化。另有专利US20090053741A和CN1656123A(W02003102031-A)并非利用常规免疫结合反应，而是利用一氧化氮合酶法的多肽片段和突变的DDAH酶达到特异性结合的目的，以上均是基于抗原和抗体的免疫学反应而建立的检测方法，目前为止并未有相应的产品问世。
化学发光和胶乳增强法依据的基本原理与酶联免疫法相同，也存在同样的技术瓶颈。最近，CN102328868A公布了一种胶乳增强免疫比浊法检测不对称二甲基精氨酸含量试剂盒。该方法通过将抗人ADMA单克隆抗体与交联有ADMA-人血清白蛋白复合体的胶乳颗粒悬浮液，和样品中的待检ADMA竞争结合，通过浊度的下降程度来检测样品中ADMA的含量。
酶法是针对底物的高效、特异、专一的反应，重复性好，敏感，易于实现自动化检测。已有的ADMA酶法(专利WO200046395A、WO2006030620A1(JP2006081481A)和CN102154444A)均采用了DDAH将ADMA分解为L-瓜氨酸和二甲胺。产物瓜氨酸和ATP、天冬氨酸在精氨酸琥珀酸合成酶作用下，生产AMP，AMP在AMP脱氨酶作用下生产IMP和氨，产物氨在脱氨基辅酶再通过辅酶合成酶的作用生产氧化型辅酶，通过检测辅酶浓度从而得出ADMA的浓度。以上方法均是基于精氨酸琥珀酸合成酶催化瓜氨酸生成AMP或者二甲胺在二甲胺单加氧酶作用下的辅酶法测定。后续反应都在3步或以上，所需酶的种类也在3种以上，如此多的反应过程增加了不确定性和，不容易实现仪器的自动化和标准化。国内专利CN102243227A采用DDAH将ADMA分解为L-瓜氨酸和二甲胺。产物瓜氨酸在瓜氨酸水解酶的作用下再进一步分解来测定，关键的是瓜氨酸水解酶来源途径不明，并不容易获得。所以，目前仍然没有关于ADMA酶法检测的成熟试剂盒问世。因此开发一种简便、快速、灵敏的酶法诊断试剂盒势在必行。
本发明采用的酶法特异性强，灵敏度高，重复性好。采用三步酶法反应，简便，易实现仪器自动化。经过实践证明，本发明中涉及的方法及试剂盒具有很好的研究价值和临床应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便、准确的酶法测定ADMA的方法。通过三个反应过程得出ADMA的浓度。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中样品经过三步反应，三种反应分别为：反应体系一为二甲基精氨酸二甲氨基水解酶最适反应体系，作用于ADMA生成二甲胺和L-瓜氨酸。反应体系二为包含鸟氨酸甲氨酰转移酶(omithinetranscarbamoylase，EC2.1.3.3)和氨甲酰激酶(carbamatekinase，EC2.7.2.2)的最适反应体系，作用于瓜氨酸生成L-鸟氨酸、氨和二氧化碳。反应体系三为包含水杨酸、亚硝基铁氰化钠和次氯酸钠的最适反应体系，作用于氨生成蓝绿色的靛酚蓝，通过着色深浅，比色定量氨。可选的，反应体系三也可为包含底物γ-酮戊二酸、NADPH和谷氨酸脱氢酶的最适反应体系。通过自动分析仪监测NADPH的下降速率，从而确定氨氨含量。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中二甲基精氨酸二甲氨基水解酶、鸟氨酸甲氨酰转移酶和氨甲酰激酶用量优选0.1-500kU/L；水杨酸溶液浓度优选0.2-5％；亚硝基铁氰化钠溶液浓度优选0.1-10％；次氯酸钠溶液浓度优选0.01-1mol/L；γ-酮戊二酸优选0.01-200mM；NADPH优选0.01-200mM；谷氨酸脱氢酶优选0.01-500mM.。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中测定氨浓度时采用二乙酰一肟-氨基硫脲比色法或谷氨酸脱氢酶速率法测定氨的含量。优选地，实验室研究选用二乙酰一肟-氨基硫脲比色法测定氨的含量，该方法稳定，对试验设备要求不高。最终测定是通过波长为697.5nm的光吸收值根据已经做好的标准曲线确定样品读数中的氨含量值。优选地，临床应用选用谷氨酸脱氢酶速率法测定氨的含量，该方法便于自动化，需要专门的生化分析仪配合。三种生化反应氨与ADMA都是等物质量的关系，氨含量即为ADMA含量，无须经过复杂换算，可以直接读出ADMA含量。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中样品来源于任何包含水的液态物质，优选地，样品为尿液或血液。
本发明的另一个目的在于提供一个检测ADMA的酶法诊断试剂盒。该试剂盒简便、灵敏度高、重复性好、具有很好的临床应用前景。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中试剂盒包含包含试剂R1，试剂R2，试剂R3，缓冲液，稳定剂，ADMA标准品的液体试剂盒或包含试剂R1，试剂R2，试剂R3，ADMA标准品的干粉试剂盒。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中试剂R1，R2，R3缓冲液是0.02-0.05MTRIS缓冲液、0.02-0.05M甘氨酸缓冲液或0.02-0.05M磷酸缓冲液，缓冲液的PH值为6.5-8.5。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中试剂R1为包含二甲基精氨酸二甲氨基水解酶最适反应体系的混合物；试剂R2为包含鸟氨酸甲氨酰转移酶(omithinetranscarbamoylase，EC2.1.3.3)和氨甲酰激酶(carbamatekinase，EC2.7.2.2)的最适反应体系的混合物；试剂R3为包含水杨酸、亚硝基铁氰化钠和次氯酸钠的最适反应体系或底物γ-酮戊二酸、NADPH和谷氨酸脱氢酶的最适反应体系的混合物。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中二甲基精氨酸二甲氨基水解酶、鸟氨酸甲氨酰转移酶和氨甲酰激酶用量优选2-20kU/L；水杨酸溶液浓度优选2-5％；亚硝基铁氰化钠溶液浓度优选0.2-1％；次氯酸钠溶液浓度优选0.04-0.10mol/L；γ-酮戊二酸优选0.1-20mM；NADPH优选0.1-20mM；谷氨酸脱氢酶优选0.1-200mM.。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中稳定剂是0.1-0.5％牛血清白蛋白，10-15％甘油，甘露醇，0.001-0.01％叠氮钠，0.5-2mMEDTA。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中所述的ADMA标准品为添加了ADMA纯品或NH4+纯品的人血清或其它类似血清基质的液体。优选地，选择添加了ADMA纯品的人血清或其它类似血清基质的液体。
根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中本试剂盒一方面能用于ADMA的检测，另一方面还能用于L-瓜氨酸的检测，还能用于氨的检测。
附图说明
图1：NG，NG’dimethyl-L-arginine，asymmetricdimethylarginine(ADMA)分子结构
图2：二乙酰一肟-氨基硫脲比色法(实施实例二)检测ADMA标准品标准曲线
图3：试剂盒灵敏度分析(实施实例三)
图4：二乙酰一肟-氨基硫脲比色法与高效液相色谱法测定人血清中ADMA方法相关性分析(实施实例五)(相关曲线见图4，可见二者拟合良好)
图5：谷氨酸脱氢酶速率法测定与高效液相色谱法测定人血清中ADMA方法相关性分析(实施实例六)(相关曲线见图5，可见二者拟合良好)
具体实施方式
实施实例一：试剂盒的组成
根据本发明的目的和原理组装了干粉单试剂、干粉双试剂、干粉三试剂、液体双试剂和液体三试剂五种类型的试剂盒，其中三试剂和双试剂的试剂盒都分别有两种，区别在于氨浓度测定时的两种方法，组成比色法或速率法测ADMA浓度试剂盒。
ADMA标准品：
稳定剂：20mMPH8.0的tris缓冲液；0.5％牛血清白蛋白；1mMEDTA；0.01％叠氮钠；10％甘油；
使用时，将ADMA标准品纯品加入稳定剂中，配置成0、0.5、1、2、3、4、5umol/L的ADMA标准品
1.本发明试剂盒的其中一个干粉单试剂配方，成分如下：
成分 含量
DDAH 10kU
鸟氨酸甲氨酰转移酶 10kU
氨甲酰激酶 10kU
牛血清白蛋白 5g
甘露醇 36.43g
使用时，加入50mM磷酸缓冲液(pH7.4)溶解至1L，配合现有氨测定试剂盒进行测定，进而推知样品中ADMA含量。
2.本发明试剂盒的其中一个干粉双试剂配方，成分如下：
干粉1成分 含量
DDAH 10kU
鸟氨酸甲氨酰转移酶 10kU
氨甲酰激酶 10kU
牛血清白蛋白 5g
甘露醇 36.43g
干粉2成分有两种组成，分别为
使用时，加入50mM磷酸缓冲液(pH7.4)溶解至1L，使用干粉2中组分进行下一步氨浓度测定，进而推知样品中ADMA含量。
3.本发明试剂盒的其中一个配方，成分如下：
使用时，加入50mM磷酸缓冲液(pH7.4)溶解至1L；
使用时，加入50mM磷酸缓冲液(pH7.4)溶解至1L，进行氨浓度测定。
4.本发明试剂盒的其中一个液体双试剂配方，成分如下：
试剂1成分 含量
DDAH 10Ku/L
鸟氨酸甲氨酰转移酶 10Ku/L
氨甲酰激酶 10Ku/L
牛血清白蛋白 5g/L
甘露醇 36.43g/L
磷酸缓冲液 50mM
使用时，直接将样品加入试剂1中反应即可，待反应30min后，将试剂1加入等量的试剂2中进行反应，通过血气分析仪或分光光度计可直接计算出氨的含量，进而推知ADMA含量。
5.本发明试剂盒的其中一个液体三试剂配方，成分如下：
使用时，直接将样品加入试剂1中反应即可，待反应30min后，将试剂1加入等量的试剂2中进行反应，通过血气分析仪或分光光度计可直接计算出氨的含量，进而推知ADMA含量。
实施实例二：二乙酰一肟-氨基硫脲比色法检测ADMA标准品标准曲线绘制
将校准品按照顺序进行R1、R2、R3反应，得到的结果依次为；
ADMA浓度(umol/L) 0 0.5 1 2 3 4 5
吸光值(A) 0.0943 0.129 0.154 0.233 0.297 0.357 0.42
标准曲线见图2.
实施实例三：试剂盒灵敏度分析
将BSA蛋白作为ADMA标准品的阴性对照，分别稀释成0、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2μM时，作为样品用液体三试剂试剂盒进行测定，检测得出ADMA含量。
由图3可以看出，该检测试剂盒灵敏度为0.1umol/L。
实施实例三：二乙酰一肟-氨基硫脲比色法试剂盒重复性分析
临床收集10个样本，用比色法液体三试剂试剂盒重复检测20次，求出均值，并算出变异系数。变异系数小于15％时，则说明试剂盒具有较好的重复性。
血清 均值(μM) 异系数
样品1 0.57 3.9％
样品2 0.66 5.1％
样品3 0.82 4.5％
样品4 0.96 6.0％
样品5 0.83 2.0％
样品6 1.32 4.7％
样品7 1.57 5.3％
样品8 1.86 6.2％
样品9 2.18 3.1％
样品10 3.59 5.8％
从图表数据可以看出，十个样品检测变异系数均小于15％，可以证明比色法试剂盒重复性良好。
实施实例四：谷氨酸脱氢酶速率法试剂盒重复性分析
临床收集10个样本，用速率法法液体三试剂试剂盒重复检测20次，求出均值，并算出变异系数。变异系数小于15％时，则说明试剂盒具有较好的重复性。
血清 均值(μM) 变异系数
样品1 0.52 3.2％
样品2 0.66 3.7％
样品3 0.83 3.0％
样品4 0.98 4.8％
样品5 0.72 6.5％
样品6 1.35 5.8％
样品7 1.59 7.6％
样品8 1.82 5.4％
样品9 2.16 4.2％
样品10 4.08 6.2％
从图表数据可以看出，十个样品检测变异系数均小于15％，可以证明比色法试剂盒重复性良好。
实施实例五：二乙酰一肟-氨基硫脲比色法与高效液相色谱法测定人血清中ADMA方法比较
根据现有文献报道高效液相色谱法测定ADMA与本试剂盒测定的ADMA结果分别如下表，二者相关性分析见图4：
比色法(μM) 高效液相色谱(μM) |
样品1 0.57 0.61
样品2 0.64 0.62
样品3 0.74 0.75
样品4 0.96 0.93
样品5 0.83 0.81
样品6 0.92 0.94
样品7 0.57 0.60
样品8 0.60 0.62
样品9 0.78 0.83
样品10 0.59 0.64
样品11 0.78 0.81
样品12 0.49 0.52
样品13 0.68 0.74
样品14 0.96 0.94
样品15 1.13 1.15
样品16 0.87 0.90
样品17 0.63 0.65
样品18 0.78 0.78
样品19 0.91 0.88
样品20 0.54 0.55
样品21 0.62 0.64
样品22 0.73 0.75
样品23 0.95 0.97
样品24 0.57 0.59
样品25 0.86 0.90
实施实例六：谷氨酸脱氢酶速率法测定与高效液相色谱法测定人血清中ADMA方法比较
根据现有文献报道高效液相色谱法测定ADMA与本试剂盒中方法测定的ADMA结果分别如下表，相关性分析见图5：
速率法 高效液相色谱 |
样品1 0.52 0.61
样品2 0.60 0.62
样品3 0.69 0.75
样品4 0.88 0.93
样品5 0.72 0.81
样品6 0.85 0.94
样品7 0.49 0.60
样品8 0.52 0.62
样品9 0.70 0.83
样品10 0.51 0.64
样品11 0.69 0.81
样品12 0.45 0.52
样品13 0.59 0.74
样品14 0.95 0.94
样品15 1.01 1.15
样品16 0.76 0.90
样品17 0.56 0.65
样品18 0.72 0.78
样品19 0.86 0.88
样品20 0.52 0.55
样品21 0.59 0.64
样品22 0.67 0.75
样品23 0.86 0.97
样品24 0.52 0.59
样品25 0.84 0.90