检测血液中微生物的方法技术领域
本发明涉及生物技术，具体微生检测方法，尤其涉及一种检测血液中微生物的方法。
背景技术
血培养是临床实验室重要的检测项目之一，由于菌血症、败血症的死亡率高达30-50％，因此，准确及时的培养结果对临床检测和治疗有重要意义。目前中国内血培养中细菌的阳性检出率仅为10％，其可能原因为：1、血液中的含菌量低；2、血液中的抗菌物质；3、抗生素的应用；4、培养条件的限制。目前市场上的血培养检测产品主要以CO2检测法为主，主要的测定技术有放射性标记技术、荧光检测技术和分光光度技术。因细菌在其生长代谢过程中会产生CO2，这些技术的原理都是通过检测血液样品在培养过程中中是否有CO2的产生来判定血液中是否有微生物。但这种基于细菌产生CO2的检测方法，会因为一些不能利用糖代谢的微生物(如非发酵菌)，其代谢过程不产生CO2或产生的CO2量极低，从而导致测定结果呈阴性。
2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)作为一种特殊的氧化还原指示剂，可以捕捉细胞或细菌呼吸过程中产生的电子，从无色的氧化型变成紫色的还原型，从而可以检测出血液中不产生CO2的微生物。用TTC作指示剂有阳性检出率高，检出时间短的优点，对于提高血培养技术有重要帮助。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于研究设计采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)作为一种特殊的氧化还原指示剂来检测血液中是否含有微生物，达到提高血培养技术的效果。
本发明提供一种检测血液中微生物的方法，该方法包括下列步骤：
(1)将2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)与血培养基加入血培养瓶，再加入35-40mL血培养基及2-4g树脂粒，所述2,3,5-三苯基氯化四氮唑在血培养基及树脂粒混合物中浓度为0.01-0.03g/mL；或
2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)混合到硅橡胶富氧膜中，制备成固体指示剂，并固定在血培养瓶底部，再加入35-40mL血培养基及2-4g树脂粒；所述2,3,5-三苯基氯化四氮唑在硅橡胶富氧膜中浓度为0.01-0.03g/mL；
(2)血培养瓶于121℃，灭菌20min；
(3)向血培养瓶中加入血液样品，在34-36℃条件下培养0-5天；
(4)检测血培养瓶中指示带的光反射强度，绘制光反射强度曲线，根据光反射强度曲线确定微生物生长结果。
本发明方法所述步骤(1)硅橡胶富氧膜为：25mL的聚二甲基硅氧烷、750μL正桂酸乙酯、100μL二月桂酸二丁基锡和1.25mL环己烷混合物。
所述步骤(1)TTC先用等质量的单蒸水溶解再应用。
所述步骤(1)血培养基35-40mL混合2-4g树脂粒；所述血培养基选自肉汤培养基、大豆酪蛋白培养基或胰酪胨大豆肉汤培养基，优选为35mL肉汤培养基；所述树脂粒为0.2-0.8mm粒径的阳离子交换树脂粒或非离子吸附树脂粒，所述阳离子交换树脂粒选自732阳离子交换树脂粒、强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、超强性苯乙烯系阳离子交换树脂、大孔强碱性季铵型阳离子交换树脂；非离子吸附树脂粒选自聚苯乙烯型吸附树脂或AmberliteXAD-4非离子型大孔树脂。
所述步骤(4)590nm/750nm双波长的光波为用于检测将2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)与血培养基及树脂粒加入血培养瓶中的培养样品；570-610nm光波波长用于检测将2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)混合到硅橡胶富氧膜制备成固体指示剂，并固定在血培养瓶底部，再加入血培养基及树脂粒的培养样品。
步骤(4)所述的指示带为：将2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)直接加入培养基的血培养瓶方法是指距离培养基表层2-3cm处的培养基；将2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)混合到硅橡胶富氧膜的血培养瓶是指培养瓶底部的硅橡胶富氧膜。
用本发明对105例临床样本进行的血培养实验结果表明，本发明的阳性检出率为20％。现有技术为检出率为5％。
本发明的有益效果：
(1)本发明创新的使用了TTC作为检测微生物的指示剂，其特点为TTC可以捕捉微量的微生物释放的电子被还原形，从而显示出颜色浓郁的紫色，使实验结果容易观察。
(2)本发明利用还原型TTC在波长为590nm处有强吸收峰的特点，选用570-610nm波长的光波作为检测波长，可以精确的判断血液中是否含有微生物。
(3)本发明在临床应用上具有成本低、操作流程简单、检测时间短、阳性检出率高等优点，有较大的应用价值。
附图说明
图1为实施例1的血培养检测结果，图中纵坐标为光放射强度转变的电信号，单位：mv。横坐标为时间，单位：min。图中纵坐标值1.1处直线为阈值。满足：(1)检测信号值大于阈值；(2)检测曲线出现“S”形曲线两个条件，即为阳性信号。图1说明检测结果为阳性，血培养瓶中有细菌生长，阳性检出时间为13小时左右。
图2为实施例2的血培养检测结果，图中纵坐标为光放射强度转变的电信号，单位：mv。横坐标为时间，单位：min。图中纵坐标值1.2处直线为阈值。满足：(1)检测信号值大于阈值；(2)检测曲线出现“S”形曲线两个条件，即为阳性信号。图2说明检测结果为阳性，血培养瓶中有细菌生长，阳性检出时间为13小时左右。
图3为实施例2的血培养检测结果，图中纵坐标为光放射强度转变的电信号，单位：mv。横坐标为时间，单位：min。图中纵坐标值1.2处直线为阈值。满足：(1)检测信号值大于阈值；(2)检测曲线出现“S”形曲线两个条件，即为阳性信号。图3说明检测结果为阳性，血培养瓶中有细菌生长，阳性检出时间为62小时左右。
具体实施方式
实施例1(本发明使用了TTC作为检测微生物的指示剂方法)
(1)取25mL的聚二甲基硅氧烷、750μL正桂酸乙酯、100μL二月桂酸二丁基锡、1.25mL环己烷和0.5g的TTC(TTC先用0.5g单蒸水溶解)于容器中混合均匀，并加入到血培养瓶底部，在35℃凝固，制备成硅橡胶富氧膜；
(2)向血培养瓶中加入40mL肉汤培养基和4g732阳离子交换树脂粒(国药集团生产)，并于121℃，灭菌20min；
(3)于上海市华东医院住院部采集有发热(≥38℃)或低温(≤36℃)，寒战，白细胞增多体征的患者的血液标本用于实验。向血培养瓶中加入10mL血液样品；
(4)将加入血液样品的血培养瓶置于美国BD公司BACTEC9050全自动血培养仪中35℃培养，并用590nm/750nm双波长光波检测血培养瓶底部硅橡胶富氧膜的光反射强度。
(5)培养13小时，检测信号显示光反射强度超过阈值，且光反射曲线有明显的“S”形曲线(如图1)，由此说明血培养瓶中有微生物生长。
实施例2(本发明使用了TTC作为检测微生物的指示剂方法)
(1)取35mL肉汤培养基、2gAmberliteXAD-4非离子型大孔树脂粒(罗门哈斯公司生产)和1.05gTTC(TTC先用1.05g的单蒸水溶解)于容器中混合均匀，加入到血培养瓶中并于121℃，灭菌20min；
(2)于上海市华东医院住院部采集有发热(≥38℃)或低温(≤36℃)，寒战，白细胞增多(细胞密度大于10.0×109个/L)体征的患者的血液标本用于实验。向血培养瓶中加入5mL血液样品；
(3)将加入血液样品的血培养瓶置于美国BD公司BACTEC9050全自动血培养仪中37℃培养，并于590nm/750nm波长光波监测距离培养基表层2-3cm处培养基。
(4)培养13左右，检测信号显示光反射强度超过阈值，且光反射曲线有明显的“S”形曲线(如图2)，此两项信号表明培养结果为阳性，由此说明血培养瓶中有微生物生长。
实施例3(比色法)
(1)取“珠海迪尔需氧血培养瓶(比色法)”进行试验。
(2)于上海市华东医院住院部采集有发热(≥38℃)或低温(≤36℃)，寒战，白细胞增多(计数大于10.0×109/L)体征的患者的血液标本用于实验。血液标本由临床微生物实验室技师采集临床病人血液样本。向血培养瓶中加入5mL血液样品；
(3)将加入血液样品的血培养瓶置于美国BD公司BACTEC9050全自动血培养仪中35℃培养，并用BACTEC9050全自动血培养仪配套检测设备检测；
(4)培养62小时，检测信号显示光反射强度超过阈值(如图3)，且光反射曲线有明显的“S”形曲线，此两项信号表明培养结果为阳性，由此说明血培养瓶中有微生物生长。
上述对比实验共选取105例来自于从上海市华东医院各科住院疑似病例患者采集的血液培养标本，血培养结果显示本发明的阳性检出时间为13小时，珠海迪尔血培养瓶的阳性检出时间为62小时；本发明检出21例阳性，阳性检出率为20％，珠海迪尔血培养瓶检出6阳性，阳性检出率为5％。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。