用于筛选评价血小板活化药物筛选模型和 血小板病诊断试剂和治疗药物的制备方法 本发明为一种筛选评价血小板活化药物筛选模型和血小板诊断试剂和治疗药物的制备方法。
血栓、冠心病和心肌梗塞等疾病成为发达国家死亡率最高病种，该类疾病与血小板聚集密切相关。血小板活化素是研究、诊断和治疗该类疾病重要工具，成为国际热点。现有的一些诱导剂仅能特异通过该试剂途径诱导聚集，如ADP(环氧化酶途径)、花生四稀酸AA(TXB2途径)、血小板活化因子PAF(磷酯酶相关途径)。其途径较为单一。
本发明的目的就是要提供一种多途径诱导血小板聚集的筛选评价血小板活化药物筛选模型和血小板诊断试剂和治疗药物的制备方法。
本发明的内容是这样的，一种用于筛选评价血小板活化药物筛选模型和血小板病诊断试剂和治疗药物的制备方法，其特征在于应用分子量为68000，由两种亚基组成，亚基分子量分别为12000和13000，等电点5.2,N末端为门冬氨酸(ASP)，无酶活性，由562个氨基酸残基组成的糖蛋白，部份结构为：
α链：DFDCIPGWSAYDRYCYQAFSEPKNWEDA
β链：GFCCPLGWSSYDEHCYQVFQQKMNWEDA
的烙铁头蛇毒血小板活化素TMVA。
其中烙铁头蛇毒血小板活化素TMVA的制备方法可用1，基因克隆方法，采用合成探针→在烙铁头cDNA库中调基因→测序→转入大肠杆菌、酵母菌或其它真核细胞中表达→复活→测序→测活性→纯化冻干封安瓿。
或用2，柱沉析分离纯化法，采用粗毒→去杂质(800转/分钟离心)→DEAE-A50柱层析→收集相关峰合并→低温浓缩→Sepeadex-G100凝胶过滤→冰冻干燥→Resouce离子交换层析→冻干封安瓿。
本发明的效果是这样的，由于该方法为应用烙铁头蛇毒血小板活化素-TMVA，即可通过环氧化酶途径、TXB2途径诱导血小板聚集，在上述途径阻断后又可通过PAF相似途径诱导血小板聚集，是多途径聚集诱导剂，能测定各条不同途径功能。综合评价筛选各条途径抑制药物。体内注射30分钟后可将血小板数降至原有20％以下，呈量效关系，24小时内各条活化途径功能丧失，但不破坏血小板，仅将其扣留在血小板池、大网膜和血管壁上，8小时开始恢复，24小时接近正常，这样能使体内不再形成栓塞，优于国内外现有的一切抑制血小板功能药物。数据如下：
1、TMVA用于冠心病：诊断血小板功能活性82例，结果表明急性心肌梗塞型21例，在发病时，TMVA诱导的血小板聚集％显著高于其它非心肌梗塞型患者(包括心绞痛型、心律紊乱、肺心病、高脂血病等)，两者相比p＜0.01，进一步研究TMVA可能在冠心病动态监护及急性心肌梗塞的诊断方面发挥重要作用，而优于ADP。心绞痛患者12例研究结果表明，在发病时TMVA诱导聚集明显增高，发病后降低。10例肺心病和其它高血脂、高血压、心律紊乱等患者43例，血小板功能正常或大部偏低。在与ADP、AA、肾上腺素等比较中TMVA很少受药物干扰，能较好反应血小板真正功能，提供诊断和治疗数据。
2、13例风湿心脏病研究结果发现，血小板计数正常，但TMVA诱导的聚集功能显著增高，13例风湿患者血小板计数高于风心病，但聚集率均低于正常，进一步研究有可能在风心病病因研究方面具有一定份值。
3、连续观察到几例患者在病情缓解和恶化时期血小板功能不同，TMVA突然增高或降低，与病情恶化密切相关，如病情逐步缓解，血小板功能亦稳定恢复正常，进一步证明这一结果将可能使TMVA在评价白血病病程和疗效中起到重要作用。 白血病血小板功能测定 项目病种血小板计数(万/MM3)PRP计数万/MM3 血小板聚集率％肾例数ADP TMV肾上腺素花生四烯酸瑞士托霉素急性单抗细照白血病 8.9 18.5 0 0 0 0 0 4红细胞白血病 10.5 19.5 21 21 12 29.5 0 2网状内皮细胞白血病 9.8 23 61 41 31 9 1慢性糖细胞白血病 32.5 36.8 40.2 60 40.6 13 56.1 9亚急性糖细胞白血病 10.1 16.9 15.4 16 11 9 14 5急性糖细胞白血病 8.2 12.9 25 37.8 21.9 26.5 32 18
4、肿瘤患者血小板：我们测定36例各种肿瘤病人血小板功能，结果表明肿瘤转移与血小板密切相关，这点与国外在动物和临床中报导是相同的，进一步研究可能对该类患者合理治疗有较大意义。 项目病种血小板计数(万/MM3)PRP计数万/MM3病例 血小板聚集率％ADP TMVA肾上腺素花生四烯酸瑞士托霉素胃癌20.323.6 3 60 70.5 64.3 54.6膀胱癌16.427.5 3 59.5 76.6 80.2 64.8多发骨髓癌23.622.3 4 36.7 47.2 38.7 47.5 53.2淋巴肉癌14.222.1 2 22 46 33 49.5肝癌转移前13.822.8 5 40.7 7.2 74.3 78.6肝癌伴腹水7.816.1 6 17.3 39.8 29.2 44肺癌15.25.3 11 57.5 54.9 58.6 33 65.8
5、TMVA在血小板功能缺陷性疾病和出血性病人应用：我们测定60例各种血小板功能缺陷性疾病患者和出血病人，结果证明TMVA与其它进口ADP、瑞士抗霉素等同样可以用于该类病人诊断，同时应用不同诱导途径血小板聚集剂有可能对该类患者鉴别诊断和治疗具有一定意义。 项目病种血小板计数(万/MM3)PRP计数万/MM3 病 例 血小板聚集率％ ADP TMVA肾上腺器花生四烯酸瑞士托霉素上消化道出血11.2 18.9 5 39 53.45.8 6 60出血原因不明12.4 233 25 68 76.3 773 73.3血管性假有病13.8 21.5 4 56.2 64.7 44 0血小权无力症9.5 19.5 5 0 0 0 0.65过敏性血小板减少紫斑13.5 26.2 4 56.7 77.3 68 43.1原发性血小板增多2.8 25 1 0 6 0 0 35.5原发性血小板减少6.5 14.3 4 34.5 37.2 29.5
实施例：一种用于筛选评价血小板活化药物筛选模型和血小板病诊断试剂和治疗药物的制备方法，其特征在于应用分子量为68000，由两种亚基组成，亚基分子量分别为12000和13000，等电点5.2，N末端为门冬氨酸(ASP)，无酶活性，由562个氨基酸残基组成的糖蛋白，部份结构为：
α链：DFDCIPGWSAYDRYCYQAFSEPKNWEDA
β链：GFCCPLGWSSYDEHCYQVFQQKMNWEDA
的烙铁头蛇毒血小板活化素TMVA。