核酸回收芯片和核酸回收装置 【技术领域】
本发明申请涉及边对细胞进行培养边进行观察，当细胞成为特定的状态后选择性地分离、回收细胞中的特定区域的核酸成分的核酸回收芯片和核酸回收装置。
背景技术
近年来，用于对于作为生物体关联试料的DNA或核酸、以及蛋白质的高效且高精度地分离、分析的方法、设备的开发在高速发展。
例如，众所周知的DNA芯片是利用微图案化技术和DNA的互补性，检测特定的碱基序列的方法。该方法是在基板上预先将具有各种序列的寡核苷酸在阵列上形成图案，检测DNA试料在基板上的结合位置，解析试料中的DNA具有的序列。此外，众所周知PCR反应由DNA两根链的解离(95℃、30秒钟)、与寡核苷酸的退火(37℃、20秒钟)、DNA聚合酶引起的互补链合成(72℃、2分钟)三反应的重复构成，是将微量的DNA片段扩增数十万倍的技术。另一方面，作为在流体中的局部区域产生温度上升的技术，包括使用光的方法。对于通过用激光捕获具有光吸收的微粒，在微粒周边μm级的微小区域中产生局部的温度上升，将蛋白质亚基结合体切断的技术，鹫津在静电学会讲演论文集(1994年)111页到114页中予以报告。此外，本申请的发明者先前作为特原平10-163214，提出了将各个不同的核酸探针固定到基板上的多个区域中，使试料DNA中的互补链DNA与其结合后，通过集束光的热局部地使互补链DNA解离、回收的装置和方法。
另一方面，尚无边对培养细胞的溶液环境和细胞间的物理接触进行控制边进行培养的公知例。因此，作为特原2000-356827，本发明者们解决了这些问题，新发明如下技术并申请专利：只选择特定的一细胞，以该一细胞为细胞株进行培养的技术；和观察细胞时对细胞的溶液环境条件进行控制并且将容器中的细胞浓度控制为一定的技术；或者边使相互作用的细胞特定化边培养观察的技术。
但是，在以往的采用DNA芯片进行的基因解析技术中，置于重点的是通过使基板上形成的20碱基左右的底物和试料中的DNA/RNA的一根链互补地结合而进行捕获、观察，实际情况是对于特定的细胞状态(细胞周期内的特定的周期)中mRNA的细胞内分布和组织中各细胞单位中的细胞内的核酸成分的分析技术尚未考虑。此外，这对于以往的各种生物体关联试料的分离、分析方法(装置)是同样的。
为了对于生命体的构成或其活动等进行解析，如上所述，欠缺对在特定的细胞状态下特定区域的核酸成分的分离、分析，对于用于其的方法的研究也几乎没有进展。
因此，本发明申请为了弄清特定状态下的细胞内的核酸成分的分布或组织细胞集团中的各细胞内的核酸成分的分布，以提供新型技术手段为课题，该技术手段可以选择性地将特定的细胞状态的各细胞的特定区域的核酸成分分离、回收。
【发明内容】
作为解决上述课题的发明，本发明申请第1提供核酸回收芯片，该细胞中的核酸回收芯片在透明基板上配置导电性区域，在该区域上配设核酸结合部和细胞收容容器部，其特征在于：具备向所述的导电性区域外加电位的装置和在细胞收容容器中培养细胞的装置，并且所述的导电性区域对于特定波长的光具有吸收，通过照射该特定波长的光而局部发热，将在导电性区域上结合的核酸成分局部地解离、回收。
本发明申请第2提供核酸回收芯片，其特征在于：作为向导电性区域外加电位的装置，具有与导电性区域相对配置的上部导电性部。第3提供核酸回收芯片，其特征在于：作为在细胞收容容器部中培养细胞的装置，具有内包细胞收容容器部，使细胞培养液可以流通的箱体容器部。第4提供权利要求1～3的任一项所述的核酸回收芯片，其特征在于：配设1个以上收容一细胞的细胞收容容器部。
此外，本发明申请第5提供核酸回收装置，其具备上述任一项所述的核酸回收芯片，其特征在于：具有向核酸回收芯片的导电性区域照射特定波长的光而使其局部地加热的光学系统；同时具有向该区域外加电位的电源系统。第6提供核酸回收装置，其特征在于：具有观察细胞状态的观察系统。第7提供核酸回收装置，其特征在于：具有细胞的培养液的流通系统。
【附图说明】
图1为表示本发明申请的核酸回收芯片的基本构成的一例的实施例的模式图。
图2为表示使用本发明申请的核酸回收芯片的细胞中核酸回收顺序的模式图。
图3为表示使用本发明申请的核酸回收芯片的光学系统和溶液送液系统的1实施例的模式图。
图中的符号表示如下内容。
100：核酸回收芯片
101：光学上透明的基板
102：具有光学吸收的薄膜层
103：光学上透明，对细胞等不具有毒性的物质的壁
104：细胞等试料
105：细胞容器
106：光学上透明的容器
107、108：管
109：具有导电性的层
110：隧道
111：电源单元(power source module)
112、207、305：物镜
113：核酸探针
201：基板表面
202：核酸探针
203：细胞
204：蛋白质
205：核酸探针
206、209：核酸
208：局部加热区域
301：光源
302、309、312：滤光器
303：聚光透镜
304：具有温度调节功能的平台
306：可动分色镜
308：光源
310：分色镜(dichroic mirror)
311：镜
313：照相机
315：平台移动用马达
316：溶液槽
317：供给装置
318：具有PCR反应功能的分配器
319：毛细管电泳装置
320：废液滞留部
【具体实施方式】
本发明申请具有如上所述的特征，以下对其实施方式进行说明。
首先，使用图1的实施例对本发明申请的核酸回收芯片的基本构成的一例进行说明。在核酸回收芯片100中，在滑动玻璃等光学上透明的基板101上配置铬的蒸镀层等具有光学吸收的薄膜层102。当用透过光进行观察时，优选薄膜层102的膜厚为不完全吸收光的程度，并且薄到无班驳的程度。例如，当为铬时，如果以膜厚50蒸镀，为可见光范围的透过光70％左右，不妨碍在本发明的用途中使用。此外，可以使用Ti、V、Fe、Co、Ni、Mo、W的任一种金属。这些金属通过金属层表面上产生的氧化物层与硅烷醇基共价键结合，可以将核酸探针层113固定在基板表面上。在吸光薄膜层102上层叠用于培养细胞104的容器的壁103。容器的大小和配置根据细胞的种类适当选择，例如，为神经细胞时，优选为宽50μm左右以上。此外，细胞不能在各容器间移动，但可以空出经路110以使轴突等能与其他细胞接合。此外，容器的壁103的高度必须具有细胞不可逾越程度的高度。例如为神经细胞时，可以为高20μm左右以上。特别是当容器的壁103的材料使用琼脂糖时，由于不存在与细胞的粘接性而且不是对细胞的信号物质，因此不仅对于细胞而言无害，而且对培养实验数据的影响小，因此最合适。在培养细胞104时，当必须进行培养液的循环时，可以用将包含容器的壁103的细胞培养区域全部覆盖的结构的光学透明容器106罩上，从管107导入溶液，从管108回收废液。此时，为了与成为电极的区域102相对，在容器106内上面附加具有导电性的区域109。该区域109的厚度薄到与区域102同样地具有光透过性，进行蒸镀。这里，可以使用物镜112对容器105内的细胞的样子进行连续观察。此外，通过物镜向基板表面照射近红外光的集束光，可以局部地进行加热，选择性地使与上述核酸探针层113结合的核酸成分热变性，进行回收。可以使用电源单元111对区域102和区域109之间外加电场。此外，在该实施例中，区域102以1片电极构成，但可以使用与各细胞容器独立运作的多个的电极阵列。
图2为表示使用了本发明申请的核酸回收芯片的细胞中的核酸回收顺序的模式图。图2(1)为表示导入细胞前的基板表面的状态的模式图。为了捕获核酸成分，将核酸探针202固定在基板表面201上。这里，作为核酸探针202，为了选择性地回收mRNA，可以用以poly-T为中心的序列构成，当要回收特定的核酸成分时，可以用与特定的核酸成分互补的序列构成，或者将多个不同序列的核酸探针混合，使它们成为序列。图2(2)为表示细胞203配置在上述基板表面201上的样子的模式图。当边对细胞203的状态进行显微镜观察边成为特定的细胞状态时，可以用通过显微镜物镜而照射的红外线集束光将细胞破碎，当各细胞培养容器的电极独立时，可以通过在电极上外加直流或交流的电场而将细胞破碎。或者当一起将全部的容器的细胞破碎时，可以通过导入表面活性剂等药剂而将细胞破碎。图2(3)为表示细胞破碎后细胞内蛋白质和核酸成分的分离顺序的模式图。通过在基板表面201和对电极之间外加直流电场，将蛋白质成分和核酸成分分离。由于在蛋白质和核酸成分中等电点有很大差异，因此可以只将核酸成分吸引到基板表面201上，使蛋白质成分204从基板表面游离，流入溶液而排除。此外，可以以2维投影的形式将细胞中的核酸成分固定到基板表面201上。图2(4)表示然后外加与先前反向的直流电场，可以将没有与基板表面的核酸探针205结合的核酸成分206除去。图2(5)为表示然后通过集束光加热使与核酸探针结合的细胞内核酸成分局部地解离而进行回收的顺序的模式图。由于只有与通过物镜207照射的集束光加热的区域208的核酸探针结合的核酸试料209选择性地解离到溶液中，因此通过回收含有该区域解离的核酸成分的溶液，可以将细胞内的特定区域的核酸成分选择性回收。
图3模式地表示作为使用本发明申请的核酸回收芯片的光学系统和溶液送液系统的1实施例的装置构成。在该装置中，为了边用核酸回收芯片100培养细胞等试料边对其状态变化进行观察，具有显微镜观察系统、培养液循环系统以及用于同时将核酸回收芯片100上的核酸选择性回收的集束光照射系统。由图3可以看到，在显微观察光学系统的光路上配置核酸回收芯片100，供给溶液的培养液供给-废弃部与该核酸回收芯片100连接。首先，显微观察光学系统具有如下的构成。用滤光器302将从光源301照射的光调整为特定的波长，通过集光透镜303集光，照射到核酸回收芯片100上。照射的光作为透过光用于用物镜305进行的观察。核酸回收芯片100内部的透过光像被镜311反射而通过滤光器312后，诱导到照相机313，在照相机的受光面上成像。因此，核酸回收芯片100的材料相对于滤光器302所选择的波长的光，优选为光学上透明的材料。具体地说，使用硼硅酸玻璃、石英玻璃等玻璃，聚苯乙烯等树脂或塑料，或硅基板等固体基板和琼脂糖等高分子。此外，特别是当使用硅基板时，优选将波长900nm以上波长的光用于观测。此外，如在图1的吸光层102中叙述的那样，优选选择性使用光吸收在上述特定的波长中不足80％的膜厚或不具吸收的波长。
此外，从光源308照射的光也在滤光器309处进行波长选择，然后通过分色镜310诱导到物镜305上，作为核酸回收芯片100内部的荧光观察的激发光使用。从核酸回收芯片100发出的荧光再次被物镜305集光，用照相机313只能观察到用滤光器312切割激发光后的荧光和透过光。此时，通过调整滤光器302、309、312的组合，可以用照相机313只观察透过光，或者只观察荧光，或者同时观察透过光像和荧光像。在光路内还具有通过可动分色镜306将激光光源307产生的激光导入物镜305中的机构。该激光通过物镜305成为集束光，可以对核酸回收芯片100进行局部加热。当使集光点移动时，通过使可动分色镜移动，可以使核酸回收芯片100内的激光的集束位置变动。作为该激光的波长，优选不具有水的吸收，不具有光化学作用的波长。如果为例如Nd:YAG激光的1064nm等时，对于水、玻璃、琼脂糖等无显著的吸收，选择性地只在铬薄膜层产生激光吸收，只在吸收了光的铬薄膜层的光集束点附近局部地发热。
用照相机获得的图像数据通过图像处理解析装置314解析，以各种解析结果为基础，可以对在X-Y方向自由移动的平台移动用马达315进行驱动以对可动分色镜306或载置核酸回收芯片100的具有温度调节功能的可动XY平台304的位置进行控制。这样，可以对细胞的形状进行认识，或在认识后对该细胞进行追踪，或者长时间使其位于图像的中心，或者通过对与物镜的距离进行调节使图像的焦点(ピント)与特定的细胞重合。或者，以一定时间的周期对可动分色镜306、或载置核酸回收芯片100的带有温度调节功能的平台304进行控制，或者以一定间隔驱动平台移动用马达315。
以下对培养液供给-废弃部进行说明。根据细胞的状态从溶液槽316通过供给装置317向核酸回收芯片100供给多种、浓度不同的培养液或细胞破碎用试剂等的培养液，通过供给装置内的温度调节机构对液温进行调节，此外通过溶存空气交换机构调整溶存气体的成分，边调节流速边将培养液等试剂供给到核酸回收芯片100中。容器100的培养液还可以使用具有PCR反应功能的分配器318，在PCR反应扩增后导入毛细管电泳装置319中，调整从核酸回收芯片100供给的试料核酸的序列，或者将废液置于废液滞留部320。
当然，本发明申请并不限于以上的例示，在其构成的细节可以有各种各样的实施方式。
如上所述，根据本发明申请，可以对培养的细胞在特定状态下的核酸成分的空间分布进行解析。