重组幽门螺杆菌外膜蛋白25 【技术领域】
本发明涉及一种重组幽门螺杆菌外膜蛋白25。
背景技术
目前人们已经知道，人体内胃粘膜中存在的螺形菌是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)，且慢性幽门螺杆菌感染是人类最常见的慢性细菌感染之一。这种感染不可避免地导致人类细菌性胃炎(B型胃炎)的诱发。幽门螺杆菌在胃溃疡和十二指肠溃疡以及某些形式的胃癌(腺癌)的发展中起诱因作用(Lee等，1993；Solnick和Tompkins，1993)。更少见被视为免疫系统B细胞瘤的先兆的胃MALT(粘膜相关淋巴组织)淋巴瘤大概也是幽门螺杆菌感染的结果。
长期受幽门螺杆菌感染的一个后果是萎缩性胃炎，粘性、产酸或产胃蛋白酶的胃上皮细胞变性，与胃腺癌、胃粘膜相关性淋巴样组织(MALT)恶性淋巴瘤的发生亦密切相关，被视为癌前期损害。胃癌中约有60％大概是幽门螺杆菌感染的结果。
细菌从口摄入后，首先到达极酸的胃腔(pH1-2)中。在此，通过产生脲酶这种酶使细菌可能存活，所述脲酶造成已有脲的分解，从而引起胃中酸性pH值的局部中和。借助趋化定向和依赖于鞭毛的游动性，微生物再移动到胃窦区的碳酸氢盐缓冲的粘膜层，由于酸性屏障作用，只有几种竞争性细菌能进入该生态环境。为到达上皮，微生物大概借助于腔(pH1-2)和上皮细胞表面(Ph6-7)之间的pH梯度进行自身定向。
既然已经发现胃十二指肠溃疡是传染病，治疗目的之一就是用抗生素消除病原体。然而，用各种抗生素(阿莫西林、硝基呋喃、furazolidin红霉素a.o)进行单独治疗已被证实并不令人满意，因为甚至在这种情况下仅有0-15％病例会根除细菌。目前，把酸阻断剂(Ompeprazol)和抗生素(阿莫西林)结合使用达到最成功地治疗效果，这种疗法使清除率达80％(Malfertheiner，1994)。用抗生素治疗消除幽门螺杆菌并不是有前途的长期治疗方案，因为细菌会迅速产生对抗生素的耐性。
受幽门螺杆菌感染会导致胃粘膜的慢性炎症反应(胃炎)。另外，诱发对幽门螺杆菌抗原的特异性全身免疫反应；不过，分泌性抗体(sIgA)在胃中的形成尚未得到无可争议的阐述。发炎的结果是在胃粘膜和亚粘膜中存在多种免疫细胞，例如多形核白细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞(Blaser，1992)。此外，幽门螺杆菌在体外激活嗜中性白细胞、单核细胞和巨噬细胞(Mai等，1991)。用特异性抗体和补体进行的实验表明，在体外嗜中性白细胞使幽门螺杆菌迅速失活。
【发明内容】
本发明的目的就是针对上述现有技术的不足之处，提供一种运用PCR技术克隆幽门螺杆菌基因，构建载体对其进行序列分析和蛋白表达分析，进一步通过粘膜治药免疫防治幽门螺杆菌。
本发明的目的是这样实现的：DNA分子，其特征在于，它包括：(a)序列号1中所示的核苷酸序列，(b)在遗传密码简并性的范围内与(a)中序列相应的核苷酸序列，或，(c)在严格条件下与(a)或/和(b)的序列杂交的核苷酸序列；和(a)载体含有DNA分子的至少一个拷贝，(b)细胞被载体所转化；及(a)序列号1所示的核苷酸序列，或，(a)中序列发生免疫交叉反应的核苷酸序列。
除了序列号1所示核苷酸序列和在遗传密码简并性范围内与该序列相应的核苷酸序列之外，本发明还包括在严格条件下与这些序列之一杂交的DNA序列。本发明包括在些洗涤条件下与序列号1所示核苷酸序列之一杂交或与在遗传密码简并性范围内的相应核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
本发明的DNA分子最好编码能粘附到人细胞上、特别是人胃上皮细胞上的多肽。此外，本发明的DNA分子最好在核苷酸水平上与序列号1所示核苷酸序列有至少70％、特别优选至少90％的同源性。而且，该DNA分子的长度最好至少为45个核苷酸，优选至少50个核苷酸。
本发明的又一个目的是含本发明DNA分子的至少一个拷贝的载体。该载体可以是最好在表达信号(启动子、操纵基因、增强子等)控制下本发明DNA分子位于其上的任何原核或真核载体。原核体的例子有象噬菌体(例如λ噬菌体)这样的染色体载体以及象质粒这样的染色体外载体，而环状质粒载体是特别优选的。
本发明的载体也可以是真核载体例如酵母载体或者是适于高等细胞的载体(例如，质粒载体、病毒载体、植物载体)。
本发明的又一目的是用本发明载体转化的细胞。在一优选实施方案中，该细胞是原核细胞、优选革兰氏阴性的原核细胞、特别优选大肠杆菌细胞。不过，另一方面，本发明的细胞也可以是真核细胞，例如真菌细胞(如酵母)、动物或植物细胞。
本发明还涉及由本发明DNA分子编码的多肽。该多肽包括(a)序列号1所示氨基酸序列，或(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的氨基酸序列。
本发明的多肽最好与序列号1所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
本发明的多肽最好通过下述方法生产：用本发明的DNA分子或载体转化一种细胞，在多肽能得以表达的条件下培养转化的细胞，从细胞或/和培养物上清液中分离多肽。该方法中可获得融合多肽以及非融合多肽形式的本发明多肽。
本发明的多肽也可用作免疫原来产生抗体。因此，本发明还涉及抗本发明多肽的抗体。
本发明另一方面涉及一种药用组合物，它包含作为活性物质的本发明的DNA分子、本发明的多肽或本发明的抗体，选择性地含有常见药用辅助物质、稀释剂、添加剂和载体。
一方面，本发明的药用组合物可用于诊断幽门螺杆菌感染。
另一方面，该药用组合物也可用于防止或治疗幽门螺杆菌感染。对治疗应用而言，将多肽或其片断用于产生主动疫苗，或将抗体用于产生被动疫苗。
本发明具有运用PCR技术克隆幽门螺杆菌外膜蛋白25粘膜基因，并构建载体对其进行序列分析和蛋白表达分析，提高抗血清可阻止幽门螺杆菌粘附于胃粘膜上皮细胞和提高免疫原性及活性高等优点。
从Hp阳性及阴性病人外周血中分离淋巴细胞，与重组OMP25共孵育后发现，该蛋白仅能刺激阳性病人的外周血T细胞增殖，而不能刺激阴性病人T细胞增殖，说明是幽门螺杆菌特异蛋白。
但体外试验也证实该蛋白具有弱的诱导Th2细胞表型的作用。
应用OMP25 50ng/鼠加免疫佐剂霍乱毒素10ng，隔日一次共三次口服免疫小鼠，三周后应用幽门螺杆菌感染小鼠，继之二周后处死动物观察。发现可完全预防60％的小鼠感染幽门螺杆菌，而且与对照相比，可降低另外40％小鼠的细菌定植量，保护率可达100％。重组OMP25与免疫小鼠脾细胞共孵育后，发现可刺激后者增殖10倍以上，说明能产生强烈的细胞免疫。
用同样方法经肛免疫小鼠也可取得100％的保护率，具有最高的保护率和完全保护率。
【附图说明】
图1是序列表。
【具体实施方式】
下面将结合附图和实施例对本发明的作进一步的详述：如图所示，DNA分子，其特征在于，它包括：(a)序列号1中所示的核苷酸序列，(b)在遗传密码简并性的范围内与(a)中序列相应的核苷酸序列，或，(c)在严格条件下与(a)或/和(b)的序列杂交的核苷酸序列；在核酸水平上它与序列号1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性；它的长度至少为45个核苷酸；(a)载体含有DNA分子的至少一个拷贝，(b)细胞被载体所转化；多肽，它由DNA分子所编码，它包括：(a)序列号1所示的核苷酸序列，或，(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的核苷酸序列。产生多肽的方法，载体转化一种细胞，在多肽得以表达的条件下培养转化的细胞，并从细胞或/和培养物上清液中分离出多肽。多肽作为免疫原产生抗体的应用和多肽的抗体。药用组合物，(a)它包含作为活性物质的DNA分子、多肽或者抗体，选择性地包含常见药用辅助物质、稀释剂、添加剂和载体，(b)药用组合物用来诊断幽门螺杆菌感染的应用，(c)药用组合物用于生产防止或治疗幽门螺杆菌感染用的药剂的应用。
利用基因克隆技术对外膜蛋白25的基因进行了克隆和表达并研究了其免疫防治作用。
1材料与方法
1.1质粒和菌株
菌株BL21(DE3)、质粒pET-22b(+)和幽门螺杆菌SS1为第一军医大学南方医院消化研究所保存。
1.2工具酶及试剂
限制性内切酶NotI、NcoI及T4DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶购自NewEngland Biolabs公司，Taq DNA聚合酶、DNA分子量标准λDNA/EcoR I+Hind III购自华美生物工程公司，琼脂糖、dNTPs、DNA快速纯化试剂盒购自Promega公司，测序质粒纯化试剂盒购自美国Qiagen公司，其它试剂为国产分析纯。
1.3Hp染色体DNA的提取
从固体培养基上刮取生长良好的Hp菌落，按基因组DNA小量制备法制备，详见参考文献[1]。
1.4质粒的提取及纯化
质粒的快速抽提及大量制备均采用碱变性法，详见参考文献[2]。
1.5目的基因的PCR扩增
设计引物，在其5′端加上合适的限制性酶切位点，由博亚公司合成。序列如下：
外膜蛋白251：5′-TG GCC ATG GAT TTG CAA AAC TTT GTT TTT-3′
NcoI
外膜蛋白252：5′-AG TGC GGC CGC TCA AAA GCC TAT G-3′
NotI
热启动法进行PCR，95℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环后再延伸10min。0.8％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。
1.6DNA片段的酶切、连接、转化和阳性克隆的鉴定
质粒和目的基因DNA经NotI和NcoI双酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4连接酶作用下16℃连接12h，转化宿主菌BL21(DE3)，双酶切鉴定筛选出阳性克隆。
1.7序列测定及分析
碱裂解法大量抽提经双酶切鉴定的重组克隆质粒，用自动测序仪进行序列分析。
1.8诱导表达和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
外膜蛋白25阳性克隆经IPTG诱导表达后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.9动物实验
对已经感染幽门螺杆菌的小鼠通过黏膜途径给予外膜蛋白25，观察治疗作用。对未感染幽门螺杆菌的小鼠先通过黏膜途径给予外膜蛋白25，然后再用幽门螺杆菌进行攻击，观察保护作用。
2结果
2.1外膜蛋白25基因的扩增
PCR结果电泳分析发现在2100bp左右有一条带，大小与预计相符。
2.2重组质粒的构建及酶切鉴定
将PCR产物经NotI和NcoI双酶切后，定向插入经同样双酶切的pET-22b(+)载体中，获得重组质粒命名为pET-22b(+)/外膜蛋白25。经NotI和NcoI双酶切后的重组质粒电泳结果与预计相符。
2.3外膜蛋白25基因片段的序列分析
直接以重组质粒pET-22b(+)/外膜蛋白25为模板进行测序，得到了克隆片段的DNA序列，自动测序仪序列分析结果见后。
2.4外膜蛋白25基因在大肠杆菌中的表达
外膜蛋白25阳性克隆株在LB培养液(含100ug/ml氨苄青霉素)中37℃过夜培养，然后按1％转接至含氨苄青霉素的LB培养液中，继续培养至D值为0.6～0.8，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，诱导表达3h，离心收集菌体，取其周质的渗透休克液、菌体超声后的上清以及沉淀进行10％SDS-PAGE电泳分析。结果发现，经诱导后表达相对分子量为76×103的蛋白，与预期分子量大小一致。
2.5动物实验
外膜蛋白25的治疗和保护有效率均为100％。
参考文献
[1]Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloning：a laboratory manua1.2nded.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.35。
[2]Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，et al.颜子颖，王海林译。精编分子生物学指南。北京：科学出版社，1998.39。