右旋糖酐40原料中2糠醛的测定方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103575847 A (43)申请公布日 2014.02.12 CN 103575847 A (21)申请号 201310545542.2 (22)申请日 2013.11.05 G01N 30/88(2006.01) (71)申请人 陕西省食品药品检验所 地址 710065 陕西省西安市高新区科技五路 21 号 (72)发明人 刘海静 王嫦鹤 乔蓉霞 耿庆光 王发 郭欢迎 戴涌 李霞 (74)专利代理机构 北京兆君联合知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11333 代理人 胡敬红 (54) 发明名称 右旋糖酐 40 原料中 2- 糠醛的测定方法 (57) 摘要 。

2、本发明涉及 “右旋糖酐 40 原料中 2- 糠醛的 测定方法” ， 包括原料配制、 固相萃取及液相检测 三个步骤， 在液相分析前对原料溶液进行了预处 理， 采用 Waters Oasis HLB 固相萃取小柱对糠醛 进行富集吸附， 并将右旋糖酐 40 去除， 收集到液 相样品溶液 ； 同时液相检测中采用梯度洗脱的方 式， 流动相 A ： 甲醇， 流动相 B ： 0.05mol/L 磷酸二 氢钾缓冲液， 用磷酸调节pH为3.0， 延长了色谱柱 的使用寿命。本发明方法灵敏度高， 能同时检测 出 5- 羟甲基糠醛和 2- 糠醛， 原料中 2- 糠醛的最 低检出量为 0.0015g/g ； 重复性好，。

3、 一批 6 份原 料测定结果， 其含量平均值为 0.5565g/g， RSD 为 0.7% ； 精密度 RSD 为 0.4%， 加样回收率平均为 95.0%， RSD 为 0.7%。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103575847 A CN 103575847 A 1/1 页 2 1.一种右旋糖酐40原料中2-糠醛的测定方法， 包括原料溶液的配制、 固相萃取及液相 检测三个步骤， 其特征在于 ： 原料配制为将右旋糖酐 40 用。

4、热水溶解， 配制成右旋糖酐 40 浓 度为 0.1g/mL 的溶液， 所述固相萃取为采用经活化后的固相萃取小柱， 量取右旋糖酐 40 溶 液上柱， 用水洗涤， 去除右旋糖酐， 再加甲醇洗脱， 收集甲醇洗脱液， 挥干甲醇， 用混合溶剂 溶解， 0.45m 微孔滤膜滤过， 作为液相检测的供试品溶液 ； 所述液相检测中的洗脱程序采 用梯度洗脱， 所述流动相 A ： 甲醇， 流动相 B ： 0.05mol/L 磷酸二氢钾缓冲液 （用磷酸调节 pH 为3.0） ， 03.00min采用100%的水相， 迅速去除样品中残留的右旋糖酐 ； 3.1018.00min 采用A-B体积比为30:70的混合流动相，。

5、 18.1021.00min采用A-B体积比为50:50的混合 流动相， 21.10 28.00min 采用 100% 的水相平衡色谱柱， 所述混合溶剂为甲醇 -0.05mol/ L 磷酸二氢钾缓冲液， 用磷酸调节 pH 为 3.0， 甲醇与 0.05mol/L 磷酸二氢钾缓冲液的体积比 为 50:50。 2.根据权利要求1所述测定方法， 所述固相萃取小柱为Waters Oasis HLB固相萃取小 柱。 3. 根据权利要求 1 所述的测定方法， 所述固相萃取中， 用水洗涤至少三次。 4. 根据权利要求 1 所述的测定方法， 所述液相检测中的色谱柱为 MACHEREY-NAGEL C18 色谱。

6、柱， 检测波长 ： 275nm。 5. 根据权利要求 1 所述的测定方法， 所述洗脱过程中， 柱温为 40， 流动相流速 ： 1.0mL/min。 权 利 要 求 书 CN 103575847 A 2 1/5 页 3 右旋糖酐 40 原料中 2- 糠醛的测定方法 技术领域 0001 本发明涉及一种药物微量杂质成分的 HPLC 的检测方法， 特别是涉及右旋糖酐 40 中 2- 糠醛的测定方法。 背景技术 0002 右 旋 糖 酐 系 蔗 糖 经 肠 膜 状 明 串 珠 菌 L.M-1226 号 菌 (Leuconostoc mesenteroides) 发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物， 经处理精。

7、制而得， 其分子式为 (C6H10O5)n。右旋糖酐按照分子量不同分为高分子 （10 20 万） 、 中分子量 （6 万 8 万） 、 低分子量 （2 4 万） 和小分子量 （1 2 万） 右旋糖酐。右旋糖酐 40 的重均分子量 （Mw） 为 32000 42000， 属于低分子右旋糖酐。国内于 1952 年研制成功， 1957 年开始应用于临 床。右旋糖酐 40 主要用于增加血浆容量， 维持血压， 以抗休克为主。广泛应用于各种休 克、 血栓性疾病、 肢体再植和血管外科手术等。右旋糖酐能提高血浆胶体渗透压， 吸收血管 外的水分而补充血容量， 维持血压 ； 使已经聚集的红细胞和血小板解聚， 降低。

8、血液黏滞性， 从而改善微循环， 防止休克后期的血管内凝血 ； 抑制凝血因子的激活， 使凝血因子和 活性降低以及其抗血小板作用均可阻止血栓形成。此外， 还具渗透性利尿作用 （黄勋 , 陈 槐卿 , 王玲等 . 右旋糖酐 40,70 对红细胞与内皮细胞粘附的影响 J. 生物医学工程学杂 志 ,1998,15(3):240 242.） 。 0003 可能是由于蔗糖经肠膜状明串珠菌 L.-M-1226 号菌发酵后生成的右旋糖酐分 子量较大， 大分子右旋糖酐作为血浆代用品安全性较差， 须用稀酸水解以获得较低分子 量的药用右旋糖酐， 但是水解的同时， 也会使部分右旋糖酐分解成低聚糖， 经异麦芽三 糖、 异。

9、麦芽二糖， 生成葡萄糖 （李艳， 陈学武， 牟德华 . 右旋糖酐的生产及应用 . 山西食品 工业 J,1998.3:36-37.） 。己糖 ( 葡萄糖、 果糖等单糖 ) 与氨基酸在高温、 酸性条件或 微生物的作用下脱水发生美拉德 （Maillard）反应生成 5- 羟甲基糠醛及糠醛 （杨朝霞， 李梅， 董建军等 . 高效液相色谱同时测定啤酒中的 5- 羟甲基糠醛和糠醛 J. 酿酒科 技 ,2006,9:88-89.） 。 中国药典 2010 年版二部中只采用紫外法对右旋糖酐 40 葡萄糖注 射液中的 5 羟甲基糠醛 （以下简称 5 ） 进行了限度检查， 而对右旋糖酐 40 氯化钠 注射液未做控。

10、制。 “法检查右旋糖酐 40 氯化钠注射液中 5 羟甲基糠醛的限量” ， 建立了用法测定右旋糖酐40氯化钠注射液中5含量的方法， 其结果在各 批右旋糖酐 40 氯化钠注射液中均检测出了 5 ， 因此有必要对其进行质量控制。但 是在现有的文献中均没有报导右旋糖酐 40 氯化钠注射液或葡萄糖注射液或原料中有过检 测出糠醛的报导。 0004 2- 糠醛为有机化合物， 是呋喃 2 位上的氢原子被醛基取代的衍生物， 分子式 C5H4O2， 又称2-呋喃甲醛。 糠醛属中等毒性类物质， 其蒸气具有强烈的刺激性， 并有麻醉作用 2,3。 动物吸入、 摄入或经皮肤吸收均可引起急性中毒， 表现有呼吸道刺激、 肺水。

11、肿、 肝损害、 中枢神经系统损害、 呼吸中枢麻痹， 以致死亡。其急性毒性 ： LD50为 65mg/kg( 大鼠经口 )， 最小致死剂量 500mg/kg（人经口） ， 亚急性和慢性毒性 ： 人吸入 7.4 52.7mg/m33 个月， 说 明 书 CN 103575847 A 3 2/5 页 4 发生粘膜刺激、 结膜炎、 流泪、 头痛。 此外糠醛是染色体断裂剂， 具有诱发碱基对置换的突变 作用， 具有诱发精子畸形和精母细胞姊妹染色单体交换的遗传毒性作用， 具有诱发脑室扩 张的致畸作用等较大的潜在遗传及生殖毒性 （牛凤云 , 王金山 , 王建刚 , 魏艳萍 . 糠醛对 大鼠致畸效应的研究 ,1。

12、992,6(4):290 ； 陈卫平 , 王金山 , 宋霖 . 糠醛诱发小鼠精子畸形的 实验研究 . 卫生毒理学杂志 ,1994,8(2):129） 。因此， 美国政府工业卫生专家学会 (ACGIH) 在 1981 年即通过了 2ppm 的阈限值 （TLV-TWA） 的规定。 0005 从现有文献报导来看， 对于右旋糖酐 40 原料中糠醛的存在是有可能的， 即使其含 量非常的低， 为保证用药安全， 对于糠醛检测及限量是必须的。 0006 按照 “HPLC 法检查右旋糖酐 40 氯化钠注射液中 5 羟甲基糠醛的限量” 建立的 HPLC 法来测定右旋糖酐 40 原料中 2- 糠醛， 由于 2- 糠。

13、醛与 5 羟甲基糠醛的结构有差异， 而且 2- 糠醛的含量很低， 上述检测方法要同时准确检测出两种杂质难度较大。前期研究结 果表明， 采用液相色谱测定2-糠醛时， 液相色谱对2-糠醛的最低检测限为0.003g/mL， 即 原料中 2- 糠醛可检出的最低量为 0.03g/g， 而右旋糖酐原料中 2- 糠醛的含量较低， 约为 0.08 1.3g/g， 最低含量接近于最低检出浓度， 不便于准确检测。此外， 由于该样品中右 旋糖酐40的浓度较高， 采用文献中流动相等度洗脱方式进行洗脱， 将会使右旋糖酐40残留 在色谱柱柱头， 影响色谱柱的寿命。因此采用检测 5 羟甲基糠醛的条件及方法， 不能准确 地检。

14、测出右旋糖酐 40 原料中 2- 糠醛的存在。 发明内容 0007 针对上述领域中的不足， 本发明提供一种右旋糖酐40原料中2-糠醛的测定方法， 通过优化的液相检测条件， 检测出右旋糖酐 40 中确有 2- 糠醛存在， 该 HPLC 检测方法重复 性好， 且采用梯度洗脱方法， 右旋糖酐 40 的残留少， 对色谱柱的使用寿命影响较小。 0008 一种右旋糖酐 40 原料中 2- 糠醛的测定方法， 包括原料配制、 固相萃取及液相检 测三个步骤， 其特征在于 ： 原料右旋糖酐 40 用热水溶解， 配制成右旋糖酐 40 浓度为 0.1g/ mL 的溶液， 所述固相萃取为采用经活化后的固相萃取小柱， 量。

15、取右旋糖酐 40 溶液上柱， 用水洗涤， 去除右旋糖酐 40， 再加甲醇洗脱， 收集甲醇洗脱液， 真空离心挥干， 用流动相甲 醇 -0.05mol/L 磷酸二氢钾缓冲液 （用磷酸调节 pH 为 3.0） （50:50） 溶解， 0.45m 微孔滤 膜滤过， 作为液相检测的供试品溶液 ； 所述液相检测中的洗脱程序采用梯度洗脱， 所述流动 相 A ： 甲醇， 流动相 B ： 0.05mol/L 磷酸二氢钾缓冲液 （用磷酸调节 pH 为 3.0） ， 0 3.00min 采用 100% 的水相， 迅速去除样品中残留的右旋糖酐 ； 3.10 18.00min 采用 A-B 体积比为 30:70 的混合。

16、流动相， 18.10 21.00min 采用 A-B 体积比为 50:50 的混合流动相， 21.10 28.00min 采用 100% 的水相平衡色谱柱。 0009 所述固相萃取小柱为 Waters Oasis HLB 固相萃取小柱。 0010 所述固相萃取中， 用水洗涤至少五次。 0011 所述液相检测中的色谱柱为 MACHEREY-NAGEL C18色谱柱， 检测波长 ： 275nm。 0012 所述洗脱过程中， 柱温为 40， 流动相流速 ： 1.0mL/min。 0013 由于右旋糖酐 40 原料中糠醛浓度太低， 不便于检测， 因此本发明在进行液相检测 前， 进行了预处理， 使用固相。

17、萃取法将原料中右旋糖酐去除， 同时将糠醛富集吸附， 提高其 检测浓度。原料用热水配制成右旋糖酐浓度为 0.1g/mL 的溶液， 使用固相萃取小柱萃取过 说 明 书 CN 103575847 A 4 3/5 页 5 程中， 需用水洗脱 5 次， 每次 3mL， 用以去除右旋糖酐， 然后用甲醇洗脱糠醛， 挥干甲醇， 加流 动相溶解， 用于液相分析。由于右旋糖酐 40 易于在色谱柱的柱头残留， 从而影响色谱柱的 使用寿命， 本发明采用了梯度洗脱的方式， 0 3.00min 采用 100% 的水相， 柱温 40， 迅速 去除样品中残留的右旋糖酐 ； 3.10 18.00 采用甲醇 -0.05mol/L。

18、 磷酸二氢钾缓冲液 （用 磷酸调节 pH 为 3.0） （30:70） 对样品中的糠醛进行分析测定 ； 18.10 21.00min 采用甲 醇 -0.05mol/L 磷酸二氢钾缓冲液 （用磷酸调节 pH 为 3.0）（50:50） ， 增加流动相中有机相的 比例， 洗脱样品中的极性较弱的杂质 ； 21.10 28.00min 采用 100% 的水相平衡色谱柱。 0014 本发明方法在采用液相分析前对样品溶液进行了预处理， 采用 Waters Oasis HLB 固相萃取小柱对糠醛进行富集吸附， 并将右旋糖酐 40 去除， 收集到液相样品溶液 ； 同时液 相检测中采用梯度洗脱的方式， 去除残留。

19、， 延长了色谱柱的使用寿命。采用本发明的方法， 能同时检测出右旋糖酐 40 中的 5- 羟甲基糠醛和 2- 糠醛， 对于该注射剂安全性评价有重要 依据。本发明方法灵敏度高， 最低检出量为 0.0015g/g， 特别适用于原料中 2- 糠醛含量 较低样品的检测 ； 重复性好， 一批 6 份原料测定结果， 其含量平均值为 0.5565g/g， RSD 为 0.7% ； 精密度 RSD 为 0.4%， 加样回收率平均为 95.0%， RSD 为 0.7%。 附图说明 0015 图 1 空白色谱图， 0016 图 2 2- 糠醛对照品色谱图， 0017 其中峰 1 为 2- 糠醛， 0018 图 3 。

20、右旋糖酐 40 原料色谱图， 0019 其中峰 1 为 5- 羟甲基糠醛， 峰 2 为 2- 糠醛， 0020 图 4 右旋糖酐 40 原料色谱图， 0021 其中峰 1 为 5- 羟甲基糠醛， 峰 2 为 2- 糠醛。 具体实施方式 0022 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。 0023 实施例 1 0024 1. 仪器与试药 0025 仪器 :Waters Alliance HT 系统 ； 检测器 ： Waters2487 紫外检测器。 0026 固相萃取柱 :Oasis HLB,60mg,3cc, 使用时依次加入 3mL 水、 3mL 甲醇和 3mL 水活 化。 0027 试药 。

21、： 糠醛为分析纯， 甲醇为色谱纯， 水为高纯水。 0028 2. 方法与结果 0029 2.1 色谱条件 ： Waters Alliance HT 系统 ； 检测器 ： Waters2487 紫外检测器 ； 色谱 柱 ： MACHEREY-NAGEL C18(2504.6mm,5m) ； 洗脱程序采用梯度洗脱， 流动相 A ： 甲醇， 流动 相 B ： 0.05mol/L 磷酸二氢钾缓冲液 （用磷酸调节 pH 为 3.0） ； 梯度洗脱程序见表 1。柱温 ： 40 ； 流速 ： 1.0mL/min ； 检测波长 ： 275nm ； 进样量 20L。 0030 表 1 原料梯度洗脱程序 0031。

22、 说 明 书 CN 103575847 A 5 4/5 页 6 时间 (min) 流速 （mL/min）流动相 A(%)流动相 B(%) 0.001.00100 3.001.00100 3.101.03070 18.001.03070 18.101.05050 21.001.05050 21.101.00100 28.001.00100 0032 0 3.00min 采用 100% 的水相， 柱温 40， 迅速去除样品中残留的右旋糖酐 ； 3.10 18.00min 采用甲醇 -0.05mol/L 磷酸二氢钾缓冲液 （用磷酸调节 pH 为 3.0）（30:70） 对样品中的糠醛进行分析测定 ；。

23、 18.10 21.00min 采用甲醇 -0.05mol/L 磷酸二氢钾缓冲 液 （用磷酸调节 pH 为 3.0）（50:50） ， 增加流动相中有机相的比例， 洗脱样品中的极性较弱的 杂质 ； 21.10 28.00min 采用 100% 的水相平衡色谱柱。 0033 2.2 对照品溶液的制备 ： 精密称取糠醛对照品 10.10mg， 用甲醇稀释并定容于 100mL 量瓶中， 摇匀， 浓度为 101g/mL， 作为对照品储备液。分别精密量取对照品储备液适 量， 用流动相甲醇 -0.05mol/L 磷酸二氢钾缓冲液 （用磷酸调节 pH 为 3.0） （50:50） 稀释制 成质量浓度分别为 。

24、0.01， 0.10， 0.50， 1.01， 5.05， 10.10g/mL 的系列对照品溶液。 0034 2.3 供试品溶液的制备 ： 精密称取原料适量， 热水溶解， 配制成右旋糖酐 40 浓度为 0.1g/mL的溶液， 精密量取2mL， 上经活化的Waters Oasis HLB固相萃取小柱， 抽干， 用水洗 涤 5 次， 每次 3mL， 抽干， 去除右旋糖酐， 加 3mL 甲醇洗脱， 收集甲醇洗脱液， 真空离心挥干， 流动相甲醇 -0.05mol/L 磷酸二氢钾缓冲液 （用磷酸调节 pH 为 3.0） （50:50） 100L 溶解， 0.45m 微孔滤膜滤过， 作为原料供试品溶液。 。

25、0035 2.4 线性实验 ： 分别精密量取系列对照品溶液各 20L， 注入液相色谱仪， 采用 Waters2487紫外检测器， 按2.1项下色谱条件分别测定， 以峰面积Y对质量浓度X作线性回 归， 线性方程为 Y=193499.7X-4378.4（R=0.9999） ， 线性范围 ： 0.01 10.00g/mL。 0036 2.5 系统适用性 ： 取空白溶液、 对照溶液 （浓度为 1.01g/mL） 、 供试品溶液各 20L， 注入液相色谱仪， 按2.1项下色谱条件测定， 经Waters2487紫外检测器记录色谱图。 结果显示， 空白溶液对糠醛测定无干扰， 各色谱峰分离良好， 且能同时检测。

26、出右旋糖酐 40 中的 5- 羟甲基糠醛和 2- 糠醛。空白溶液、 对照溶液、 供试品溶液的色谱图见图 1 3。 0037 2.6 最低检测限和最低定量限 : 根据色谱图的信噪比， 仪器最低检测限 （S/N=3） 为 0.003g/mL， 最低定量限 （S/N=10） 为 0.01g/mL， 即原料中 2- 糠醛的最低检出量为 0.0015g/g。 说 明 书 CN 103575847 A 6 5/5 页 7 0038 2.7精密度实验 ： 取线性实验项下质量浓度为1.01g/mL对照品溶液， 连续进样6 次， 按 2.1 项下色谱条件测定， RSD 为 0.4%。 0039 2.8重复性实验。

27、 ： 取同一批原料6份， 采用2.3项下的操作过程制备样品， 按2.1项 下色谱条件测定， 其含量平均值为 0.5565g/g， RSD 为 0.7%。 0040 2.9 加样回收率试验 ： 取已知糠醛浓度的原料适量， 配制成右旋糖酐 40 浓度为 0.1g/mL 的溶液， 精密称取糠醛对照品适量， 用原料溶液稀释至糠醛为 0.1g/mL 的溶液， 按照 2.3 项下的操作过程， 制备加样回收率样品， 精密进样 20L。按 2.1 项下色谱条件 进行分析， 记录色谱图， 根据对照品的标准线性方程， 计算回收率， 得糠醛的平均回收率为 95.0%， RSD 为 0.7%。 0041 2.10 供。

28、试品中糠醛的检测及结果 0042 分别精密量取供试品溶液 20L， 按 2.1 项下色谱条件进行分析 （色谱图见图 4） 。 0043 右旋糖酐 40 原料中糠醛含量见表 2。 0044 表 2 右旋糖酐原料中糠醛含量的测定结果 0045 提供厂家含量 /(g/g) 0046 非固相萃取固相萃取 A 制药厂00.0117 B 制药厂0.17060.1734 B 制药厂1.29291.2852 C 制药厂0.55960.5565 D 制药厂0.15190.1608 D 制药厂0.08270.0920 0047 本发明采上述方法测定到多批右旋糖酐 40 原料中均有糠醛存在， 且固相萃取与 非固相萃取的含量检测有一定的差别， 采用固相萃取后提高了检测的灵敏度， 原料中 2- 糠 醛的最低检出量由非固相萃取时的 0.03g/g 降低至 0.0015g/g， 特别适用于右旋糖酐 40 原料中 2- 糠醛含量较低样品的检测， 测定结果更为准确。本发明方法灵敏度高， 重复性 好， 值得推广。 说 明 书 CN 103575847 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103575847 A 8 2/2 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 103575847 A 9 。