一种用RBSDV粗提液进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103592443 A (43)申请公布日 2014.02.19 CN 103592443 A (21)申请号 201310610988.9 (22)申请日 2013.11.28 G01N 33/68(2006.01) G01N 33/571(2006.01) (71)申请人江苏省农业科学院地址 210014 江苏省南京市玄武区钟灵街 50 号江苏省农业科学院植物保护研究所 (72)发明人徐秋芳陈晴晴周益军倪海平 (54) 发明名称一种用 RBSDV 粗提液进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法 (57) 摘要本发明公开了一种用 RBSDV 粗提液进行病毒。

2、覆盖蛋白结合实验的方法。本发明的实质是通过研磨 RBSDV 病样释放出病毒粒子，离心获得病毒的粗提液，以 RBSDV 的粗提液而不是提纯的病毒粒子进行病毒覆盖蛋白结合实验。本发明这个方法不需要提取 RBSDV 病毒粒子，操作简便，大大减少了成本，节省了时间，较原有方法具有更方便、快捷和经济的特点，可应用于分析或筛选 RBSDV 病毒的互作蛋白。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 3 页附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图1页 (10)申请公布号 CN 103592443 A C。

3、N 103592443 A 1/1 页 2 1. 本发明公开一种用 RBSDV 粗提液进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法，其方法如下： (1)将RBSDV水稻或玉米病样去根洗净，切碎后用液氮碾磨，按每1g病样加入5ml0.01M PBST的比例加入PBST溶液，混匀，放置15min， 8000g离心10min，取上清。此上清即为RBSDV 粗提液，放 4冰箱备用； (2)将用于分析的蛋白或蛋白混合物进行SDS-PAGE或双向电泳(2D)分离，分离后采用半干转移等方法将蛋白转移到膜 ( 如硝酸纤维素膜、 PVDF 膜 ) 上； (3) 电转后的膜用 0.01M PBST 漂。

4、洗两次，每次 5min ； (4) 将膜用 3封闭液 (3g 脱脂牛奶 /100ml0.01M PBST 缓冲液 )37振荡 2h，以封闭非特异性蛋白结合位点； (5) 膜用 0.01M PBST 漂洗三次，每次 5min ； (6) 将膜浸入 RBSDV 粗提液中， 20轻摇振荡过夜； (5) 膜用 0.01M PBST 漂洗三次，每次 5min ； (7) 将膜浸入 3封闭液稀释的 RBSDV 的抗体中， 37振荡 2h ； (8) 膜用 0.01M PBST 漂洗三次，每次 5min ； (9) 将膜浸入 3封闭液稀释的针对 RBSDV 抗体的二抗中， 37振荡 1.5h。

5、； (10) 膜用 0.01M PBST 漂洗三次，每次 5min ； (11) 将膜浸入与二抗对应标记的底物显色液中， 37，反应至互作点显色清晰，迅速用去离子水冲洗，以终止反应，室温晾干膜，拍照记录。 2. 根据权利要求 1 所述的用 RBSDV 粗提液标记进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法，其特征在于步骤第 6 步 “将膜浸入 RBSDV 粗提液中， 20轻摇振荡过夜” 。 3. 根据权利要求 1 所述的用 RBSDV 粗提液标记进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法，其特征在于 RBSDV 病毒粗提液按照步骤 1 方法制备。权利要求书 CN 103592443 A。

6、 2 1/3 页 3 一种用 RBSDV 粗提液进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法技术领域 0001 本文发明一种用水稻黑条矮缩病毒 (rice black streaked dwarf virus， RBSDV) 粗提液进行病毒覆盖蛋白结合实验(virus overlay-protein binding assay,VOPBA)的方法，属于生物技术领域。背景技术 0002 病毒覆盖蛋白结合实验 (VOPBA) 是一种基于 western blotting 的分子生物学方法，可用于检测蛋白 - 蛋白之间的相互作用、筛选病毒的互作蛋白等。其实验过程可以简单描述为将待检测的蛋白质经SD。

7、S-PAGE或双向电泳等方法分离后，转移并固定在膜(如硝酸纤维素膜、 PVDF 膜等 ) 上，将提纯的病毒粒子与膜共同孵育，使病毒和互作蛋白结合，然后用病毒特异性识别物质 ( 如抗体 ) 去识别，最后经显色反应将互作蛋白在膜上显示出来。 0003 病毒覆盖蛋白结合实验是获取病毒互作蛋白的有效手段。Zhang 等利用提纯的戊型肝炎病毒 (Hepatitis E virus， HEV) 粒子进行病毒覆盖蛋白结合实验，获取了猪肝脏细胞中的互作蛋白 1。Thongtan 等利用提纯的日本乙脑病毒进行病毒覆盖蛋白结合实验，获得了微神经胶质细胞中的可能受体 2。Li 等利用提纯的水稻。

8、条纹病毒粒子进行病毒覆盖蛋白结合实验，获取了介体昆虫灰飞虱中与病毒互作的蛋白 3。 0004 水稻黑条矮缩病毒 (Rice black streaked dwarf virus， RBSDV) 为呼肠孤病毒科，斐济病毒属 (Fijivirus) 病毒。可危害水稻、玉米、小麦、大麦、高粱及燕麦等 20 多种禾本科寄主，对农业生产造成了严重影响。RBSDV 不仅引起水稻黑条矮缩病，同时也是引起玉米粗缩病的病原。近年来，由 RBSDV 引起的水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病在我国华北、华东等地大规模流行，造成严重损失。该病毒主要通过介体昆虫灰飞虱 (Laodelphax s。

9、triatellus) 以增殖型持久性方式传播。获取介体灰飞虱中与 RBSDV 互作的蛋白对研究 RBSDV 的虫传机制具有重要作用。 0005 利用传统的病毒覆盖蛋白结合实验技术来获取 RBSDV 互作蛋白存在一定的缺陷。主要原因是该病毒主要存在于寄主植物叶脉的韧皮部中，很难获得大量高纯度的病毒粒子，而且该病毒粒子的外壳蛋白和表面突起极不稳定，在病毒的纯化过程中容易丢失，所以一般提纯的病毒都是各种亚病毒粒子的混合物，不适宜用病毒覆盖蛋白结合实验技术来获取 RBSDV 互作蛋白。为克服这一局限性，本文发明了一种用 RBSDV 粗提液代替提纯的病毒粒子进行病毒覆盖蛋白结合实。

10、验来分析病毒互作蛋白的方法。该方法操作简便，无需提纯病毒，缩短了实验周期，节省了提纯病毒所需的人力物力。 0006 参考文献： 0007 1.Zhang w， Hua X， Shen Q， Yang S， Yin H， et a1.Identification of genotype4Hepatitis E virus binding proteins on swine liver cells.Virol J8 ： 482. 0008 2.Thongtan T， Wikan N， Wintachai P， Rattanarungsan C， Srisomsap C， et a1.Ch。

11、aracterization of putative Japanese encephalitis virus receptor molecules on microglial cells.J Med Virol84 ： 615-623. 说明书 CN 103592443 A 3 2/3 页 4 0009 3.Li S， Xiong R， Wang X， Zhou Y Five proteins of Laodelphax striatellus are potentially involved in the interactions between rice stripe virus an。

12、d vector.PLoS One6 ： e26585. 发明内容 0010 本发明提供了一种用 RBSDV 病汁液进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法。 0011 具体操作方法如下： 0012 (1) 将 RBSDV 水稻或玉米病样去根洗净，切碎后用液氮碾磨，按每 1g 病样加入 5ml0.01M PBST 的比例加入 PBST 溶液，混匀，放置 15min， 8000g 离心 10min，取上清。此上清即为 RBSDV 粗提液，放 4冰箱备用； 0013 (2)将用于分析的蛋白或蛋白混合物进行SDS-PAGE或双向电泳(2D)分离，分离后采用半干转移等方法将蛋白转移到膜 (。

13、如硝酸纤维素膜、 PVDF 膜 ) 上； 0014 (3) 电转后的膜用 0.01M PBST 漂洗两次，每次 5min ； 0015 (4) 将膜用 3封闭液 (3g 脱脂牛奶 /100ml0.01M PBST 缓冲液 )37振荡 2h，以封闭非特异性蛋白结合位点； 0016 (5) 膜用 0.01M PBST 漂洗三次，每次 5min ； 0017 (6) 将膜浸入 RBSDV 粗提液中， 20轻摇振荡过夜； 0018 (5) 膜用 0.01M PBST 漂洗三次，每次 5min ； 0019 (7) 将膜浸入 3封闭液稀释的 RBSDV 的抗体中， 37振荡 2h ；。

14、0020 (8) 膜用 0.01M PBST 漂洗三次，每次 5min ； 0021 (9) 将膜浸入 3封闭液稀释的针对 RBSDV 抗体的二抗中， 37振荡 1.5h ； 0022 (10) 膜用 0.01M PBST 漂洗三次，每次 5min ； 0023 (11) 将膜浸入与二抗对应标记的底物显色液中， 37反应至互作点显色清晰，迅速用去离子水冲洗，以终止反应，室温晾干膜，拍照记录。 0024 本发明提供了一种用 RBSDV 粗提液进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法。该方法的特征是通过研磨病样释放出 RBSDV 病毒粒子，离心获得 RBSDV 的粗提液，以 RBSDV 。

15、的粗提液而不是提纯的病毒粒子进行病毒覆盖蛋白结合实验。本发明可用于分析蛋白与病毒的互作关系，筛选 RBSDV 的互作蛋白。此方法不需要提取 RBSDV 病毒粒子，大大减少了成本，节省了时间，具有操作简便、快捷的优点。附图说明 0025 图 1 采用本发明筛选灰飞虱中与 RBSDV 病毒粒子互作的蛋白。图 A 为灰飞虱总蛋白经双向电泳分离后考马斯亮蓝染色图。图 B 为采用本发明找到的灰飞虱中的蛋白。图中标记的为与 RBSDV 互作的灰飞虱蛋白。 0026 图 2 采用本发明分析灰飞虱蛋白与 RBSDV 病毒粒子的互作关系。图 A 为诱导蛋白经 SDS-PAGE 分离后考。

16、马斯亮蓝染色图。图 B 为采用本发明分析灰飞虱蛋白与 RBSDV 病毒粒子的互作结果。M 蛋白 Marker，泳道 1，空载体 pET-32a，泳道 2， 3， 4 分别为用 pET-32a 诱导表达的蛋白 actin、 RACK、 VP1、 GAPDH3。 0027 具体实施方法说明书 CN 103592443 A 4 3/3 页 5 0028 实例一用 RBSDV 病汁液进行 VOPBA 筛选介体灰飞虱中的互作蛋白 0029 RBSDV 主要通过介体灰飞虱传播，为获取灰飞虱体内参与 RBSDV 传播的介体因子，采用本发明寻找介体灰飞虱中的互作蛋白。具体操作方法为：将。

17、10g RBSDV 水稻病样用液氮碾磨，加入 50mi 的 0.01M PBST 缓冲液，混匀，放置 15min 后， 8000g 离心 10min，取上清， 4保存备用；提取灰飞虱总蛋白进行双向电泳分离，做 2 个重复；将其中一块凝胶用于考马斯亮蓝染色，另一块凝胶通过半干转移(20V， 45min)将蛋白转移到PVDF膜上；将PVDF膜用 0.01M PBST 漂洗两次，每次 5min ；将膜浸于 3封闭液中， 37振荡 2h，以封闭非特异性蛋白结合位点；再将膜漂洗三次；将膜浸入 RBSDV 粗提液中， 20轻摇振荡过夜；再将膜漂洗三次；。

18、将膜浸入3封闭液稀释的RBSDV多克隆抗体(12000倍稀释)中， 37振荡2h ；膜用 0.01M PBST 漂洗三次，每次 5min ；将膜浸入 3封闭液稀释的辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗兔二抗 (1 2000 倍稀释 ) 中， 37振荡 1.5h ；再将膜漂洗三次；将膜浸入 HRP 标记的底物显色液中， 37反应至互作点显色清晰，迅速用去离子水冲洗，以终止反应，室温晾干膜，拍照记录。结果如图 1 所示。图 1A 和图 1B 中显示的蛋白点即为采用本发明找到的互作蛋白。 0030 实例二用 RBSDV 粗提液进行 VOPBA 分析灰飞虱蛋白与 RBSDV。

19、病毒粒子的互作关系 0031 通过酵母双杂交方法筛选到灰飞虱中与 RBSDV P10 互作的蛋白 actin、 RACK、 VP1 和 GAPDH3。为分析这些互作蛋白与 RBSDV 病毒粒子的互作关系，采用本发明方法分析它们与病毒的互作关系。具体操作方法为：将 4g RBSDV 水稻病样用液氮碾磨，加入 20ml 的 0.01MPBST 缓冲液，混匀，放置 15min 后， 8000g 离心 10min，取上清， 4保存备用；将这些互作蛋白进行原核表达和诱导，诱导表达的蛋白进行 SDS-PAGE 分离，然后利用半干转移 (15V， 40min) 将蛋白转移到硝酸纤。

20、维素膜上；将硝酸纤维素膜用 0.01M PBST 漂洗两次，每次 5min ；将膜浸于 3封闭液中， 37振荡 2h，以封闭非特异性蛋白结合位点；再将膜漂洗三次；用 RBSDV 粗提液覆盖硝酸纤维素膜， 20轻摇振荡过夜；再将膜漂洗三次；将膜浸入 3封闭液稀释的 RBSDV 多克隆抗体 (1 ： 2000 倍稀释 ) 中， 37振荡 2h ；再将膜漂洗三次；将膜浸入3封闭液稀释的HRP标记的羊抗兔二抗中(以1 ： 2000倍稀释)， 37振荡1.5h ；再将膜漂洗三次；将膜浸入 HRP 标记的底物显色液中， 37反应至互作点显色清晰，迅速用去离子水冲洗，以终止反应，室温晾干膜，拍照记录。结果如图 2 所示。图 2B 中可见与图 2A 中表达蛋白对应位置有一特异条带，表明这些灰飞虱中的互作蛋白与 RBSDV 病毒粒子有互作关系。说明书 CN 103592443 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说明书附图 CN 103592443 A 6 。

摘要
申请专利号：	CN201310610988.9	申请日：	2013.11.28
公开号：	CN103592443A	公开日：	2014.02.19
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 33/68申请公布日:20140219\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20131128\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N33/68; G01N33/571	主分类号：	G01N33/68
申请人：	江苏省农业科学院
发明人：	徐秋芳; 陈晴晴; 周益军; 倪海平
地址：	210014 江苏省南京市玄武区钟灵街50号江苏省农业科学院植物保护研究所
优先权：
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内容摘要

本发明公开了一种用RBSDV粗提液进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法。本发明的实质是通过研磨RBSDV病样释放出病毒粒子，离心获得病毒的粗提液，以RBSDV的粗提液而不是提纯的病毒粒子进行病毒覆盖蛋白结合实验。本发明这个方法不需要提取RBSDV病毒粒子，操作简便，大大减少了成本，节省了时间，较原有方法具有更方便、快捷和经济的特点，可应用于分析或筛选RBSDV病毒的互作蛋白。

权利要求书

权利要求书
1.  本发明公开一种用RBSDV粗提液进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法，其方法如下：
(1)将RBSDV水稻或玉米病样去根洗净，切碎后用液氮碾磨，按每1g病样加入5ml0.01M PBST的比例加入PBST溶液，混匀，放置15min，8000g离心10min，取上清。此上清即为RBSDV粗提液，放4℃冰箱备用；
(2)将用于分析的蛋白或蛋白混合物进行SDS-PAGE或双向电泳(2D)分离，分离后采用半干转移等方法将蛋白转移到膜(如硝酸纤维素膜、PVDF膜)上；
(3)电转后的膜用0.01M PBST漂洗两次，每次5min；
(4)将膜用3％封闭液(3g脱脂牛奶/100ml0.01M PBST缓冲液)37℃振荡2h，以封闭非特异性蛋白结合位点；
(5)膜用0.01M PBST漂洗三次，每次5min；
(6)将膜浸入RBSDV粗提液中，20℃轻摇振荡过夜；
(5)膜用0.01M PBST漂洗三次，每次5min；
(7)将膜浸入3％封闭液稀释的RBSDV的抗体中，37℃振荡2h；
(8)膜用0.01M PBST漂洗三次，每次5min；
(9)将膜浸入3％封闭液稀释的针对RBSDV抗体的二抗中，37℃振荡1.5h；
(10)膜用0.01M PBST漂洗三次，每次5min；
(11)将膜浸入与二抗对应标记的底物显色液中，37℃，反应至互作点显色清晰，迅速用去离子水冲洗，以终止反应，室温晾干膜，拍照记录。

2.  根据权利要求1所述的用RBSDV粗提液标记进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法，其特征在于步骤第6步“将膜浸入RBSDV粗提液中，20℃轻摇振荡过夜”。

3.  根据权利要求1所述的用RBSDV粗提液标记进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法，其特征在于RBSDV病毒粗提液按照步骤1方法制备。

说明书

说明书一种用RBSDV粗提液进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法
技术领域
本文发明一种用水稻黑条矮缩病毒(rice black streaked dwarf virus，RBSDV)粗提液进行病毒覆盖蛋白结合实验(virus overlay-protein binding assay,VOPBA)的方法，属于生物技术领域。
背景技术
病毒覆盖蛋白结合实验(VOPBA)是一种基于western blotting的分子生物学方法，可用于检测蛋白-蛋白之间的相互作用、筛选病毒的互作蛋白等。其实验过程可以简单描述为将待检测的蛋白质经SDS-PAGE或双向电泳等方法分离后，转移并固定在膜(如硝酸纤维素膜、PVDF膜等)上，将提纯的病毒粒子与膜共同孵育，使病毒和互作蛋白结合，然后用病毒特异性识别物质(如抗体)去识别，最后经显色反应将互作蛋白在膜上显示出来。
病毒覆盖蛋白结合实验是获取病毒互作蛋白的有效手段。Zhang等利用提纯的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)粒子进行病毒覆盖蛋白结合实验，获取了猪肝脏细胞中的互作蛋白[1]。Thongtan等利用提纯的日本乙脑病毒进行病毒覆盖蛋白结合实验，获得了微神经胶质细胞中的可能受体[2]。Li等利用提纯的水稻条纹病毒粒子进行病毒覆盖蛋白结合实验，获取了介体昆虫灰飞虱中与病毒互作的蛋白[3]。
水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)为呼肠孤病毒科，斐济病毒属(Fijivirus)病毒。可危害水稻、玉米、小麦、大麦、高粱及燕麦等20多种禾本科寄主，对农业生产造成了严重影响。RBSDV不仅引起水稻黑条矮缩病，同时也是引起玉米粗缩病的病原。近年来，由RBSDV引起的水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病在我国华北、华东等地大规模流行，造成严重损失。该病毒主要通过介体昆虫灰飞虱(Laodelphax striatellus)以增殖型持久性方式传播。获取介体灰飞虱中与RBSDV互作的蛋白对研究RBSDV的虫传机制具有重要作用。
利用传统的病毒覆盖蛋白结合实验技术来获取RBSDV互作蛋白存在一定的缺陷。主要原因是该病毒主要存在于寄主植物叶脉的韧皮部中，很难获得大量高纯度的病毒粒子，而且该病毒粒子的外壳蛋白和表面突起极不稳定，在病毒的纯化过程中容易丢失，所以一般提纯的病毒都是各种亚病毒粒子的混合物，不适宜用病毒覆盖蛋白结合实验技术来获取RBSDV互作蛋白。为克服这一局限性，本文发明了一种用RBSDV粗提液代替提纯的病毒粒子进行病毒覆盖蛋白结合实验来分析病毒互作蛋白的方法。该方法操作简便，无需提纯病毒，缩短了实验周期，节省了提纯病毒所需的人力物力。
参考文献：
1.Zhang w，Hua X，Shen Q，Yang S，Yin H，et a1.Identification of genotype4Hepatitis E virus binding proteins on swine liver cells.Virol J8：482.
2.Thongtan T，Wikan N，Wintachai P， Rattanarungsan C，Srisomsap C，et a1.Characterization of putative Japanese encephalitis virus receptor molecules on microglial cells.J Med Virol84：615-623.
3.Li S，Xiong R，Wang X，Zhou Y Five proteins of Laodelphax striatellus are potentially involved in the interactions between rice stripe virus and vector.PLoS One6：e26585.
发明内容
本发明提供了一种用RBSDV病汁液进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法。
具体操作方法如下：
(1)将RBSDV水稻或玉米病样去根洗净，切碎后用液氮碾磨，按每1g病样加入5ml0.01M PBST的比例加入PBST溶液，混匀，放置15min，8000g离心10min，取上清。此上清即为RBSDV粗提液，放4℃冰箱备用；
(2)将用于分析的蛋白或蛋白混合物进行SDS-PAGE或双向电泳(2D)分离，分离后采用半干转移等方法将蛋白转移到膜(如硝酸纤维素膜、PVDF膜)上；
(3)电转后的膜用0.01M PBST漂洗两次，每次5min；
(4)将膜用3％封闭液(3g脱脂牛奶/100ml0.01M PBST缓冲液)37℃振荡2h，以封闭非特异性蛋白结合位点；
(5)膜用0.01M PBST漂洗三次，每次5min；
(6)将膜浸入RBSDV粗提液中，20℃轻摇振荡过夜；
(5)膜用0.01M PBST漂洗三次，每次5min；
(7)将膜浸入3％封闭液稀释的RBSDV的抗体中，37℃振荡2h；
(8)膜用0.01M PBST漂洗三次，每次5min；
(9)将膜浸入3％封闭液稀释的针对RBSDV抗体的二抗中，37℃振荡1.5h；
(10)膜用0.01M PBST漂洗三次，每次5min；
(11)将膜浸入与二抗对应标记的底物显色液中，37℃反应至互作点显色清晰，迅速用去离子水冲洗，以终止反应，室温晾干膜，拍照记录。
本发明提供了一种用RBSDV粗提液进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法。该方法的特征是通过研磨病样释放出RBSDV病毒粒子，离心获得RBSDV的粗提液，以RBSDV的粗提液而不是提纯的病毒粒子进行病毒覆盖蛋白结合实验。本发明可用于分析蛋白与病毒的互作关系，筛选RBSDV的互作蛋白。此方法不需要提取RBSDV病毒粒子，大大减少了成本，节省了时间，具有操作简便、快捷的优点。
附图说明
图1采用本发明筛选灰飞虱中与RBSDV病毒粒子互作的蛋白。图A为灰飞虱总蛋白经双向电泳分离后考马斯亮蓝染色图。图B为采用本发明找到的灰飞虱中的蛋白。图中标记的为与RBSDV互作的灰飞虱蛋白。
图2采用本发明分析灰飞虱蛋白与RBSDV病毒粒子的互作关系。图A为诱导蛋白经SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染色图。图B为采用本发明分析灰飞虱蛋白与RBSDV病毒粒子的互作结果。M∶蛋白Marker，泳道1，空载体pET-32a，泳道2，3，4分别为用pET-32a诱导表达的蛋白actin、RACK、VP1、GAPDH3。
具体实施方法
实例一用RBSDV病汁液进行VOPBA筛选介体灰飞虱中的互作蛋白
RBSDV主要通过介体灰飞虱传播，为获取灰飞虱体内参与RBSDV传播的介体因子，采用本发明寻找介体灰飞虱中的互作蛋白。具体操作方法为：将10g RBSDV水稻病样用液氮碾磨，加入50mi的0.01M PBST缓冲液，混匀，放置15min后，8000g离心10min，取上清，4℃保存备用；提取灰飞虱总蛋白进行双向电泳分离，做2个重复；将其中一块凝胶用于考马斯亮蓝染色，另一块凝胶通过半干转移(20V，45min)将蛋白转移到PVDF膜上；将PVDF膜用0.01M PBST漂洗两次，每次5min；将膜浸于3％封闭液中，37℃振荡2h，以封闭非特异性蛋白结合位点；再将膜漂洗三次；将膜浸入RBSDV粗提液中，20℃轻摇振荡过夜；再将膜漂洗三次；将膜浸入3％封闭液稀释的RBSDV多克隆抗体(1∶2000倍稀释)中，37℃振荡2h；膜用0.01M PBST漂洗三次，每次5min；将膜浸入3％封闭液稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1∶2000倍稀释)中，37℃振荡1.5h；再将膜漂洗三次；将膜浸入HRP标记的底物显色液中，37℃反应至互作点显色清晰，迅速用去离子水冲洗，以终止反应，室温晾干膜，拍照记录。结果如图1所示。图1A和图1B中显示的蛋白点即为采用本发明找到的互作蛋白。
实例二用RBSDV粗提液进行VOPBA分析灰飞虱蛋白与RBSDV病毒粒子的互作关系
通过酵母双杂交方法筛选到灰飞虱中与RBSDV P10互作的蛋白actin、RACK、VP1和GAPDH3。为分析这些互作蛋白与RBSDV病毒粒子的互作关系，采用本发明方法分析它们与病毒的互作关系。具体操作方法为：将4g RBSDV水稻病样用液氮碾磨，加入20ml的0.01MPBST缓冲液，混匀，放置15min后，8000g离心10min，取上清，4℃保存备用；将这些互作蛋白进行原核表达和诱导，诱导表达的蛋白进行SDS-PAGE分离，然后利用半干转移(15V，40min)将蛋白转移到硝酸纤维素膜上；将硝酸纤维素膜用0.01M PBST漂洗两次，每次5min；将膜浸于3％封闭液中，37℃振荡2h，以封闭非特异性蛋白结合位点；再将膜漂洗三次；用RBSDV粗提液覆盖硝酸纤维素膜，20℃轻摇振荡过夜；再将膜漂洗三次；将膜浸入3％封闭液稀释的RBSDV多克隆抗体(1：2000倍稀释)中，37℃振荡2h；再将膜漂洗三次；将膜浸入3％封闭液稀释的HRP标记的羊抗兔二抗中(以1：2000倍稀释)，37℃振荡1.5h；再将膜漂洗三次；将膜浸入HRP标记的底物显色液中，37℃反应至互作点显色清晰，迅速用去离子水冲洗，以终止反应，室温晾干膜，拍照记录。结果如图2所示。图2B中可见与图2A中表达蛋白对应位置有一特异条带，表明这些灰飞虱中的互作蛋白与RBSDV病毒粒子有互作关系。