一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103760346 A (43)申请公布日 2014.04.30 CN 103760346 A (21)申请号 201410034665.4 (22)申请日 2014.01.25 G01N 33/569(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 云南省农业科学院生物技术与种质 资源研究所 地址 650223 云南省昆明市学云路 9 号 (72)发明人 丁铭 卢训 张仲凯 (74)专利代理机构 昆明知道专利事务所 ( 特殊 普通合伙企业 ) 53116 代理人 姜开侠 (54) 发明名称 一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法 (57) 摘。

2、要 本发明公开了一种定量检测植物病毒的荧 光免疫斑点法， 是将待测样品研磨， 制备检测样 品上样液， 配制阳性、 阴性及空白对照上样液， 测出阳性对照上样液的病毒粒体平均数 d。将 2.02.5l 检测样品上样液、 阳性、 阴性及空白对 照上样液分别点在硝酸纤维素膜上， 将膜干燥后 封闭 0.81.2h， 依次加入稀释后的一抗、 二抗， 分 别反应 0.81.2h， 每次反应后洗膜 34 次， 每次 56min。将膜稍干燥后置于荧光分光光度计中检 测荧光强度 m， 按照下述公式计算检测样品上样 液中待检测病毒的粒体平均数 d。阳性对照上样 液 m 值 ： 阳性对照上样液 d 值 = 检测样品上。

3、样液 m 值 ： 检测样品上样液d值。 所述方法能够实现植物 病毒的灵敏准确、 快捷高效的定量分析， 推广应用 价值较高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103760346 A CN 103760346 A 1/2 页 2 1. 一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法， 其特征在于包括检测样品及试剂配制、 检测及定量分析工序， 具体包括 ： A、 检测样品及试剂配制 ： 按重量体积比 1 ： 2.53.5g/ml， 将 0.81.2g 待检测植物样品 加。

4、入磨样缓冲液中， 将植物样品磨碎备用， 作为检测样品上样液 ； 按体积比 1 ： 1000， 将提纯 的待检测植物病毒用磨样缓冲液稀释备用， 作为阳性对照上样液， 并于电镜下测算出阳性 对照上样液的病毒粒体平均数d ； 按重量体积比1:2.53.5g/ml， 将0.81.2g无待检测病毒 的植物样品加入磨样缓冲液中， 将植物样品磨碎备用， 作为阴性对照上样液 ； 空白对照上样 液即为磨样缓冲液 ； B、 检测 ： 将检测样品上样液 2.02.5l 点在硝酸纤维素膜上， 再将同样体积的阳性对 照上样液、 阴性对照上样液及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上， 将硝酸纤维素膜 干燥后， 置于容器内。

5、， 加入封闭液浸没 0.81.2h， 弃去封闭液， 加入用稀释缓冲液稀释的一 抗， 反应0.81.2h， 弃去一抗， 用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜34次， 每次56min， 再加入 用稀释缓冲液稀释的二抗， 反应 0.81.2h， 弃去二抗， 用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜 34 次， 每次 56min ； C、 定量分析 ： 将洗涤后的硝酸纤维素膜稍干燥， 置于荧光分光光度计中检测荧光强度 m， 按照下述公式即可算出检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数 d ： 阳性对照上样液 m 值 ： 阳性对照上样液 d 值 = 检测样品上样液 m 值 ： 检测样品上样液 d 值 其中， 阳性对照上样液 。

6、d= N1+N2+N3+Ny/y ； y ： 电镜下观察视野的个数 ； N ： 第 y 个观察视野中的病毒粒体数。 2. 根据权利要求 1 所述的荧光免疫斑点法， 其特征在于所述的磨样缓冲液为加入 0.01% 吐温 20 的 pH 为 7.0 的 PBST， 稀释缓冲液为 pH 为 7.0 的 PBST， 洗涤缓冲液为加入 0.01% 吐温 20 的 pH 为 7.0 的 PBST。 3. 根据权利要求 1 所述的荧光免疫斑点法， 其特征在于步骤 B 所述的封闭液为用稀释 缓冲液配制的质量百分比为 46% 的脱脂奶粉。 4. 根据权利要求 1 所述的荧光免疫斑点法， 其特征在于步骤 B 所述的。

7、将硝酸纤维素膜 干燥， 指的是将硝酸纤维素膜置于室温下自然干燥， 或是将硝酸纤维素膜置于 37培养箱 中干燥。 5. 根据权利要求 1 所述的荧光免疫斑点法， 其特征在于步骤 B 所述的将硝酸纤维素膜 干燥后， 置于容器内， 加入封闭液浸没， 指的是将硝酸纤维素膜置于容器中， 加入 520ml 封 闭液， 淹没硝酸纤维素膜， 再将容器置于 37培养箱中封闭 0.81.2h。 6. 根据权利要求 1 所述的荧光免疫斑点法， 其特征在于步骤 B 所述的用稀释缓冲液稀 释的一抗， 指的是用稀释缓冲液按体积比 1:1001000000 倍稀释的一抗， 所述的用稀释缓 冲液稀释的二抗， 指的是用稀释缓冲。

8、液按体积比 1:10010000 倍稀释的二抗。 7. 根据权利要求 1 所述的荧光免疫斑点法， 其特征在于步骤 B 所述的加入用稀释缓 冲液稀释的一抗， 反应 0.81.2h， 指的是加入 520ml 用稀释缓冲液稀释的一抗， 淹没硝酸 纤维素膜， 置于 37培养箱中反应 0.81.2h ； 所述的加入用稀释缓冲液稀释的二抗， 反应 0.81.2h， 指的是加入 520ml 用稀释缓冲液稀释的二抗， 淹没硝酸纤维素膜， 置于 37培 权 利 要 求 书 CN 103760346 A 2 2/2 页 3 养箱中反应 0.81.2h。 8. 根据权利要求 1 所述的荧光免疫斑点法， 其特征在于步。

9、骤 B 所述的用洗涤缓冲液洗 涤硝酸纤维素膜， 指的是用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜 34 次， 每次均置于水平摇床上 振荡洗涤 56min。 9. 根据权利要求 1 所述的荧光免疫斑点法， 其特征在于步骤 C 所述的将洗涤后的硝酸 纤维素膜稍干燥， 指的是将洗涤后的硝酸纤维素膜用吸湿性材料吸干。 10.根据权利要求1所述的荧光免疫斑点法， 其特征在于步骤C所述的荧光分光光度计 为美国 Thermo Scientific 公司制造的 Lumina 型号荧光分光光度计。 权 利 要 求 书 CN 103760346 A 3 1/5 页 4 一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法 技术领域 0001 。

10、本发明属于植物病毒定量检测技术领域， 具体涉及一种定量检测植物病毒的荧光 免疫斑点法。 背景技术 0002 斑点免疫结合法 （DIBA） 是一种以硝基纤维素薄膜为固相载体进行抗原抗体 免疫学反应的检测和鉴定植物病毒的基础性方法。 该方法具有灵敏度高， 准确性好， 操作简 便快捷等优点， 但也存在着一些弊端 ： 首先， 判断阴、 阳性反应只能靠目测， 所以在色差较小 的样品中， 就可能造成错判或漏判 ； 其次， 阳性反应的颜色差异虽然从一定程度上反映了阳 性样品中病毒的多少， 但仍无法实现真正的定量检测。荧光标记技术是利用能发荧光的物 质通过共价结合或物理吸附在所要研究的分子的某个基团上， 利用。

11、它的荧光特性来提供被 研究对象的信息的一种手段。若将斑点免疫结合法与荧光标记技术联合应用， 利用荧光显 色技术减少斑点免疫结合法的定性误差， 提高其定量准确性， 对于实现植物病毒灵敏准确、 快捷高效的定量分析将具有十分重要的现实意义和推广应用价值。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法。 0004 本发明的目的是这样实现的， 一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法， 包括检 测样品及试剂配制、 检测及定量分析工序， 具体包括 ： A、 检测样品及试剂配制 ： 按重量体积比 1 ： 2.53.5g/ml， 将 0.81.2g 待检测植物样品 加入磨样缓冲液中。

12、， 将植物样品磨碎备用， 作为检测样品上样液 ； 按体积比 1 ： 1000， 将提纯 的待检测植物病毒用磨样缓冲液稀释备用， 作为阳性对照上样液， 并于电镜下测算出阳性 对照上样液的病毒粒体平均数d ； 按重量体积比1:2.53.5g/ml， 将0.81.2g无待检测病毒 的植物样品加入磨样缓冲液中， 将植物样品磨碎备用， 作为阴性对照上样液 ； 空白对照上样 液即为磨样缓冲液 ； B、 检测 ： 将检测样品上样液 2.02.5l 点在硝酸纤维素膜上， 再将同样体积的阳性对 照上样液、 阴性对照上样液及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上， 将硝酸纤维素膜 干燥后， 置于容器内， 加入封闭液。

13、浸没 0.81.2h， 弃去封闭液， 加入用稀释缓冲液稀释的一 抗， 反应0.81.2h， 弃去一抗， 用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜34次， 每次56min， 再加入 用稀释缓冲液稀释的二抗， 反应 0.81.2h， 弃去二抗， 用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜 34 次， 每次 56min ； C、 定量分析 ： 将洗涤后的硝酸纤维素膜稍干燥， 置于荧光分光光度计中检测荧光强度 m， 按照下述公式即可算出检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数 d ： 阳性对照上样液 m 值 ： 阳性对照上样液 d 值 = 检测样品上样液 m 值 ： 检测样品上样液 d 值 其中， 阳性对照上样液 d= N1+N。

14、2+N3+Ny/y ； 说 明 书 CN 103760346 A 4 2/5 页 5 y ： 电镜下观察视野的个数 ； N ： 第 y 个观察视野中的病毒粒体数。 0005 本发明所述方法将斑点免疫结合法与荧光标记技术联合应用， 利用荧光显色技术 避免了斑点免疫结合法可能出现的假阳性干扰， 通过对固相支持物及底物的选择， 进一步 减少了定性误差， 有效提高了定量准确性， 对于实现植物病毒灵敏准确、 快捷高效的定量分 析具有十分重要的现实意义和较高的推广应用价值。 具体实施方式 0006 下面对本发明作进一步的说明， 但不以任何方式对本发明加以限制， 基于本发明 教导所作的任何变换或替换， 均属。

15、于本发明的保护范围。 0007 本发明所述的定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法， 包括检测样品及试剂配制、 检测及定量分析工序， 具体包括 ： A、 检测样品及试剂配制 ： 按重量体积比 1 ： 2.53.5g/ml， 将 0.81.2g 待检测植物样品 加入磨样缓冲液中， 将植物样品磨碎备用， 作为检测样品上样液 ； 按体积比 1 ： 1000， 将提纯 的待检测植物病毒用磨样缓冲液稀释备用， 作为阳性对照上样液， 并于电镜下测算出阳性 对照上样液的病毒粒体平均数d ； 按重量体积比1:2.53.5g/ml， 将0.81.2g无待检测病毒 的植物样品加入磨样缓冲液中， 将植物样品磨碎备用， 作。

16、为阴性对照上样液 ； 空白对照上样 液即为磨样缓冲液 ； B、 检测 ： 将检测样品上样液 2.02.5l 点在硝酸纤维素膜上， 再将同样体积的阳性对 照上样液、 阴性对照上样液及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上， 将硝酸纤维素膜 干燥后， 置于容器内， 加入封闭液浸没 0.81.2h， 弃去封闭液， 加入用稀释缓冲液稀释的一 抗， 反应0.81.2h， 弃去一抗， 用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜34次， 每次56min， 再加入 用稀释缓冲液稀释的二抗， 反应 0.81.2h， 弃去二抗， 用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜 34 次， 每次 56min ； C、 定量分析 ： 将洗涤后的硝酸纤。

17、维素膜稍干燥， 置于荧光分光光度计中检测荧光强度 m， 按照下述公式即可算出检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数 d ： 阳性对照上样液 m 值 ： 阳性对照上样液 d 值 = 检测样品上样液 m 值 ： 检测样品上样液 d 值 其中， 阳性对照上样液 d= N1+N2+N3+Ny/y ； y ： 电镜下观察视野的个数 ； N ： 第 y 个观察视野中的病毒粒体数。 0008 所述的磨样缓冲液为加入 0.01% 吐温 20 的 pH 为 7.0 的 PBST， 稀释缓冲液为 pH 为 7.0 的 PBST， 洗涤缓冲液为加入 0.01% 吐温 20 的 pH 为 7.0 的 PBST。 00。

18、09 步骤 A 所述的植物样品可以为植物的叶、 花、 果或茎中的任一种。 0010 步骤 A 所述的将植物样品磨碎备用， 指的是将植物样品置于加厚的自封袋中， 用 研钵棒磨出汁液即可， 但保证所有组织都研磨到。 0011 步骤 A 所述的测算出阳性对照上样液的病毒粒体平均数 d， 指的是在电子显微镜 下观察阳性对照上样液的 y 个视野， 数取每个视野的病毒粒体数 N， 用下述公式计算出 y 个 视野的病毒粒体平均数 d。 说 明 书 CN 103760346 A 5 3/5 页 6 0012 d= N1+N2+N3+Ny/y y ： 电镜下观察视野的个数 ； N ： 第 y 个观察视野中的病毒。

19、粒体数。 0013 y 值取 2535 即可， 优选取 30。 0014 步骤 B 所述的将检测样品上样液、 阳性对照上样液、 阴性对照上样液及空白对照 上样液分别点在硝酸纤维素膜上， 指的是用移液器吸取 2.02.5l 检测样品上样液点在 硝酸纤维素膜上， 然后用移液器吸取同样体积的阳性对照上样液点在检测样品上样液的旁 边， 再依次将同样体积的阴性对照上样液点在阳性对照上样液的旁边， 将空白对照上样液 点在阴性对照上样液的旁边。 0015 步骤 B 所述的封闭液为用稀释缓冲液配制的质量百分比为 46% 的脱脂奶粉。 0016 步骤 B 所述的将硝酸纤维素膜干燥， 指的是将硝酸纤维素膜置于室温。

20、下自然干 燥， 或是将硝酸纤维素膜置于 37培养箱中干燥。 0017 所述的室温为 2025。 0018 步骤 B 所述的将硝酸纤维素膜干燥后， 置于容器内， 加入封闭液浸没， 指的是将硝 酸纤维素膜置于容器中， 加入 520ml 封闭液， 淹没硝酸纤维素膜， 再将容器置于 37培养 箱中封闭 0.81.2h。 0019 所述的容器为培养皿。 0020 所述的加入 520ml 封闭液， 淹没硝酸纤维素膜， 指的是直径为 6cm 的培养皿加入 5ml ； 直径为 9 cm 的培养皿加入 15ml ； 直径为 12 cm 的培养皿加入 20ml， 即按需加入， 要求 能淹没硝酸纤维素膜即可。 00。

21、21 步骤 B 所述的用稀释缓冲液稀释的一抗， 指的是用稀释缓冲液按体积比 1:1001000000 倍稀释的一抗 （不同病毒， 它的一抗的稀释稀释效价不同， 稀释倍数根 据实际病毒确定） ， 所述的用稀释缓冲液稀释的二抗， 指的是用稀释缓冲液按体积比 1:1001000000 倍稀释的二抗 （二抗， 不同公司生产的， 它的稀释效价不同， 稀释倍数根据实 际情况确定） 。 0022 步骤 B 所述的加入用稀释缓冲液稀释的一抗， 反应 0.81.2h， 指的是加入 520ml 用稀释缓冲液稀释的一抗， 淹没硝酸纤维素膜， 置于 37培养箱中反应 0.81.2h ； 所述的 加入用稀释缓冲液稀释的。

22、二抗， 反应 0.81.2h， 指的是加入 520ml 用稀释缓冲液稀释的二 抗， 淹没硝酸纤维素膜， 置于 37培养箱中反应 0.81.2h。 0023 所述的加入 520ml 用稀释缓冲液稀释的一抗或二抗， 淹没硝酸纤维素膜， 指的是 直径为 6cm 的培养皿加入 5ml ； 直径为 9 cm 的培养皿加入 15ml ； 直径为 12 cm 的培养皿加 入 20ml， 即按需加入， 要求能淹没硝酸纤维素膜即可。 0024 步骤 B 所述的用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜， 指的是用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤 维素膜 34 次， 每次均置于水平摇床上振荡洗涤 56min。 0025 步骤 C 所述的将。

23、洗涤后的硝酸纤维素膜稍干燥， 指的是将洗涤后的硝酸纤维素膜 用吸湿性材料吸干。 0026 所述的吸湿性材料为滤纸。 0027 步骤 C 所述的荧光分光光度计为美国 Thermo Scientific 公司制造的 Lumina 型 号荧光分光光度计。 说 明 书 CN 103760346 A 6 4/5 页 7 0028 步骤 C 所述的荧光分光光度计的检测条件为 ： 波长范围 ： 190-900nm ； 光源 ： 150W 无臭氧氙灯。 0029 步骤 C 所述的将洗涤后的硝酸纤维素膜稍干燥， 置于荧光分光光度计中检测荧光 强度 m， 对检测结果的评判标准如下 ： （1） 当阳性对照上样液有荧。

24、光读数， 阴性对照上样液和空白对照上样液没有荧光读数 时， 检测即为成功。 0030 （2） 当检测样品上样液有荧光读数时， 可判断为阳性样品， 没有荧光读数时， 可判 断为阴性样品。即在荧光分光光度计的读数中， 阴性反应的读数应为 0， 而阳性反应的读数 应大于 0。 0031 （3） 若检测样品上样液为阳性样品， 则按照下述公式算出检测样品上样液中待检 测病毒的粒体数 d ： 阳性对照上样液 m 值 ： 阳性对照上样液 d 值 = 检测样品上样液 m 值 ： 检测样品上样液 d 值 其中， 阳性对照上样液 d= N1+N2+N3+Ny/y ； y ： 电镜下观察视野的个数 ； N ： 第 。

25、y 个观察视野中的病毒粒体数。 0032 实施例 1 烟草叶片样品中烟草花叶病毒 （Tobacco mosaic virus， TMV） 的检测 所用试剂如下 ： 磨样缓冲液 ： 加入 0.01% 吐温 20 的 pH 为 7.0 的 PBST。 0033 稀释缓冲液 ： pH 为 7.0 的 PBST。 0034 洗涤缓冲液 ： 加入 0.01% 吐温 20 的 pH 为 7.0 的 PBST。 0035 封闭液 ： 用稀释缓冲液配制的质量百分比为 5% 的脱脂奶粉。 0036 一抗 ： TMV 兔源抗体 二抗 ： 荧光素标记的羊抗兔 A、 检测样品及试剂配制 ： 按重量体积比 1 ： 3.。

26、0g/ml， 将 1.0g 待检测烟叶加入磨样缓冲 液中， 将烟叶样品置于加厚的自封袋中， 用研钵棒磨出汁液 （保证所有烟叶组织都研磨到） 作为检测样品上样液。按体积比 1 ： 1000， 将提纯的 TMV 用磨样缓冲液稀释备用， 作为阳性 对照上样液， 在电子显微镜下观察阳性对照上样液的 30 个视野， 数取每个视野的病毒粒体 数 N， 如表 1 所示。用下述公式计算出 30 个视野的病毒粒体平均数 d。 0037 d= N1+N2+N3+N30/30=524/30 17 表 1 30 个视野中的病毒粒体数 视野N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10 病毒粒体数1318211513131。

27、9171519 视野N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20 病毒粒体数21141715181920232015 视野N21N22N23N24N25N26N27N28N29N30 病毒粒体数17161713181421231921 按重量体积比1:3.0g/ml(即1g加入3ml)， 将1.0g无TMV的健康烟叶样品加入磨样缓 冲液中， 将烟叶样品磨碎备用， 作为阴性对照上样液。空白对照上样液即为磨样缓冲液。 0038 B、 检测 ： 用移液器吸取检测样品上样液 2.5l 点在硝酸纤维素膜上， 再将同样体 说 明 书 CN 103760346 A 7 5/5 页 8 积的阳。

28、性对照上样液、 阴性对照上样液及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上。将硝 酸纤维素膜置于 37培养箱中彻底干燥， 然后置于直径为 6cm 的培养皿中， 加入 5ml 封闭 液， 再将培养皿置于 37培养箱中封闭 1.0h。弃去封闭液， 加入 5ml 用稀释缓冲液稀释的 一抗， 置于 37培养箱中反应 1.0h。弃去一抗， 用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜 3 次， 每次 均置于水平摇床上振荡洗涤 5min。接着加入 5ml 用稀释缓冲液稀释的二抗， 置于 37培养 箱中反应1.0h。 弃去二抗， 用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3次， 每次均置于水平摇床上振 荡洗涤 5min。 0039 C、 定量。

29、分析 ： 将洗涤后的硝酸纤维素膜用滤纸吸干， 置于美国Thermo Scientific 公司制造的Lumina型号荧光分光光度计中检测荧光强度m。 具体参数设定如下 ： 激发波长 ： 490nm， 发射波长 ： 520nm， 激发狭缝 ： 10nm， 发射狭缝 ： 10nm， 积分时间 ： 0.1s， 激发滤光片 ： 自 动， 发射滤光片 ： 自动， 检测器电压 ： 400v。 0040 对检测结果的评判标准如下 ： （1） 当阳性对照上样液有荧光读数， 阴性对照上样液和空白对照上样液没有荧光读数 时， 检测即为成功。 0041 （2） 当检测样品上样液有荧光读数时， 可判断为阳性样品， 没。

30、有荧光读数时， 可判 断为阴性样品。即在荧光分光光度计的读数中， 阴性反应的读数应为 0， 而阳性反应的读数 应大于 0。 0042 （3） 若检测样品上样液为阳性样品， 则按照下述公式算出检测样品上样液中待检 测病毒的粒体平均数 d。 0043 检测结果如表 2 所示。 0044 表 2 荧光分光光度计检测结果 样品荧光读数 阳性对照上样液945.726 阴性对照上样液000.000 空白对照上样液000.000 检测样品上样液832.314 根据 ： 阳性对照上样液 m 值 ： 阳性对照上样液 d 值 = 检测样品上样液 m 值 ： 检测样品上 样液 d 值 即 ： 945.726:17=832.314 ： 检测样品上样液 d 值 检测样品上样液 d 15 计算结果表明 ： 检测样品上样液的 30 个电镜视野中平均有 15 个 TMV 病毒粒子。 说 明 书 CN 103760346 A 8 。