气相色谱质谱检测细胞内外液中糖的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103713074 A (43)申请公布日 2014.04.09 CN 103713074 A (21)申请号 201310645463.9 (22)申请日 2013.12.05 G01N 30/88(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (71)申请人 柳州联海科技有限公司 地址 544130 广西壮族自治区柳州市高新一 路 15 号信息产业园 A 栋 2 楼 A2-27 号 (72)发明人 陈东 梁远雄 (74)专利代理机构 广西南宁汇博专利代理有限 公司 45114 代理人 邓晓安 (54) 发明名称 气相色谱 - 质谱检测细胞内外液中糖的方。

2、法 (57) 摘要 本发明涉及一种气相色谱 - 质谱检测细胞内 外液中糖的方法， 属于生物化学检验测定技术领 域。本发明检测方法步骤包括 ：（1） 取发酵液， 高 速离心， 分别收集细胞和细胞外液 ；（2） 细胞内代 谢物样品制备， 将收集的菌体用生理盐水清洗， 冷 甲醇溶解后超声破碎， 低温萃取， 离心收集萃取 上清液， 加入内标物， 低温真空烘干 ；（3） 细胞外 液样品制备， 用乙腈除去胞外液中蛋白， 涡旋振 荡， 再离心收集上清， 加入内标物， 低温真空烘干 ； （4） 样品衍生， 加入糖衍生剂、 氨基酸衍生剂 ；（5） 气相色谱 - 质谱分析和数据采集。本发明具有样 品处理简单， 操。

3、作简便， 检测时间短， 灵敏度高， 检 测结果重复性高， 可实现多个样品制备等优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103713074 A CN 103713074 A 1/1 页 2 1. 一种气相色谱 - 质谱检测细胞内外液中糖的方法， 其特征在于， 检测方法步骤包括 ： （1） 取发酵液， 高速离心， 分别收集菌体和上清液 ； （2） 细胞内代谢物样品制备 ： 取步骤 1） 得到的菌体， 用生理盐水清洗 23 次， 冷甲醇 溶解后超声破碎至细胞裂。

4、解， 得到裂解液， 低温萃取裂解液， 离心收集 50200ul 萃取后 裂解上清液， 加入内标物核糖醇溶液， 裂解上清液体积与内标物核糖醇重量比例为 50200ul:20g， 室温真空烘干， 得到细胞内代谢物样品 ； （3） 细胞外液样品制备 ： 取 60350ul 步骤 1） 得到的上清液， 在清液中加入乙腈除 去蛋白， 上清液与乙腈体积比为 1:0.51.5， 涡旋振荡， 再离心收集上清液， 加入内标物 核糖醇溶液， 上清液体积与内标物核糖醇重量比例为 50300ul ： 20g， 室温真空烘干， 得到细胞外液样品 ； （4） 样品衍生 ： 在步骤 2） 和步骤 3） 得到的样品和样品中，。

5、 分别加入 50150ul 糖 衍生剂， 恒温放置 1.54h， 再分别加入 50150ul 氨基酸衍生剂， 恒温放置过夜， 衍生完毕， 分别离心衍生后的样品和样品， 对应收集各自上清得到待测胞内样品和待测胞外样 品 ； （5） 利用气相色谱 - 质谱对步骤 4） 得到的待测胞内样品和待测胞外样品， 分别进 行分析和数据采集。 2. 根据权利要求 1 所述的一种气相色谱 - 质谱检测细胞内外液中糖的方法， 其特征在 于， 所述菌体其取样量为用冷甲醇溶解后生物量干重达 0.21.0g/ml ； 所述的冷甲醇为经 过冷浴槽预冷至 -40 ； 所述低温萃取为 -40至 -50下萃取 27h。 3. 。

6、根据权利要求 1 或 2 所述的一种气相色谱 - 质谱检测细胞内外液中糖的方法， 其特 征在于， 所述糖衍生剂为 0.10.3mg 甲氧胺盐酸溶于 10ml 吡啶溶液中配制而得 ； 所述氨基 酸衍生剂为 50200ul 三甲基氯硅烷溶于 10ml 的三氟乙酰胺中。 4. 根据权利要求 3 所述的一种气相色谱 - 质谱检测细胞内外液中糖的方法， 其特征在 于， 所述气相色谱-质谱其仪器分析条件为 ： 气相色谱 ： 色谱柱为30 m0.25 mm的HP-5MS 或者 DB-5MS 毛细管柱， 进样口温度 300， 检测器温度 250， 柱箱升温程序平衡时间 3 min 80维持 1min 2 /m。

7、in 升温至 100 15 /min 升温至 220 30 /min 升 温至 300 300维持 3 min， 进样体积 1L ； 质谱 ： 离子源 EI， 检测器为四级杆， 电离能 70 eV， 离子源表面温度 280。 5.根据权利要求4所述一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中糖的方法， 其特征在于， 该方法应用于检测酵母菌、 乳酸菌、 梭菌、 霉菌的生物发酵过程中的发酵液细胞内外液中的 糖。 6.根据权利要求12或45任一项所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中糖的 方法， 其特征在于， 所述糖为葡萄糖、 果糖、 木糖。 7. 根据权利要求 3 所述的一种气相色谱 - 质谱检测细胞内外。

8、液中糖的方法， 其特征在 于， 所述糖为葡萄糖、 果糖、 木糖。 权 利 要 求 书 CN 103713074 A 2 1/5 页 3 气相色谱 - 质谱检测细胞内外液中糖的方法 技术领域 0001 本发明属于生物化学检验测定技术领域， 特别是涉及一种气相色谱 - 质谱检测细 胞内外液中糖的方法。 背景技术 0002 在利用气相色谱 - 质谱检测糖代谢物方面， 目前已有相关技术报道， 如专利 201210046953.2， 公布了一种气相色谱质谱检测尿糖的方法， 包括如下步骤 ：（1） 对待检 尿液样本完成尿酶处理 ；（2） 加入内标品， 采用冷冻乙醇进行沉淀蛋白的处理， 将样本吹 干 ；（3。

9、） 对上述样本进行甲基硅烷化衍生处理 ；（4） 采用上述 1-3 的步骤处理标准糖， 得到 标准糖样本 ；（5） 采用气相色谱质谱联用仪对标准糖样本和待检尿液样本进行检测 ；（6） 以标准糖样本的检测结果作为参比曲线， 用常规算法对待检尿液样本的糖进行定量。该专 利发明主要应用领域为尿样检测， 且该检测方法仅局限于糖代谢物的检测。 0003 对于发酵液中微生物胞内、 胞外代谢物的检测研究， 可以揭示微生物在发酵条件 下的代谢规律， 尤其是发酵条件对于微生物目标产物的影响规律。掌握微生物的代谢规律 可以不仅有利的促进目标产物的产量提升， 而且可确定菌体内的代谢通量分布， 进而利用 基因工程手段实。

10、现菌体内代谢途径的优化与重构， 实现目标产物高效生物合成。 0004 目前对于发酵液中的代谢物分析检测方法局限用于特定某类物质， 不可实现多类 代谢物同时检测。 由于发酵液中各成分含量复杂多样， 对于样品的处理方法很关键， 目前还 没有相关发酵液中细胞内、 细胞外代谢物的系统处理检测方法， 使得开发一种更为灵敏的、 广谱的、 通用的发酵代谢物检测方法， 鉴定各种谱峰对映的化合物结构， 以及与其它虚拟模 型的整合， 成为微生物代谢组研究的热点。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种气相色谱 - 质谱检测细胞内外液中糖的方法， 弥补目前 在微生物发酵中对代谢物系统检测方法的空白， 克服现有检。

11、测技术干扰因素很多、 操作繁 琐、 测试成本高、 灵敏度低、 检测范围窄等缺点。 0006 本发明的方案是通过这样实现的 ： 一种气相色谱 - 质谱检测细胞内外液中糖的方 法， 其特征在于， 检测方法步骤包括 ： （1） 取发酵液， 高速离心， 分别收集菌体和上清液。 0007 （2） 细胞内代谢物样品制备 ： 取步骤 1） 得到的菌体， 用生理盐水清洗 23 次， 冷 甲醇溶解后超声破碎至细胞裂解， 得到裂解液， 低温萃取裂解液， 离心收集 50200ul 萃取 后裂解上清液， 加入内标物核糖醇溶液， 裂解上清液体积与内标物核糖醇重量比例为 50200ul:20g， 室温真空烘干， 得到细胞。

12、内代谢物样品。 0008 （3） 细胞外液样品制备 ： 取 60350ul 步骤 1） 得到的上清液， 在清液中加入乙 腈除去蛋白， 上清液与乙腈体积比为 1:0.51.5， 涡旋振荡， 再离心收集上清液， 加入内 标物核糖醇溶液， 上清液体积与内标物核糖醇重量比例为 50300ul ： 20g， 室温真空烘 说 明 书 CN 103713074 A 3 2/5 页 4 干， 得到细胞外液样品。 0009 （4） 样品衍生 ： 在步骤 2） 和步骤 3） 得到的样品和样品中， 分别加入 50150ul 糖衍生剂， 恒温放置 1.54h， 再分别加入 50150ul 氨基酸衍生剂， 恒温放置过夜。

13、， 衍生完 毕， 分别离心衍生后的样品和样品， 对应收集各自上清得到待测胞内样品和待测胞 外样品。 0010 （5） 利用气相色谱 - 质谱对步骤 4） 得到的待测胞内样品和待测胞外样品， 分 别进行分析和数据采集。 0011 作为本发明的进一步改进， 所述菌体其取样量为用冷甲醇溶解后生物量干重达 0.21.0g/ml ； 所述的冷甲醇为经过冷浴槽预冷至 -40； 所述低温萃取为 -40至 -50下 萃取 27h。 0012 作为本发明的进一步改进， 所述糖衍生剂为0.10.3mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶 溶液中配制而得 ； 所述氨基酸衍生剂为50200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰。

14、胺中。 0013 作为本发明的进一步改进， 所述气相色谱 - 质谱其仪器分析条件为 ： 气相色谱 ： 色 谱柱为 30 m0.25 mm 的 HP-5MS 或者 DB-5MS 毛细管柱， 进样口温度 300， 检测器温度 250， 柱箱升温程序平衡时间 3 min 80维持 1min 2 /min 升温至 100 15 / min 升温至 220 30 /min 升温至 300 300维持 3 min， 进样体积 1L ； 质谱 ： 离 子源 EI， 检测器为四级杆， 电离能 70 eV， 离子源表面温度 280。 0014 作为本发明的进一步改进， 该方法应用于检测酵母菌、 乳酸菌、 梭菌、。

15、 霉菌的生物 发酵过程中的发酵液中细胞内外液的糖。 0015 作为本发明的进一步改进， 所述糖为葡萄糖、 果糖、 木糖。 0016 本发明的实质性特点和显著进步是 ：（1） 该方法可以同步检测发酵液中细胞内和 细胞外中糖类物质的检测， 不需要对发酵液进行多次复杂处理， 节约时间和简化操作步骤， 及时得到发酵过程中微生物代谢规律， 分析胞内外代谢流量。 （2） 该方法采用冷甲醇萃取细 胞内代谢物法， 其萃取效果优良， 获得细胞内较多代谢物种类， 有利于代谢规律的分析。 （3） 样品分析得到的色谱峰分析效果良好， 可对葡萄糖、 果糖、 木糖等糖实现检测。 具体实施方式 0017 下面将通过实施例对。

16、本发明一种气相色谱 - 质谱检测细胞内外液中糖的方法进 一步的描述， 这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。 0018 以下实施例中离心条件为 ： -4下 10000 rpm 离心 10 min。 0019 以下实施例中气相色谱 - 质谱其仪器分析条件为 ： 气相色谱 ： 色谱柱为 30 m0.25 mm 的 HP-5MS 或者 DB-5MS 毛细管柱， 进样口温度 300， 检测器温度 250， 柱箱 升温程序平衡时间 3 min 80维持 1min 2 /min 升温至 100 15 /min 升温至 22030/min升温至300300维持3 min， 进样体积1L ； 质谱 ： 离。

17、子源EI， 检测 器为四级杆， 电离能 70 eV， 离子源表面温度 280。 0020 以下实施例皆可实现对葡萄糖、 果糖、 木糖等糖进行检测。 0021 实施例 1 取酵母菌发酵液。 说 明 书 CN 103713074 A 4 3/5 页 5 0022 （1） 细胞内代谢物样品制备 ： 取 5ml 发酵液， 离心得到菌体， 用生理盐水清洗菌体 2 次， -40冷甲醇溶解后生物量干重达 0.2g/ml， 超声破碎至细胞裂解， 得到裂解液， 低温萃 取裂解液， 低温条件为 ： -40至 -50下萃取 4h， 离心收集 150ul 萃取后裂解上清液， 加 入内标物核糖醇溶液， 裂解上清液体积与。

18、内标物核糖醇重量比例为 150ul:20g， 室温真 空烘干， 得到细胞内代谢物样品。 0023 （2） 细胞外液样品制备 ： 取发酵液， 离心得到上清液， 取 300ul 上清液， 在清液 中加入乙腈除去蛋白， 上清液与乙腈体积比为 1:1.2， 涡旋振荡， 再离心收集得上清液 ， 加入内标物核糖醇溶液， 上清液体积与内标物核糖醇重量比例为 100ul ： 20g， 室温 真空烘干， 得到细胞外液样品。 0024 （3） 样品衍生 ： 在步骤 1） 和步骤 2） 得到的样品和样品中， 分别加入 100ul 糖 衍生剂 （糖衍生剂为 0.1mg 甲氧胺盐酸溶于 10ml 吡啶溶液中配制而得） 。

19、， 恒温放置 1.5h， 再 分别加入 100ul 氨基酸衍生剂 （氨基酸衍生剂为 100ul 三甲基氯硅烷溶于 10ml 的三氟乙酰 胺中配制而得） ， 恒温放置过夜， 衍生完毕， 分别离心衍生后的样品和样品， 对应收集各 自上清得到待测胞内样品和待测胞外样品。 0025 （4） 按照气相色谱 - 质谱其仪器分析条件， 对待测胞内样品和待测胞外样品 进行分析和数据采集。 0026 实施例 2 取乳酸菌发酵液。 0027 （1） 细胞内代谢物样品制备 ： 取 5ml 发酵液， 离心得到菌体， 用生理盐水清洗菌体 3 次， -40冷甲醇溶解后生物量干重达 1.0g/ml， 超声破碎至细胞裂解， 。

20、得到裂解液， 低温萃 取裂解液， 低温条件为 ： -40至 -50下萃取 5h， 离心收集 100ul 萃取后裂解上清液， 加 入内标物核糖醇溶液， 裂解上清液体积与内标物核糖醇重量比例为 100ul:20g， 室温真 空烘干， 得到细胞内代谢物样品。 0028 （2） 细胞外液样品制备 ： 取发酵液， 离心得到上清液， 取 350ul 上清液， 在清液 中加入乙腈除去蛋白， 上清液与乙腈体积比为 1:0.7， 涡旋振荡， 再离心收集得上清液 ， 加入内标物核糖醇溶液， 上清液体积与内标物核糖醇重量比例为 200ul ： 20g， 室温 真空烘干， 得到细胞外液样品。 0029 （3） 样品衍。

21、生 ： 在步骤 1） 和步骤 2） 得到的样品和样品中， 分别加入 50ul 糖 衍生剂 （糖衍生剂为 0.3mg 甲氧胺盐酸溶于 10ml 吡啶溶液中配制而得） ， 恒温放置 2.0h， 再 分别加入 150ul 氨基酸衍生剂 （氨基酸衍生剂为 150ul 三甲基氯硅烷溶于 10ml 的三氟乙酰 胺中配制而得） ， 恒温放置过夜， 衍生完毕， 分别离心衍生后的样品和样品， 对应收集各 自上清得到待测胞内样品和待测胞外样品。 0030 （4） 按照气相色谱 - 质谱其仪器分析条件， 对待测胞内样品和待测胞外样品 进行分析和数据采集。 0031 实施例 3 取梭菌发酵液。 0032 （1） 细胞。

22、内代谢物样品制备 ： 取 5ml 发酵液， 离心得到菌体， 用生理盐水清洗菌体 3 次， -40冷甲醇溶解后生物量干重达 0.6g/ml， 超声破碎至细胞裂解， 得到裂解液， 低温萃 取裂解液， 低温条件为 ： -40至 -50下萃取 3h， 离心收集 200ul 萃取后裂解上清液， 加 说 明 书 CN 103713074 A 5 4/5 页 6 入内标物核糖醇溶液， 裂解上清液体积与内标物核糖醇重量比例为 200ul:20g， 室温真 空烘干， 得到细胞内代谢物样品。 0033 （2） 细胞外液样品制备 ： 取发酵液， 离心得到上清液， 取 60ul 上清液， 在清液 中加入乙腈除去蛋白，。

23、 上清液与乙腈体积比为 1:1.5， 涡旋振荡， 再离心收集得上清液 ， 加入内标物核糖醇溶液， 上清液体积与内标物核糖醇重量比例为 50ul ： 20g， 室温 真空烘干， 得到细胞外液样品。 0034 （3） 样品衍生 ： 在步骤 1） 和步骤 2） 得到的样品和样品中， 分别加入 150ul 糖 衍生剂 （糖衍生剂为0.15mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得） ， 恒温放置2.5h， 再 分别加入 50ul 氨基酸衍生剂 （氨基酸衍生剂为 200ul 三甲基氯硅烷溶于 10ml 的三氟乙酰 胺中配制而得） ， 恒温放置过夜， 衍生完毕， 分别离心衍生后的样品和样品， 对应收集各。

24、 自上清得到待测胞内样品和待测胞外样品。 0035 （4） 按照气相色谱 - 质谱其仪器分析条件， 对待测胞内样品和待测胞外样品 进行分析和数据采集。 0036 实施例 4 取霉菌发酵液。 0037 （1） 细胞内代谢物样品制备 ： 取 5ml 发酵液， 离心得到菌体， 用生理盐水清洗菌体 2 次， -40冷甲醇溶解后生物量干重达 0.8g/ml， 超声破碎至细胞裂解， 得到裂解液， 低温萃 取裂解液， 低温条件为 ： -40至-50下萃取2h， 离心收集50ul萃取后裂解上清液， 加入 内标物核糖醇溶液， 裂解上清液体积与内标物核糖醇重量比例为 50ul:20g， 室温真空 烘干， 得到细胞。

25、内代谢物样品。 0038 （2） 细胞外液样品制备 ： 取发酵液， 离心得到上清液， 取 200ul 上清液， 在清液 中加入乙腈除去蛋白， 上清液与乙腈体积比为 1:1.0， 涡旋振荡， 再离心收集得上清液 ， 加入内标物核糖醇溶液， 上清液体积与内标物核糖醇重量比例为 150ul ： 20g， 室温 真空烘干， 得到细胞外液样品。 0039 （3） 样品衍生 ： 在步骤 1） 和步骤 2） 得到的样品和样品中， 分别加入 120ul 糖 衍生剂 （糖衍生剂为 0.2mg 甲氧胺盐酸溶于 10ml 吡啶溶液中配制而得） ， 恒温放置 3.0h， 再 分别加入 80ul 氨基酸衍生剂 （氨基酸。

26、衍生剂为 50ul 三甲基氯硅烷溶于 10ml 的三氟乙酰胺 中配制而得） ， 恒温放置过夜， 衍生完毕， 分别离心衍生后的样品和样品， 对应收集各自 上清得到待测胞内样品和待测胞外样品。 0040 （4） 按照气相色谱 - 质谱其仪器分析条件， 对待测胞内样品和待测胞外样品 进行分析和数据采集。 0041 实施例 5 取酵母菌发酵液。 0042 （1） 细胞内代谢物样品制备 ： 取 5ml 发酵液， 离心得到菌体， 用生理盐水清洗菌体 3 次， -40冷甲醇溶解后生物量干重达 0.5g/ml， 超声破碎至细胞裂解， 得到裂解液， 低温萃 取裂解液， 低温条件为 ： -40至 -50下萃取 3。

27、h， 离心收集 200ul 萃取后裂解上清液， 加 入内标物核糖醇溶液， 裂解上清液体积与内标物核糖醇重量比例为 150ul:20g， 室温真 空烘干， 得到细胞内代谢物样品。 0043 （2） 细胞外液样品制备 ： 取发酵液， 离心得到上清液， 取 300ul 上清液， 在清液 说 明 书 CN 103713074 A 6 5/5 页 7 中加入乙腈除去蛋白， 上清液与乙腈体积比为 1:0.5， 涡旋振荡， 再离心收集得上清液 ， 加入内标物核糖醇溶液， 上清液体积与内标物核糖醇重量比例为 300ul ： 20g， 室温 真空烘干， 得到细胞外液样品。 0044 （3） 样品衍生 ： 在步骤 1） 和步骤 2） 得到的样品和样品中， 分别加入 100ul 糖 衍生剂 （糖衍生剂为 0.2mg 甲氧胺盐酸溶于 10ml 吡啶溶液中配制而得） ， 恒温放置 4.0h， 再 分别加入 120ul 氨基酸衍生剂 （氨基酸衍生剂为 120ul 三甲基氯硅烷溶于 10ml 的三氟乙酰 胺中配制而得） ， 恒温放置过夜， 衍生完毕， 分别离心衍生后的样品和样品， 对应收集各 自上清得到待测胞内样品和待测胞外样品。 0045 （4） 按照气相色谱 - 质谱其仪器分析条件， 对待测胞内样品和待测胞外样品 进行分析和数据采集。 说 明 书 CN 103713074 A 7 。