胍基化的含二硫键聚氨基胺类聚合物及其制备和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103626996 A (43)申请公布日 2014.03.12 CN 103626996 A (21)申请号 201310635438.2 (22)申请日 2013.11.29 C08G 73/00(2006.01) C12N 15/87(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A61K 48/00(2006.01) (71)申请人 沈阳药科大学 地址 110016 辽宁省沈阳市沈河区文化路 103 号 (72)发明人 丁平田 余涧坤 (74)专利代理机构 沈阳杰克知识产权代理有限 公司 21207 代理人 李宇彤 (54) 发明名称 胍基化的含二。

2、硫键聚氨基胺类聚合物及其制 备和应用 (57) 摘要 本发明属于医药技术领域， 涉及胍基化的含 二硫键聚氨基胺类基因载体聚合物及其制备和应 用。所述的胍基化的含二硫键聚氨基胺类基因载 体聚合物， 是由具有双丙烯酰结构的交联剂和胍 基化试剂依次通过， 苯磺酰氯类对胍基的保护反 应， 麦克尔加成聚合， 脱去苯磺酰氯类胍基保护试 剂的保护而最终制得的。聚合物基因载体能够和 不同种类基因片段自组装成复合物， 具有良好生 物膜透过性， 细胞内还原响应性降解， 及核定位效 应。 可以通过控制胍基化试剂的种类、 在聚合物中 的比例以及分子量的大小来调整载体对基因片段 的包载能力和转运过程。该类胍基化的 SS。

3、-PAAs 基因载体， 可以提高基因的转染效率， 并能降低的 细胞毒性， 是基因治疗过程中一种新型的基因载 体。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书9页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103626996 A CN 103626996 A 1/2 页 2 1. 胍基化的含二硫键的聚氨基胺类， 其特征在于， 其结构和分子量如下 ： R 代表不同的胍基化试剂 ： ； ； ； ， 聚合物分子量为 8.7-17.5KDa， n 为 5-33。 2. 如权利要求 1 所述的胍基化。

4、的含二硫键的聚氨基胺类聚合物的制备方法， 其特征在 于通过如下步骤制备 ： 通过磺酰氯类对胍基的保护反应， 对胍基化试剂中的胍基进行保护 ； 通过麦克尔加成聚合反应将交联剂聚合到胍基单体中的伯胺或仲氨基团上 ； 在酸性条件下， 将麦克尔加成聚合反应产物脱去保护基团， 透析纯化后， 干燥， 除去反 应体系中的溶剂， 即得终产物。 3. 根据权利要求 2 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 a 中苯磺酰氯类保护试剂 为 ,2,4,6,7- 五甲基二氢苯并呋喃 -5- 磺酰氯 （Pbf-Cl） ， 反应开始滴加保护试剂的丙酮溶 液时， 温度控制在 0以下， 滴加完毕后， 反应在室温、 碱性条件下进。

5、行 1-4 小时聚合物中的 比例为 30-70%。 4. 根据权利要求 2 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 b 中麦克尔加成聚合反应溶剂 , 是甲醇、 N， N- 二甲基甲酰胺、 水， 或任意二者的混合溶剂， 反应于 30-65， 避光氮气保护条 件下进行， 所需时间依据是否使用催化剂， 和胍基单体种类不同， 从 1 天至 6 天不等， 步骤 c 中， 酸为三氟乙酸、 氢氟酸、 硫酸、 盐酸， 反应在室温条件下进行 1-4 小时， 溶剂为 N， N- 二甲 基甲酰胺、 水、 甲醇或任意两者的混合溶剂。 5. 根据权利要求 2 所述的制备方法， 其特征在于， 所述的胍基化试剂为胍、 氯己定。

6、、 胍 基丁胺、 聚六亚甲基双胍四种或它们的盐， 且在聚合物中的比例为 30-70%。 6. 权利要求 1 所述的胍基化的含二硫键的聚氨基胺类聚合物在转运基因中的应用。 7.基因/聚氨基胺类聚合物复合物， 其特征在于， 权利要求1的聚合物与基因片段在缓 冲溶液中室温条件下孵育 5-30 分钟， 采用自组装法制备。 8.根据权利要求7所述的胍基化SS-PAAs基因/载体复合物， 其特征在于， 孵育用缓冲 溶液为 HEPES 缓冲液、 磷酸盐缓冲液、 枸橼酸缓冲液、 无血清的细胞培养液或含血清的细胞 培养液。 9. 根据权利要求 8 所述的复合物， 其特征在于， 所述的基因片段为 cDNA 质粒或。

7、片段， 权 利 要 求 书 CN 103626996 A 2 2/2 页 3 siRNA 质粒或片段或 microRNA 片段， 聚合物与基因片段的 N/P 值为 1:1-48:1。 10. 根据权利要求 7-9 所述复合物与药学上可接受的赋形剂混合， 制备临床可接受的 注射剂， 包括局部注射剂， 静脉注射剂。 权 利 要 求 书 CN 103626996 A 3 1/9 页 4 胍基化的含二硫键聚氨基胺类聚合物及其制备和应用 技术领域 0001 本发明属于药物制剂新辅料和生物制剂新剂型领域， 涉及胍基化的含二硫键聚氨 基胺类聚合物及其制备和应用， 该载体含二硫键， 并具有良好膜透性和细胞内环。

8、境还原敏 感性， 以及拟肽核定位效应。 背景技术 0002 基因治疗作为一种新兴的肿瘤治疗手段， 近 20 年来， 获得了医药领域专家的广泛 青睐， 成为了抗肿瘤药物研发的重要组成部分。 基因治疗技术已经从导入期进入到成长期， 具有以下明显优势 ：（1） 能够针对疾病发生、 发展的原因治疗， 有望实现疾病的根本治愈 ； （2） 基于核苷酸的互补配对原则， 具有一定的天然靶向性 ；（3） 和传统化学药物相比， 具有 较低的毒副作用。 0003 基因治疗作为一种处于成长期的应用技术， 有多种实施技术路线， 如此多的技术 路线有着不同的原理， 这就意味着我们很难用一种通用载体实现基因治疗药物的体内传。

9、 递 ； 目前临床广泛应用的是基于腺病毒的病毒类载体， 其在体循环稳定性和长期安全性方 面存在着一定的问题。 0004 所以非病毒类基因载体是目前该领域的研究热点， 尽管非病毒类基因载体取得了 长足的进展， 但仍然存在着转染效率低， 体循环稳定性差， 和基因释放效率低等问题。解决 这些问题目前主要采取增加载体细胞膜透过性 （如， 通过引入氨基基团增加表面正电荷密 度等） 和加速细胞内载体释放目的基因 （如， 载体胞内的还原响应性等） 两个策略 ； 但是前一 策略的实施与降低载体的细胞毒性之间实际上存在矛盾关系， 难以逾越。 0005 针对非病毒类基因载体面临的现实问题， 本发明构建了胍基化的 。

10、SS-PAAs （含二硫 键的聚氨基胺类） 聚合物作为基因转运的载体。除了保留原有载体主链的二硫键 （具有在细 胞内环境的还原响应性） 以外， 更重要的是主链的胍基化， 使得该类载体具有较好的膜透过 性并且细胞毒性较小， 同时具有精确的核定位效应。 现有技术中并没有该载体的相关报道。 发明内容 0006 本发明所解决的技术问题是提供一种含有二硫键的胍基化聚氨基胺类聚合物 （SS-PAAs） 。此类聚合物在生理条件下能够和目的基因片段 （cDNA， microRNA， siRNA， 质粒 DNA， 反义寡核苷酸等） 形成复合物， 由于其主链富含氨基和胍基官能团能够高效率的透过 生物膜， 主链中二。

11、硫键的存在使其具有胞内还原响应性， 此外主链特殊的空间结构及类似 精氨酸中的胍基官能团赋予其精确的核定位效应， 因此该类聚合物能够实现高效率的基因 跨膜传递， 细胞内还原响应性释放， 及良好的核定位效应， 成为新一代高转染效率， 低细胞 毒性的基因治疗药物载体。可以作为基因治疗药物的多功能载体进行药物传递。 0007 本发明是通过如下技术方案实现的 ： 0008 本发明的聚合物结构如下 ： 0009 所述的聚合物是 N， N- 双 （丙烯酰） 胱胺 （CBA） 单体和胍基化试剂的 2,2,4,6,7- 五 说 明 书 CN 103626996 A 4 2/9 页 5 甲基二氢苯并呋喃 -5- 。

12、磺酰氯 （Pbf-Cl） 保护产物聚合而成的均聚物或共聚物， 并最终脱去 Pbf-Cl的保护。 所述的胍基化试剂选自胍、 氯己定、 胍基丁胺、 聚六亚甲基双胍或它们的盐， 胍、 氯己定、 胍基丁胺、 聚六亚甲基双胍的分子量分别为 59.07， 505.45， 130.27， 2500， 他 们在聚合物中的比例为 30-70%。 0010 当胍基化试剂为盐酸胍时， 其在聚合物中的比例为 30-70% ； 为氯己定时， 其在聚 合物中的比例为 30-70% ； 为胍基丁胺时， 其在聚合物中的比例为 50% ； 为聚六亚甲基双胍 时， 在聚合物中比例为 50%。 0011 本发明同时提供了胍基化聚氨。

13、基胺类聚合物 （SS-PAAs） 的制备方法。 0012 其制备方法如下 ： 0013 a. 通过磺酰氯类对胍基的保护反应， 将胍基化试剂中的胍基保护起来 ； 0014 b. 通过麦克尔加成聚合反应， 将 CBA 单体交联剂聚合到各胍基单体中的伯胺或仲 氨胺基团上 ； 0015 c. 酸性条件下脱去 Pbf-Cl 保护基团。 0016 其中， 步骤 a 中 Pbf-Cl 对各单体中胍基的保护反应 , 反应介质为能溶解反应物的 各种有机溶剂或混合溶剂体系， 包括丙酮、 甲醇、 N， N- 二甲基甲酰胺或任意一种与水组成的 混合溶剂。反应开始滴加 Pbf-Cl 丙酮溶液时， 温度控制在 0以下， 。

14、滴加完毕后， 反应在室 温、 碱性条件下进行 1-4 小时。 0017 步骤 b 中， 麦克尔加成聚合反应可以采用各种有机碱作催化剂， 加速反应进行， 如， 加入乙醇钠， 也可以不加入催化剂 ； 反应于 30-65， 避光氮气保护条件下进行， 所需时 间依据是否使用催化剂， 和胍基单体种类不同， 从 1 天至 6 天不等。所述的交联剂 N， N- 双 （丙烯酰） 胱胺 （CBA） ， 分子量为 260.38， 在聚合物中的比例为 30-70%。加成聚合反应的溶剂 为甲醇、 N， N- 二甲基甲酰胺、 水， 或任意二者的混合溶剂。 0018 步骤 c 中， 脱保护反应中酸可以选择三氟乙酸 （TF。

15、A） 、 氢氟酸、 硫酸、 盐酸。反应在 室温条件下进行 1-4 小时。所述的溶剂为 N， N- 二甲基甲酰胺 （DMF） 、 水、 甲醇以及任意两者 的混合溶剂。 0019 下面以盐酸胍或胍基丁胺的Pbf-Cl保护产物为例， 来说明胍基单体与CBA聚合反 应制备胍基化 SS-PAAs 的方法。 0020 1、 盐酸胍 / 胍基丁胺 -CBA 的制备 0021 本发明中的聚合物分子量为2.5KDa以上， 是通过具有双丙烯酰结构的CBA同含有 伯氨基或两个仲氨基的胍基化试剂进行麦克尔加成聚合完成的。 0022 本发明的盐酸胍 / 胍基丁胺 -CBA 的分子式如下 ： 0023 0024 其中 R。

16、 为胍或胍基丁胺， n 为 21-33。 0025 1.1Pbf-Cl 对胍基化试剂中胍基的保护 0026 胍基化试剂为胍、 胍基丁胺， 分子量分别为 59.03,130.26， 合成过程中分别采用二 者的盐酸盐， 硫酸盐形式， 它们具有良好的水溶性。 说 明 书 CN 103626996 A 5 3/9 页 6 0027 使用的胍基保护试剂 Pbf-Cl， 是经典的胍基保护试剂， 分子量为 288.79。保护反 应产物中 Pbf 基团对酸性环境较敏感， 极易脱去， 脱保护反应工艺条件简单。 0028 Pbf-Cl 对盐酸胍或胍基丁胺的胍基保护反应， 在 pH9-12 的碱性环境中进行， Pb。

17、f-Cl 溶于丙酮， 于零度以下滴加入溶有盐酸胍或胍基丁胺的反应液中， 之后室温反应 1-4 小时。 0029 盐酸胍和胍基丁胺的分子式如下 ： 0030 0031 Pbf-Cl 的分子式如下 ： 0032 0033 Pbf-Cl 对胍基化试剂中胍基的保护反应方程式如下 ： 0034 0035 1.2CBA 同胍基保护反应产物的麦克尔加成聚合 0036 CBA交联剂分子量为260.38， 是新一代SS-PAAs加成聚合反应交联剂， 分子结构中 不仅有双丙烯酰结构用于和胍基化试剂聚合， 其二硫键结构能够在细胞内还原敏感性环境 中降解， 实现基因片段的还原敏感性释放。 0037 胍基化试剂的分子结。

18、构中至少有一个可以进行麦克尔加成聚合反应的伯胺或仲 氨基团。 0038 CBA 和 Pbf-Cl 保护的胍基化试剂的麦克尔加成聚合反应在 30-65， 避光及氮气 保护条件下进行。反应溶剂采用水和甲醇的混合溶剂， N， N- 二甲基甲酰胺、 水， 或二者的混 合溶剂能够将反应物溶解的溶剂。 溶剂中水的存在具有重要意义， 不仅能溶解聚合产物， 而 且对反应进行程度， 聚合物产物的最大分子量都有影响， 一定比例的水存在是必须的。 0039 CBA 交联剂的分子式如下 ： 0040 说 明 书 CN 103626996 A 6 4/9 页 7 0041 CBA 同胍基保护反应产物的麦克尔加成聚合反应。

19、方程式 ： 0042 0043 其中 Pbf 结构， 前述所示， n 为 21-33， 聚合物分子量为 8.7-17.5KDa。 0044 1.3 麦克尔加成聚合反应脱去 Pbf 0045 本发明中 Pbf 的脱保护反应需在室温， 酸性条件下进行， 脱保护反应。 0046 pbf 脱保护反应方程式如下 ： 0047 0048 方 程 式 中 Pbf 结 构 中， n 为 21-33， 脱 去 Pbf 保 护 的 最 终 聚 合 物 分 子 量 为 8.7-17.5KDa。最终产物采用透析的方法进行纯化， 透析袋的截留分子量 （MWCO） 为 1000。 纯化后的聚合物终产品， 通过冷冻干燥的方。

20、法收取。 0049 本发明的聚合物在水中能与基因片段自发形成近似颗粒状的复合物， 在 pH4-9 之 间复合物的粒径， 及表面电荷密度会发生变化。 作为基因载体， 在细胞内还原环境中可以发 生降解， 释放外源基因片段。 0050 2、 基因 / 载体复合物的制备 0051 采用自组装室温孵育法制备基因载体复合物。即 ： 在室温条件下， 将不同聚合物 / 说 明 书 CN 103626996 A 7 5/9 页 8 基因片段 （N/P） 在缓冲溶液中孵育 5-30 分钟， 即得基因 / 载体复合物。 0052 所述的基因片段包括 cDNA 质粒、 siRNA 质粒、 cDNA 片段、 siRNA。

21、 片段、 microRNA 片 段 ； N/P 值范围依据载体结构和基因片段种类不同， 从 1:1 至 48:1 ； 缓冲溶液以 HEPES 缓冲 液为主， 还包括其他各种模拟生理条件的缓冲溶液， 如磷酸盐缓冲溶液， 枸橼酸缓冲液， 有 / 无血清的细胞培养液。 0053 本发明中的 CBA， 除具有麦克尔加成所必须的双丙烯酰结构， 还含有能够响应细胞 内还原环境的二硫键 , 和胍基化试剂进行麦克尔加成聚合之后， 能够保留其还原敏感性， 胍基化试剂又赋予聚合物良好的透膜性和核定位效应， 最终制备出多功能的聚合物基因载 体 , 对提高非病毒类基因载体的转染效率， 降低细胞毒性， 及未来在体内、 。

22、临床的应用有重 大的意义。 附图说明 ： 0054 图 1 为三种胍基化试剂制备的聚合物包载 pcDNA3.1-EGFP-cDNA 质粒的体外转染 效率 ； 0055 图2为三种胍基化试剂制备的聚合物包载pSliencer TM4.1CMV-FANCF-shRNA质粒 的体外目的基因抑制效率 ； 0056 图3为三种胍基化试剂制备的聚合物包载FANCF-shRNA片段的体外目的基因抑制 效率 ； 0057 图 4 为三种胍基化试剂制备的聚合物包载 328-microRNA 片段的体外转染效率 ； 0058 图 5 为三种聚合物包载 pcDNA3.1-EGFP-cDNA 质粒所形成的复合物对细胞。

23、活力的 影响 ； 0059 图6为三种聚合物包载pSliencer TM4.1CMV-FANCF-shRNA质粒所形成的复合物对 细胞活力的影响 ； 0060 图 7 为三种聚合物包载 FANCF-shRNA 片段所形成的复合物对细胞活力的影响 ； 0061 图 8 为三种聚合物包载 328-microRNA 片段所形成的复合物对细胞活力的影响。 具体实施方式 ： 0062 下面为本发明的实施例， 但下述实施例并不限制本发明的权利范围。 0063 实施例 1 ： 以硫酸胍基丁胺作为胍基化试剂制备 SS-PAAs 0064 材料与方法 0065 2,2,4,6,7- 五甲基二氢苯并呋喃 -5- 。

24、磺酰氯 （Pbf-Cl） ： 购自吉尔生化 （上海） 有 限公司。N,N- 双 （丙烯酰） 胱胺 （CBA） ： 购自阿法埃莎 （天津） 化学有限公司。硫酸胍基丁 胺 ： 购自常州阿奇生物科技有限公司。三氟乙酸 (TFA): 购自天津科密欧化学试剂有限公 司。 pcDNA3.1-EGFP-cDNA质粒及质粒提取试剂盒 ： 购自天根生化科技有限公司。 pSliencer TM4.1CMV-FANCF-shRNA 质粒， FANCF-shRNA， 及 328-microRNA 片段 ： 均由上海生物工程有 限公司设计合成并购得。Lipofectamine2000 ： 购自 Invitrogen 公。

25、司 ； ExGen500 ： 购自 Fermentas 公司 ； MTT 检测试细胞活力剂盒， 细胞实验耗材， 培养基， 琼脂糖等 ： 均购自宝信 生物公司。 0066 （1） Pbf-Cl 对硫酸胍基丁胺中胍基结构的保护 说 明 书 CN 103626996 A 8 6/9 页 9 0067 将 0.79g 硫酸胍基丁胺置于 50ml 三颈瓶中， 加入 10ml 水溶解， 降温至 0以下， 调 pH 至 11 ； 缓慢滴加已溶于 10ml 丙酮的 1g Pbf-Cl， 此时温度维持在 0以下， pH 维持在 10-13范围内 ； 滴加完毕后， 0以下反应1小时， 室温反应2小时， 直至pH不。

26、发生变化。 TLC 监测反应进程。 抽滤， 收集沉淀， 于40-60烘箱干燥过夜， 称重， 即得胍基结构被Pbf-Cl保 护的胍基丁胺。 0068 （2） 以胍基丁胺为单体的胍基化 SS-PAAs 聚合物的合成 0069 取 （1） 项下所述的0.15g胍基丁胺保护产物， 0.105gCBA， 置于50ml圆底烧瓶中， 加 入2.5ml水和6mlDMF作溶剂， 45-60， 避光， 并在氮气保护、 磁力搅拌条件下反应3天 ； TLC 监测反应进程， 于72小时后加入约10%过量的胍基丁胺保护产物 （0.016g） ， 继续反应24小 时 ； 停止反应， 用 4mol/L 盐酸调体系 pH 为 。

27、2-5， 收集整个反应体系溶液， 移入透析袋， 透析 纯化反应产物， 透析介质为蒸馏水， 透析袋截留分子量 （MWCO） 为 1000， 透析三天， 并且每天 至少更换一次透析介质 ； 收集透析袋内溶液， 置于干燥培养皿中， 冻干收集聚合物产品。 0070 （3） 胍基化 SS-PAAs 聚合物脱去 Pbf-Cl 保护 0071 取 （2） 项下所述的聚合物产物 0.5g， TFA5ml， 置于 50ml 圆底烧瓶 ； 加入 2.5ml 水 和 2.5mlDMF 作溶剂， 室温， 磁力搅拌下反应 2-4 小时。反应体系转移入透析袋， 具体透析 纯化过程如 （2） 项下所述。收集透析袋内溶液， 。

28、置于干燥培养皿内， 冻干收集聚合物终产品 0.378 克。 0072 GPC 测定聚合物终产品的数均分子量和质均分子量分别为 ： 8027,10935。多分散 系数 （PDI） 为 ： 0.97。 0073 实施实例 2 ： 以醋酸氯己定单体作为胍基化试剂制备 SS-PAAs 0074 （1） Pbf-Cl 对醋酸氯己定中胍基结构的保护 0075 将1g醋酸氯己定置于50ml三颈瓶中， 加入15ml水溶解， 降温至0以下， 调pH至 11 ； 缓慢滴加已溶于 10ml 丙酮的 2g Pbf-Cl， 此时温度维持在 0以下， pH 维持在 10-13 范 围内 ； 滴加完毕后， 0以下反应 1 。

29、小时， 室温反应 3 小时， 直至 pH 不发生变化。TLC 监测反 应进程。 抽滤， 旋转蒸发除去滤液中丙酮， 收集丙酮相产物， 于40-60烘箱干燥过夜， 称重， 即得胍基结构被 Pbf-Cl 保护的氯己定。 0076 （2） 以氯己定为单体的胍基化 SS-PAAs 聚合物的合成 0077 取 （1） 项下所述的 0.47g 氯己定保护产物， 0.16gCBA， 置于 50ml 圆底烧瓶中， 加入 2.5ml 水和 15mlDMF 作溶剂， 40-60， 避光， 并在氮气保护、 磁力搅拌条件下反应 6 天 ； TLC 监测反应进程， 于 144 小时后加入约 10% 过量的氯己定保护产物 。

30、（0.047g） ， 继续反应 24 小 时 ； 停止反应， 用 4mol/L 盐酸调体系 pH 为 2-5， 收集整个反应体系溶液， 移入透析袋， 透析 纯化反应产物， 透析介质为蒸馏水， 透析袋截留分子量 （MWCO） 为 1000， 透析三天， 并且每天 至少更换一次透析介质 ； 收集透析袋内溶液， 置于干燥培养皿中， 冻干收集聚合物产品。 0078 （3） 胍基化 SS-PAAs 聚合物脱去 Pbf-Cl 保护 0079 取 （2） 项下所述的聚合物产物 0.5g， TFA5ml， 置于 50ml 圆底烧瓶 ； 加入 2.5ml 水 和 2.5mlDMF 作溶剂， 室温， 磁力搅拌下反。

31、应 2-4 小时。反应体系转移入透析袋， 具体透析 纯化过程如 （2） 项下所述。收集透析袋内溶液， 置于干燥培养皿内， 冻干收集聚合物终产品 0.401 克。 0080 GPC 测定聚合物终产品的数均分子量和质均分子量分别为 ： 9876,16430。PDI 为 ： 说 明 书 CN 103626996 A 9 7/9 页 10 0.78。 0081 实施实例 3 ： 以盐酸胍单体作为胍基化试剂制备 SS-PAAs 0082 （1） Pbf-Cl 对盐酸胍中胍基结构的保护 0083 将 1g 盐酸胍置于 100ml 三颈瓶中， 加入 5ml 水溶解， 降温至 0以下， 调 pH 至 11 ；。

32、 缓慢滴加已溶于 10ml 丙酮的 3.02g Pbf-Cl， 此时温度维持在 0以下， pH 维持在 10-13 范 围内 ； 滴加完毕后， 0以下反应 1 小时， 室温反应 1 小时， 直至 pH 不发生变化。TLC 监测反 应进程。 抽滤， 收集沉淀产物， 于40-60烘箱干燥过夜， 称重， 即得胍基结构被Pbf-Cl保护 的盐酸胍。 0084 （2） 以盐酸胍为单体的胍基化 SS-PAAs 聚合物的合成 0085 取 （1） 项下所述的 0.19g 盐酸胍保护产物， 0.16gCBA， 置于 50ml 圆底烧瓶中， 加入 25mlDMF 作溶剂， 40-55， 避光， 并在氮气保护、 。

33、磁力搅拌条件下反应 6 天 ； TLC 监测反应进 程， 于 144 小时后加入约 10% 过量的盐酸胍保护产物 （0.019g） ， 继续反应 24 小时 ； 停止反 应， 用 4mol/L 盐酸调体系 pH 为 3-4， 收集整个反应体系溶液， 移入透析袋， 透析纯化反应产 物， 透析介质为蒸馏水， 透析袋截留分子量 （MWCO） 为 1000， 透析三天， 并且每天至少更换一 次透析介质 ； 收集透析袋内溶液， 置于干燥培养皿中， 冻干收集聚合物产品。 0086 （3） 胍基化 SS-PAAs 聚合物脱去 Pbf-Cl 保护 0087 取 （2）项下所述的聚合物产物 0.5g， TFA5。

34、ml， 置于圆底烧瓶 ； 加入 2.5ml 水和 2.5mlDMF 作溶剂， 室温， 磁力搅拌下反应 2-4 小时。反应体系转移入透析袋， 具体透析纯 化过程如 “53” 项下所述。收集透析袋内溶液， 置于干燥培养皿内， 冻干收集聚合物终产品 0.433 克。 0088 GPC 测定聚合物终产品的数均分子量和质均分子量分别为 ： 7028,10517。PDI 为 ： 1.12。 0089 实施实例 4 ： 基因 / 胍基化 SS-PAAs 载体复合物的制备 0090 pcDNA3.1-EGFP-cDNA质粒， pSliencer TM4.1CMV-FANCF-shRNA质粒， FANCF-sh。

35、RNA， 及 328-microRNA 片段， 分别用 50mM， pH 为 7.4 的 HEPES 缓冲溶液稀释至 0.075mg/ml ； 实例 1、 2、 3项下所述的三种聚合物载体， 以0.9mg/ml溶解在HEPES缓冲液中， 并以1:1的比例用 HEPES 缓冲液稀释 ； 分别取 0.8ml 三种聚合物载体溶液， 加入到不同种类 0.2ml 的基因片段 溶液中， 混合液在 EP 管中涡旋 5 秒， 并在室温条件下孵育 10-30min， 即得不同种类， 聚合物 / 载体质量比为 48/1,24/1,12/1 的基因 / 胍基化 SS-PAAs 载体复合物。动态光散射 （DLS） 法。

36、测定复合物粒径和 Zeta 电位， 表 1-4 为各组实验三次测定粒径和 Zeta 电位的平均值。 0091 表 1 为胍基化 SS-PAAs 和 pcDNA3.1-EGFP-cDNA 质粒形成复合物的粒径和 Zeta 电 位 ： 0092 0093 表2胍基化SS-PAAs和pSliencer TM4.1CMV-FANCF-shRNA质粒形成复合物的粒径 和 Zeta 说 明 书 CN 103626996 A 10 8/9 页 11 0094 电位 ： 0095 0096 表 3 胍基化 SS-PAAs 和 FANCF-shRNA 片段形成复合物的粒径和 Zeta 电位 ： 0097 009。

37、8 表 4 胍基化 SS-PAAs 和 328-microRNA 片段形成复合物的粒径和 Zeta 电位 ： 0099 0100 实施例 4 中所述的， 对于不同基因片段和聚合物载体所形成的复合物， 其粒径和 Zeta 电位测定结果表明 ： 几种复合物粒径均在纳米级别， Zeta 电位均是阳性， 具备了一般 阳离子聚合物基因载体的物理化学性质。 0101 实施实例5 ： 载体相关性质检测试验 ： 胍基化SS-PAAs基因载体的体外转染效率评 价 0102 (1) 载体包载 pcDNA3.1-EGFP-cDNA 质粒的体外转染效率研究 0103 按照实施例 4 所述方法制备不同 N/P 值 （4。

38、8/1,24/1,12/1） 的复合物之后， 将三种 复合物按照每孔 500l 的浓度加入正常培养 MCF10A 细胞的六孔板中， 培养基中含有血清 （BSA） ； 转染后 48 小时， 利用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达情况， 并由流式细胞仪软 件确定转染效率。选择商品化转染试剂 Lipofectamine2000 作为对照。结果如图 1 所示。 0104 (2) 载体包载 pSliencer TM4.1CMV-FANCF-shRNA 质粒的体外转染效率研究 0105 按照实施例 4 所述方法制备不同 N/P 值 （48/1,24/1,12/1） 的复合物之后， 将三种 复合物按照每孔 5。

39、00l 的浓度加入正常培养 MCF10A 细胞的六孔板中， 培养基中含有血清 （BSA） ； 转染后 48 小时， 利用免疫荧光检测 FANCF 基因表达的情况， 利用流式细胞仪评价绿 色荧光强度， 间接评价 FANCF 的沉默效率。选择商品化转染试剂 Lipofectamine2000 作为 对照。结果如图 2 所示。 0106 (3) 载体包载 FANCF-shRNA 片段的体外转染效率研究 0107 按照实施例 4 所述方法制备不同 N/P 值 （48/1,24/1,12/1） 的复合物之后， 将三种 复合物按照每孔 500l 的浓度加入正常培养 MCF10A 细胞的六孔板中， 培养基中。

40、含有血清 说 明 书 CN 103626996 A 11 9/9 页 12 （BSA） ； 转染后 48 小时， 利用免疫荧光检测 FANCF 基因表达的情况， 利用流式细胞仪评价绿 色荧光强度， 间接评价 FANCF 的沉默效率。选择商品化转染试剂 Lipofectamine2000 作为 对照。结果如图 3 所示。 0108 (4) 载体包载 328-microRNA 片段的体外转染效率研究 0109 按照实施例 4 所述方法制备不同 N/P 值 （48/1,24/1,12/1） 的复合物之后， 将三种 复合物按照每孔 500l 的浓度加入正常培养 MCF10A 细胞的六孔板中， 培养基中。

41、含有血清 （BSA） ； 转染后 48 小时， 利用 Realtime-PCR 检测 328-microRNA 的表达情况。选择商品化转 染试剂 Lipofectamine2000 作为对照。结果如图 4 所示。 0110 载体相关性质检测试验 ： 胍基化 SS-PAAs 基因载体的体外细胞毒性评价 0111 按实施例 4 所述方法制备不同 N/P 值 （48/1,24/1,12/1） 的复合物之后， 将三种 复合物按照每孔 500l 的浓度加入正常培养 MCF10A 细胞的六孔板中， 培养基中含有血清 （BSA） ， 继续培养24小时 ； 之后弃去含复合物的培养基， 采用经典的MTT法测定细。

42、胞活力， 以 未经复合物处理的细胞活力作为 100%， 并以 ExGen500 作为对照载体。结果如图 5-8 所示。 0112 按照 “92” 项下所述， 图 5 表示三种聚合物包载 pcDNA3.1-EGFP-cDNA 质粒所形成 的复合物对细胞活力的影响 ； 图 6 表示三种聚合物包载 pSliencer TM4.1CMV-FANCF-shRNA 质粒所形成的复合物对细胞活力的影响 ； 图 7 表示三种聚合物包载 FANCF-shRNA 片段所形 成的复合物对细胞活力的影响 ； 图8表示三种聚合物包载328-microRNA片段所形成的复合 物对细胞活力的影响。 0113 结果表明， 三种基因载体， 对cDNA质粒， siRNA质粒或片段， micro-RNA片段均具有 较高的体外转染效率， 且细胞毒性较低， 达到了预期构建更理想的基因载体的目标。 说 明 书 CN 103626996 A 12 1/4 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103626996 A 13 2/4 页 14 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103626996 A 14 3/4 页 15 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103626996 A 15 4/4 页 16 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103626996 A 16 。