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1、(10)申请公布号 CN 103604783 A (43)申请公布日 2014.02.26 CN 103604783 A (21)申请号 201310539154.3 (22)申请日 2013.11.01 G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 大连理工大学 地址 116024 辽宁省大连市高新园区凌工路 2 号 (72)发明人 刘凤玉 孙世国 高玉龙 王继涛 (74)专利代理机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 代理人 赵淑梅 李馨 (54) 发明名称 一种可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种可逆检测次氯酸根和硫化氢 的方法， 具体涉及一。
2、类选择性、 高灵敏、 可逆检测 次氯酸根和硫化氢及其氧化还原循环的发光检测 方法及其应用。一种可逆检测次氯酸根和硫化氢 的方法， 为利用发光探针分子进行检测的方法， 所 述发光探针分子为具有通式 I 结构的金属配合 物 ： (L1L2)M-L3Y3。该类金属配合物可做为一类选 择性、 高灵敏、 循环、 可逆检测次氯酸根和硫化氢 及其氧化还原循环过程的发光探针分子。利用该 类发光探针分子可以实现对次氯酸根和硫化氢及 其氧化还原过程的循环、 可逆检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 12 页 附图 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书。
3、2页 说明书12页 附图9页 (10)申请公布号 CN 103604783 A CN 103604783 A 1/2 页 2 1. 一种可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法， 包括下述步骤 ： 将已知次氯酸根浓度标准样品和发光探针分子溶于缓冲溶液中， 测定体系发光强 度， 建立次氯酸根浓度与发光探针分子发光强度关系 ； 将已知硫化氢浓度标准样品加入步骤所得被氧化的发光探针分子缓冲溶液中， 测 定体系发光强度， 建立硫化氢浓度与发光探针分子发光强度关系 ； 将待测次氯酸根样品和发光探针分子溶于缓冲溶液中， 测定体系发光强度， 根据步 骤所得次氯酸根浓度与体系发光强度关系， 确定待测次氯酸根样品中次氯酸。
4、根的浓度 ； 将待测硫化氢样品加入步骤所得溶液中， 测定体系发光强度， 根据步骤所得硫 化氢浓度与体系发光强度关系， 确定待测硫化氢样品中硫化氢的浓度， 其中， 所述发光探针分子为具有通式 I 结构的金属配合物 ： (L1L2)M-L3Y3 I 式 I 中， M 为 Ru 或 Os ； Y 为卤素离子、 ClO4-、 BF4-、 PF6-或 OTs-； L1和 L2各自独立地选自如下配体 ： 其中， R1和 R2各自独立地选自 H、 C1-18烷基、 CHO、 COOH、 NH2、 C1-6烷基氨基、 OH、 SH、 C1-6 烷氧基、 C1-6酰胺基、 C1-6烷基取代或未取代的苄基、 卤素。
5、或 C1-6卤代烷基 ； L3选自如下配体 ： 其中， R3为 H、 CH3或 R4； R4选自具有通式 PTZ1、 PTZ2或 PTZ3的基团， 式中 ： n=1 18， m=0 18 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 L1和 L2各自独立地选自如下配体 ： 权 利 要 求 书 CN 103604783 A 2 2/2 页 3 其中， R1和 R2各自独立地选自 H 和 C1-6烷基。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 L3选自如下配体 ： 其中， R3为 H 或 CH3； R4选自具有通式 PTZ2或 PTZ3的基团， 式中， m。
6、=0， n=2 6。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述发光探针分子选自下述金属配合物 中的一种 ： 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述发光探针分子发光强度按下述方 法确定 ： 对溶液进行发光光谱扫描， 激发光波长为 450nm， 发射波长扫描范围为 470nm 700nm。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述发光探针分子在缓冲溶液中的浓度 为 110-5mol/L。 权 利 要 求 书 CN 103604783 A 3 1/12 页 4 一种可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种可逆检测次氯酸。
7、根和硫化氢的方法， 具体涉及一类选择性、 高灵 敏、 可逆检测次氯酸根和硫化氢及其氧化还原循环的发光检测方法及其应用。 背景技术 0002 次氯酸根离子广泛应用在人们的日常生活中， 例如家用消毒剂和漂白剂等。 同时， 次氯酸根离子也是生物体内的一种重要活性氧物种。在髓过氧化物酶 (MPO) 的催化下， 过氧化氢和氯离子发生反应， 产生次氯酸。正常情况下， 生物体内次氯酸根离子的量维持 在一个平衡标准水平上， 但是当体内髓过氧化物酶的量发生变异后， 生物体内次氯酸根离 子的量就会失衡， 从而诱发各种疾病的产生。例如 ： 心血管疾病 （S.Sugiyama,Y.Okada,G. K.Sukhova。
8、,R.Virmani,J.W.Heinecke,P.Libby,Am.J.Pathol.2001,158,879891;S. Sugiyama,K.Kugiyama,M.Aikawa,S.Nakamura,H.Ogawa,P.Libby,Arterioscler.Thromb. Vasc.Biol.2004,24,13091314） 、 神经元退变 (Y.W.Yap,M.Whiteman,N.S.Cheung,Cell. Signalling2007,19,219228.)、关 节 炎 (M.J.Steinbeck,L.J.Nesti,P.F.Sharkey,J. Parvizi,J.Orth。
9、op.Res.2007,25,11281135.)， 甚至可能诱发癌症等 (S.A.Weitzman,L. I.Gordon,Blood1990,76,655663.)。因此寻找快速、 灵敏、 专一检测次氯酸根离子的方 法， 近年来在医学、 生物学、 生物化学和环境化学等相关领域引起了高度重视。 0003 在生物体及细胞内存在各种各样的信号途径， 由于气体信号分子具有可连 续产生、 传播迅速、 快速弥散等特点， 引起了人们的广泛关注。自从 20 世纪 90 年代 以来， 人们逐渐认识到硫化氢是存在于生物体内的一种新型的内源性气体信号分子 （H.Kimura,Y.Nagai,K.Umemura 。
10、and Y.Kimura,Antioxid.Redox Signaling,2005,7,795 ； B.Predmore,D.Lefer and G.Gojon,Antioxid.Redox Signaling,2012,17,119.） 。 该气体可 以通过酶的催化作用， 在生物体内的很多器官中产生。尽管硫化氢的代谢途径仍然不是很 清楚， 但是近年来越来越多的研究结果证实， H2S 在自发性高血压、 慢性阻塞性肺气肿、 脓毒 血症或出血性休克、 阿尔茨海默病、 胃黏膜损伤以及肝硬化等多种疾病的产生过程中发挥 着非常重要的病理生理学效应 （Geng B.Yang J.Qi Y H2S gen。
11、erated by heart in rat and effects on cardiac function2004(02） .Geng B.Chang L.Pan CS Endogenous hydrogen sulfide regulation of myocardial injury induced by isoproterenol2004(03） 。 因此 迫切需要 寻找到能够灵敏检测体内硫化氢含量的检测方法， 实现对硫化氢的有效监控。 0004 目 前，关 于 检 测 次 氯 酸 根 （Lin Yuan,Weiying Lin,Jizeng Song,Yueting Yang.,Ch。
12、em.Commun.2011,47,1269112693;Zhangrong Lou,Peng Li,Qiang Pan,Keli Han.,Chem.Commun.,2013,49,2445-2447）和 硫 化 氢 （H.Peng,Y.Cheng,C.Dai,A.King,B. Predmore,D.Lefer,B.Wang,Angew.Chem.,Int.Ed.,2011,50,9672;Y.Qian,J.Karpus,O. Kabil,S.Zhang,H.Zhu,R.Banerjee,J.Zhao and C.He,Nat.Commun.,2012,2,495）的荧光 探针都分别已有相。
13、关报道。鉴于次氯酸根和硫化氢可以在生物体内共存， 研究具有可逆氧 化还原活性， 既能够被次氯酸根氧化， 又能够被硫化氢还原的荧光探针分子， 从而实现对次 说 明 书 CN 103604783 A 4 2/12 页 5 氯酸根和硫化氢及其氧化还原循环的选择性、 高灵敏、 循环、 可逆检测， 开发新型荧光探针 分子及其应用方法， 具有十分重要的理论和实用价值。 0005 总结发现， 现有报道中都是采用有机化合物作为荧光探针， 而大部分有机化合物 的缺点就是氧化还原稳定性差， 无法实现可逆、 循环检测。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法。 本发明利用三联吡 啶。
14、钌金属配合物具有光稳定性好， 斯托克斯位移大， 发光量子产率适中， 且该类金属配合物 具有良好的可逆氧化还原活性的特点， 将其用于对次氯酸根和硫化氢及其氧化还原循环的 选择性、 高灵敏、 循环、 可逆检测。 0007 一种可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法， 包括下述步骤 ： 0008 将已知次氯酸根浓度标准样品和发光探针分子溶于缓冲溶液中， 测定体系发光 强度， 建立次氯酸根浓度与发光探针分子发光强度关系 ； 0009 将已知硫化氢浓度标准样品加入步骤所得被氧化的发光探针分子缓冲溶液 中， 测定体系发光强度， 建立硫化氢浓度与发光探针分子发光强度关系 ； 0010 将待测次氯酸根样品和发光探针分。
15、子溶于缓冲溶液中， 测定体系发光强度， 根 据步骤所得次氯酸根浓度与体系发光强度关系， 确定待测次氯酸根样品中次氯酸根的浓 度 ； 0011 将待测硫化氢样品加入步骤所得溶液中， 测定体系发光强度， 根据步骤所 得硫化氢浓度与体系发光强度关系， 确定待测硫化氢样品中硫化氢的浓度 ； 0012 其中， 所述发光探针分子为具有通式 I 结构的金属配合物 ： 0013 (L1L2)M-L3Y3 0014 I 0015 式 I 中， M 为 Ru 或 Os ； 0016 Y 为卤素离子、 ClO4-、 BF4-、 PF6-或 OTs-； 0017 L1和 L2各自独立地选自如下配体 ： 0018 00。
16、19 其中， R1和 R2各自独立地选自 H、 C1-18烷基、 CHO、 COOH、 NH2、 C1-6烷基氨基、 OH、 SH、 C1-6烷氧基、 C1-6酰胺基、 C1-6烷基取代或未取代的苄基、 卤素或 C1-6卤代烷基。 0020 L3选自如下配体 ： 0021 0022 其中， R3为 H、 CH3或 R4； 说 明 书 CN 103604783 A 5 3/12 页 6 0023 R4选自具有通式 PTZ1、 PTZ2或 PTZ3的基团， 0024 式中 ： n=1 18， m=0 18 0025 0026 上述方法中， 优选所述缓冲溶液为磷酸、 硼酸或 Tris-HCl 缓冲溶。
17、液 ； 0027 上述方法中， 优选所述缓冲溶液的浓度为 0.01 1M ； 0028 上述方法中， 优选缓冲溶液的 pH=7.4。 0029 上述方法中， 发光探针分子发光强度的测定可于任意商业购得的荧光检测仪器中 进行， 如美国 Pekin-Elmer LS55 型荧光检测器。 0030 上述方法中， 优选所述发光探针分子发光强度按下述方法确定 ： 对溶液进行荧光 光谱扫描， 激发光波长为 450nm， 发射波长扫描范围为 470nm 700nm。 0031 上述方法中， 优选所述发光探针分子在缓冲溶液中的浓度为 110-5mol/L。 0032 本发明所述 L1、 L2和 L3配体中的两。
18、个 N 原子与 M 形成配位键。 0033 本发明所述可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法优选所述 L1和 L2各自独立地选自 如下配体 ： 0034 0035 其中， R1和 R2各自独立地选自 H 和 C1-6烷基。 0036 本发明所述可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法优选所述 L3选自如下配体 ： 0037 0038 其中， R3为 H 或 CH3； R4选自具有通式 PTZ2或 PTZ3的基团， 式中， m=0， n=2 6。 0039 本发明所述可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法最优选所述发光探针分子选自下 述金属配合物中的一种 ： 0040 说 明 书 CN 103604783 A 6 4/1。
19、2 页 7 0041 本发明所述发光探针分子优选按下述文献公开的方法制备 ： 中国发明专利， 公开 号 101531683A， 分子内带有吩噻嗪供电基团的联吡啶钌 / 锇 ECL 标记物。 0042 以 Ru-PTZ 为例， 本发明发光探针分子的工作原理是 ： 0043 0044 发光探针分子中吩噻嗪基团上的 S 原子可以被 ClO-氧化成 S=O， 使体系的发光显 著增强。而 H2S 可以将 S=O 还原， 使探针分子回到初始状态， 体系的发光被淬灭。只要探针 分子中带有吩噻嗪基团， 就可以进行上述可逆氧化还原循环反应， 通过体系发光强度的变 化实现对次氯酸根和硫化氢的检测。 0045 本发。
20、明的有益效果是 ： 本发明所述发光探针分子内带有吩噻嗪供电基团的联吡啶 钌 / 锇金属配合物具有氧化还原可逆性。该类配合物可以选择性、 高灵敏检测次氯酸根， 过 程中伴随显著的发光增强。达到平衡时， 整个体系还可以对硫化氢产生专一性、 高灵敏响 应， 使发光淬灭并恢复到初始状态。 上述过程可不断循环往复， 因此该类金属配合物可做为 一类选择性、 高灵敏、 循环、 可逆检测次氯酸根和硫化氢及其氧化还原循环过程的发光探针 分子。利用该类发光探针分子可以实现对次氯酸根和硫化氢及其氧化还原过程的循环、 可 逆检测。 说 明 书 CN 103604783 A 7 5/12 页 8 附图说明 0046 图。
21、 1 是实施例 1， 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 分别和相同浓度的 （110-4mol/L） 次氯 酸钠、 钼酸钠、 H2O2、 OH， 在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲溶液中， 利用荧光检测器测得的 探针对各活性氧物种的响应情况。 0047 其中横坐标为响应时间 ； 纵坐标为加入不同的活性氧物种后探针的发光强度减去 加入不同的活性氧物种前探针的发光强度， 即混合溶液的发光强度减去探针空白溶液的发 光强度。 0048 图 2 是实施例 2， 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 和次氯酸钠在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸 盐缓冲溶液中， 利用荧光检测。
22、器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的变化情况。 0049 其中横坐标为波长， 纵坐标为加入次氯酸钠后， 探针对其响应的发光强度值。 0050 图 3 是实施例 2， 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 和次氯酸钠在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸 盐缓冲溶液中， 利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的增加而增强， 并 逐渐达到平衡的情况。 0051 其中横坐标为所加入次氯酸钠的浓度， 纵坐标为加入次氯酸钠后， 探针对其响应 的发光强度值。 0052 图 4 是实施例 2， 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 和次氯酸钠在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸。
23、 盐缓冲溶液中， 利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的增加而增强的线 性关系情况。 0053 其中横坐标为所加入次氯酸钠浓度的对数， 纵坐标为加入次氯酸钠后， 探针对次 氯酸钠浓度响应后的发光强度值。 0054 图 5 是实施例 3， 验证 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲 溶液中， 对次氯酸钠的高选择性图示。 0055 其中横坐标为向检测体系中所加入的被检测组份， 纵坐标为加入被检测组份后探 针的发光强度减去加入被检测组份前探针的发光强度的差值， 即混合物的发光强度减去 Ru-PTZ 空白溶液的发光强度的差值。 0056。
24、 图 6 是实施例 4， 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 和次氯酸钠在 pH=7.4 的 0.02mol/L 磷酸 盐缓冲溶液中， 利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的变化情况。 0057 其中横坐标为波长， 纵坐标为加入次氯酸钠后， 探针对其响应的发光强度值。 0058 图 7 是实施例 4， 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 和次氯酸钠在 pH=7.4 的 0.02mol/L 磷酸 盐缓冲溶液中， 利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的增加而增强， 并 逐渐达到平衡的情况。 0059 其中横坐标为所加入的次氯酸钠的浓度， 纵坐标为加入次氯酸钠后， 探。
25、针对其响 应的发光强度值。 0060 图 8 是实施例 5， 110-5mol/L 的 Ru-A-PTZ 和次氯酸钠在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷 酸盐缓冲溶液中， 利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的变化情况。 0061 其中横坐标为波长， 纵坐标为加入次氯酸钠后， 探针对其响应的发光强度值 0062 图 9 是实施例 5， 110-5mol/L 的 Ru-A-PTZ 和次氯酸钠在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷 酸盐缓冲溶液中， 利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的增加而增强， 逐渐达到平衡的情况。 说 明 书 CN 103604783 A 。
26、8 6/12 页 9 0063 其中横坐标为所加入的次氯酸钠的浓度， 纵坐标为加入次氯酸钠后， 探针对其响 应的发光强度值。 0064 图 10 是实施例 5， 110-5mol/L 的 Ru-A-PTZ 和次氯酸钠在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷 酸盐缓冲溶液中， 利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的增加而增强的 线性关系情况。 0065 其中横坐标为所加入次氯酸钠浓度的对数， 纵坐标为加入次氯酸钠后， 探针对次 氯酸钠响应后的发光强度值减去加入次氯酸钠前探针空白溶液的发光强度值， 即混合溶液 的发光强度减去探针空白溶液的发光强度的差值。 0066 图 11 是实施例。
27、 6， 110-5mol/L 的 Ru-PTZ、 110-4mol/L 的次氯酸钠体系， 和硫化 氢在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲溶液中， 利用荧光检测器测得的探针的发光强度随硫 化氢浓度的变化情况。 0067 其中横坐标为波长， 纵坐标为加入硫化氢后， 探针对其响应的发光强度值。 0068 图 12 是实施例 6， 110-5mol/L 的 Ru-PTZ、 110-4mol/L 的次氯酸钠体系， 和硫化 氢在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲溶液中， 利用荧光检测器测得的探针的发光强度随硫 化氢浓度的增加而降低， 并逐渐达到平衡的情况。 0069 其中横坐标。
28、为所加入的硫化氢样品浓度， 纵坐标为加入硫化氢后， 探针对其响应 的发光强度值。 0070 图 13 是实施例 6， 110-5mol/L 的 Ru-PTZ、 110-4mol/L 的次氯酸钠体系， 和硫化 氢在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲溶液中， 利用荧光检测器测得的探针的发光强度随硫 化氢浓度的增加而降低的线性关系情况。 0071 其中横坐标为所加入硫化氢浓度的对数， 纵坐标为加入硫化氢后， 探针对硫化氢 响应后的发光强度值。 0072 图 14 是实施例 7， 验证 110-5mol/L 的 Ru-PTZ、 110-4mol/L 的次氯酸钠体系在 pH=7.4 的 0。
29、.1mol/L 磷酸盐缓冲溶液中， 对硫化氢高选择性图示。 0073 其中横坐标为向检测体系中所加入的被检测组份， 纵坐标为加入被检测组份后探 针的发光强度值。 0074 图 15 是实施例 8， 考察 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸盐缓 冲溶液中， 对次氯酸钠和硫化氢的可逆循环响应图示。 0075 其中横坐标为循环次数， 纵坐标为加入次氯酸钠或硫化氢后， 探针对其发光强度 响应值。 0076 图 16 是实施例 11， 利用 110-5mol/L 的 Ru-PTZ（pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸盐缓 冲溶 液） ， 监控细胞内探。
30、针对次氯酸钠响应的发光成像情况。 0077 其中 (a) 是细胞在 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 探针中孵育 150min 后， 用 450nm 波长 激发， 在470nm-700nm发射范围接收的发光成像情况 ； (b)是细胞在110-5mol/L的Ru-PTZ 探针中孵育 150min 后的明场成像 ； (c) 是图 (a) 与 (b) 相互叠加的结果。(d) 是细胞在 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 探针中孵育 120min 后， 再加入少量佛波醇 12- 十四酸酯 -13- 乙酸 醋 （PMA） ， 继续培育30min后， 用450nm波长激发， 在470nm-700。
31、nm发射范围接收的发光成像 情况 ； (e) 是与 (d) 对应的明场成像 ； (f) 是图 (d) 与 (e) 相互叠加的结果。 0078 图 17 是实施例 12， 利用 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸盐缓 说 明 书 CN 103604783 A 9 7/12 页 10 冲溶液， 监控次氯酸钠和硫化氢在小白鼠活体内氧化还原循环时的发光成像情况。 0079 其中 （a） 是向小白鼠腿部皮层注射 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 后的发光成像情况 ； （b） 是向上述小白鼠腿部皮层注射过 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 的位。
32、置， 再注入 110-4mol/L 的ClO-后的发光成像情况 ；（c） 是向上述小白鼠腿部皮层注射过110-5mol/L的Ru-PTZ和 110-4mol/L 的 ClO-的位置， 再次注入 110-4mol/L H2S 后的发光成像情况 ； (d) 是向上述 小白鼠腿部皮层注射过 H2S 的位置， 再次注入 110-4mol/L ClO-后的发光成像情况。 0080 表 1 是实施例 9， 利用 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲 溶液中， 对不同浓度次氯酸钠回收率的测定结果。 0081 表 2 是实施例 10， 利用 110-5mo。
33、l/L 的 Ru-PTZ、 110-4mol/L 次氯酸钠体系在 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲溶液中， 对不同浓度硫化氢回收率的测定结果。 具体实施方式 0082 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明， 但不以 任何方式限制本发明。 0083 下述实施例中所用 Ru-PTZ 按下述方法制备 ： 0084 孙世国， 孙立成， 杨洋， 彭孝军， 樊江莉， 刘凤玉。分子内带有吩噻嗪供电基团的联 吡啶钌 / 锇 ECL 标记物， 中国发明专利 （公开号 101531683A） 实施例 1 所记载方法制备。 0085 实施例 1 0086 使用 LS55 型荧。
34、光检测器， 选择 Ru-PTZ 发光探针分子的浓度为 110-5mol/L， 设 定激发光波长为 450nm， 扫描波长范围为 470nm-700nm， 所使用的缓冲溶液为 pH=7.4 的 0.1mol/L 的磷酸盐缓冲溶液。向检测体系中加入相同浓度 （110-4mol/L） 不同种类的活性 氧物种 （所加入的活性氧物种为 ： 次氯酸钠、 钼酸钠、 H2O2、 OH） ， 考察探 针对不同活性氧物 种的响应情况。从图 1 可以看出， 相比其他的活性氧物种， 探针对次氯酸钠具有专一、 高灵 敏响应， 并且响应非常迅速。 0087 实施例 2 0088 使用 LS55 型荧光检测器， 选择 Ru。
35、-PTZ 发光探针分子的浓度为 110-5mol/L， 设定激发光波长为 450nm， 扫描波长范围为 470nm-700nm， 所使用的缓冲溶液为 pH=7.4 的 0.1mol/L 的磷酸盐缓冲溶液。向检测体系中加入不同浓度的次氯酸钠， 观察其对探 针发光强度的影响。通过图 2 可以观察到， 向检测体系中加入次氯酸钠后， 探针的发光 强度随次氯酸钠浓度均匀增加， 同时结合图 3 可知， 当次氯酸钠的浓度达到 110-4mol/ L 时， 探针的发光强度增加达到饱和， 此后探针的发光强度不再随次氯酸钠浓度的增加而 变化。根据图 4 可知， 探针的发光强度值 （LMax）与次氯酸钠浓度的对数 。
36、（logClO-）在 110-9mol/L 110-4mol/L 次氯酸钠浓度范围内呈现良好的线性关系， 线性方程为 ： LMax=546.28+54.38logClO-， 线性相关系数为 0.9961。根据公式计算 (LOD=3/k， 式中 ： 代表次氯酸钠加入之前探针发光强度的标准偏差， k 代表探针发光强度与次氯酸钠浓度 对数之间线性关系的斜率 ) 可知， 次氯酸钠的检测限为 1.810-11mol/L。 0089 实施例 3 0090 使用 LS55 型荧光检测器， 选择 Ru-PTZ 发光探针的浓度为 110-5mol/L， 设定激发 光波长为 450nm， 扫描波长范围为 470n。
37、m-700nm， 所使用的缓冲溶液为 pH=7.4 的 0.1mol/L 说 明 书 CN 103604783 A 10 8/12 页 11 的磷酸盐缓冲溶液。向检测体系中加入不同种类， 110-4mol/L 的干扰离子或物质， 然后再 加入 110-4mol/L 的次氯酸钠， 考察所加入的干扰离子或物质， 是否会对检测产生影响， 从 而考察探针对次氯酸钠的选择性。根据图 5 可知， 探针对所加入的几种干扰离子或物质的 响应较弱， 而对次氯酸钠具有很强的响应。 所以即使在上述干扰组份或物质存在的情况下， 探针仍然会对次氯酸钠产生专一性、 高灵敏的响应。 0091 实施例 4 0092 使用 L。
38、S55 型荧光检测器， 选择 Ru-PTZ 发光探针分子的浓度为 110-5mol/L， 设 定激发光波长为 450nm， 扫描波长范围为 470nm-700nm， 所使用的缓冲溶液为 pH=7.4 的 0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液。 向检测体系中加入不同浓度的次氯酸钠， 观察其对探针发光 强度的影响。通过图 6 可以看到， 当向检测体系中加入次氯酸钠后， 探针的发光 强度随次 氯酸钠浓度均匀增加， 同时结合图 7 可知， 当次氯酸钠的浓度达到 110-4mol/L 时， 探针的 发光强度增加达到饱和， 此后探针的发光强度不再随次氯酸钠浓度的增加而变化。 0093 实施例 5 0094 。
39、使用 LS55 型荧光检测器， 选择 Ru-A-PTZ 发光探针分子的浓度为 110-5mol/L， 设定激发光波长为 450nm， 扫描波长范围为 470nm-700nm， 所使用的缓冲溶液为 pH=7.4 的 0.1mol/L 的磷酸盐缓冲溶液。向检测体系中加入不同浓度的次氯酸钠， 观察其对探针发 光强度的影响。通过图 8 可以观察到， 当向检测体系中加入次氯酸钠后， 探针的发光强度 随次氯酸钠浓度均匀增加， 同时结合图 9 可知， 当次氯酸钠浓度达到 110-4mol/L 时， 探针 的发光强度增加达到饱和， 此后探针的发光强度不再随次氯酸钠浓度的增加而变化。根据 图 10 可知， 加入。
40、次氯酸钠后探针发光强度与加入次氯酸钠前探针发光强度的差值 (LMax) 与次氯酸钠浓度的对数 （logClO-） 在 110-9mol/L 110-6mol/L 次氯酸钠浓度范围 内呈现良好的线性关系， 线性方程为 ： LMax=54.3315+3.15321logClO-， 线性相关系数为 0.99298。 根据公式计算(LOD=3/k， 式中 ： 代表次氯酸钠加入之前探针发光强度的标准 偏差， k 代表探针发光强度与次氯酸钠浓度对数之间线性关系的斜率 ) 可知， 次氯酸钠的检 测限为 1.0110-9mol/L。 0095 实施例 6 0096 使用 LS55 型荧光检测器， 选择 Ru-。
41、PTZ 发光探针分子的浓度为 110-5mol/L， 设 定激发光波长为 450nm， 扫描波长范围为 470nm-700nm， 所使用的缓冲溶液为 pH=7.4 的 0.1mol/L 的磷酸盐缓冲溶液。根据实施例 2 的实验数据， 先向体系中加入 110-4mol/L 的 次氯酸钠， 使探针的发光强度达到最大值， 然后向体系中再加入不同浓度的硫化氢， 观察加 入硫化氢后， 探针发光强度变化情况。通过图 11 可以看到， 当向检测体系中加入硫化氢后， 探针的发光强度随硫化氢浓度的增加而均匀降低。同时结合图 12 可知， 当硫化氢样品的浓 度达到 110-4mol/L 时， 探针的发光强度降到最。
42、低， 此后探针的发光强度不再随硫化氢样 品浓度的增加而变化。同时结合图 13 可知， 探针的发光强度值 （LMax） 与硫化氢样品浓度的 对数值 （logH2S） 在 110-9mol/L 110-4mol/L 硫化氢浓度范围内呈现良好的线性关 系， 线性方程为 ： LMax=231.9194-62.6113logH2S， 线性相关系数为0.99308。 根据公式计算 (LOD=3/k， 式中 ： 代表硫化氢加入之前探针发光强 度的标准偏差， k 代表探针发光强 度与硫化氢浓度对数之间线性关系的斜率 ) 可知， 硫化氢的检测限为 1.210-11mol/L。 0097 实施例 7 说 明 书 。
43、CN 103604783 A 11 9/12 页 12 0098 使用 LS55 型荧光检测器， 选择 Ru-PTZ 发光探针分子的浓度为 110-5mol/L， 设 定激发光波长为 450nm， 扫描波长范围为 470nm-700nm， 所使用的缓冲溶液为 pH=7.4 的 0.1mol/L 的磷酸盐缓冲溶液。为了考察 Ru-PTZ、 次氯酸钠体系对硫化氢样品的选择性， 向检测体系中加入不同种类的还原性物质， 观察 Ru-PTZ、 次氯酸钠体系对硫化氢和其它还 原性物质的响应情况。根据图 14 可以看到， 当向体系中加入不同种类的还原性物质时， Ru-PTZ、 次氯酸钠体系对硫化氢具有高度的。
44、选择性， 同时响应时间较短， 能够迅速实现对硫 化氢样品的检测。 0099 实施例 8 0100 使用 LS55 型荧光检测器， 选择 Ru-PTZ 发光探针分子的浓度为 110-5mol/L， 设 定激发光波长为 450nm， 扫描波长范围为 470nm-700nm， 所使用的缓冲溶液为 pH=7.4 的 0.1mol/L 的磷酸盐缓冲溶液。为了考察 Ru-PTZ 发光探针对次氯酸钠和硫化氢的循环响应 性能， 分别向体系中加入次氯酸钠和硫化氢样品， 加入次氯酸钠后， 使探针的发光强度值达 到最大， 然后再向体系中加入足以使发光强度回到原始值的硫化氢样品， 如此反复。 结果如 图 15 所示，。
45、 根据图 15 得出， 该探针可以对次氯酸钠和硫化氢样品进行循环检测， 循环次数 在 10 次以上。 0101 实施例 9 0102 使用 LS55 型荧光检测器， 选择 Ru-PTZ 发光探针分子的浓度为 110-5mol/L， 设 定激发光波长为 450nm， 扫描波长范围为 470nm-700nm， 所使用的缓冲溶液为 pH=7.4 的 0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。 为了考察利用Ru-PTZ作为发光探针检测次氯酸钠的准确性， 分别配制 4 种不同浓度的次氯酸钠溶液 ： 5.010-9mol/L ； 1.010-7mol/L ； 5.010-6mol/ L ； 1.010-4mol/。
46、L， 并利用 110-5mol/L 的 Ru-PTZ 对上述 4 种不同浓度的次氯酸钠溶液分 别进行发光检测， 每一种浓度分别检测三次。将每一次探针对次氯酸钠的响应发光强度值 代入实施例 2 所得的线性方程中， 得到待测次氯酸钠溶液的相应浓度。将三次检测所得响 应浓度的平均值作为检测浓度， 计算回收率和相对标准偏差 （RSD） 。结果 如表 1 所示。由 表 1 中数据分析可知， 利用该探针检测次氯酸钠时， 回收率在 98.7%-111% 范围内波动。相 对标准偏差不超过1.54%。 这些结果都表明利用Ru-PTZ作为发光探针对次氯酸钠进行检测 是非常可靠的。 0103 表 1 发光探针 Ru。
47、-PTZ（10M， pH=7.4， 0.1M PBS） 检测次氯酸钠回收率结果 0104 说 明 书 CN 103604783 A 12 10/12 页 13 0105 实施例 10 0106 使用 LS55 型荧光检测器， 选择 Ru-PTZ 发光探针分子的浓度为 110-5mol/L， 设 定激发光波长为 450nm， 扫描波长范围为 470nm-700nm， 所使用的缓冲溶液为 pH=7.4 的 0.1mol/L 的磷酸盐缓冲溶液。为了考察利用 Ru-PTZ、 次氯酸钠体系检测硫化氢的准确性， 分别配制 4 个不同浓度的硫化氢溶液 ： 1.010-8mol/L ； 1.010-7mol/。
48、L ； 1.010-6mol/L ； 1.010-4mol/L， 并利用 110-5mol/L 的 Ru-PTZ、 1.010-4mol/L 的次氯酸钠体系对上述 4 种不同浓度的硫化氢溶液分别进行发光检测， 每一种浓度分别检测三次。将每一次探针对 硫化氢的响应发光强度值代入实施例 6 所得的线性方程中， 得到响应的检测浓度。将三次 检测所得响应浓度的平均值作为检测浓度， 计算回收率和相对标准偏差 （RSD） 。 结果如表2 所示。利用该体系检测硫化氢时， 回收率在 102%-105% 范围内波动。相对标准偏差不超过 5.8%。这些结果都表明利用 Ru-PTZ、 次氯酸钠体系对硫化氢进行发光检测是非常可靠的。 0107 表 2 发光探针 Ru-PTZ 的氧化态 （10M Ru-PTZ+1.010-4mol/L 次氯酸 钠， pH=7.4， 0.1M PBS） 检测硫化氢回收率结果 0108 说 明 书 CN 103604783 A 13 11/12 页 14 0109 实施例 11 0110 利用 pH=7.4 的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲溶液， 配制 110-5mol/L Ru-PTZ 发光探 针溶液。。