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1、10申请公布号CN104072595A43申请公布日20141001CN104072595A21申请号201410314554922申请日20140703C07K14/415200601C12N15/29200601C12N15/84200601A01H5/0020060171申请人中国农业科学院作物科学研究所地址100081北京市海淀区中关村南大街12号72发明人孔秀英张丽娜张立超赵光耀夏川刘骥贾继增74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅陈晓庆54发明名称TABZIP60蛋白及其编码基因与应用57摘要本发明公开了一种TABZIP60蛋白及其编码基因与应用，本发明公开。
2、的TABZIP60蛋白及其编码基因可以提高植物的抗逆性以及对ABA的敏感性。本发明公开的一种蛋白，为如下1或2所示1SEQIDNO2所示的蛋白；2将SEQIDNO2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明公开的TABZIP60蛋白及其编码基因在提高植物抗旱、抗盐和抗冻害性方面具有重要作用。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表7页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表7页附图3页10申请公布号CN104072595ACN104072595A1/1页21一种蛋白，为如下1或2所示1SEQID。
3、NO2所示的蛋白；2将SEQIDNO2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。2权利要求1所述蛋白的编码基因。3根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下中至少一种1SEQIDNO1所示的DNA分子；2SEQIDNO9中自5末端起第32位至第1117位核苷酸所示的DNA分子；3在严格条件下与1或2限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；4与1或2或3限定的DNA分子具有90以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。4含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5一种制备转TA。
4、BZIP60基因植物的方法，包括如下步骤将权利要求2或3所述编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗逆性和/或脱落酸敏感性增强。6根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述编码基因是通过重组农杆菌导入的，所述重组农杆菌是将含有所述编码基因的重组质粒导入农杆菌得到的；所述重组质粒是将SEQIDNO9所示的DNA分子或SEQIDNO9中自5末端起第32位至第1117位核苷酸所示的DNA分子通过BP反应重组到入门载体上，得到入门质粒；再将入门质粒与目标载体通过LR反应，最终得到目的重组质粒；所述入门载体具体为PDONRTM/ZEO，该载体具体购自INVITROGEN公司，。
5、产品目录号为12535035；所述目标载体具体为PEARLEYGATE100，该载体具体购自INVITROGEN公司。所述农杆菌具体为农杆菌GV3101PMP90。7根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述植物为拟南芥。8根据权利要求57任一所述的方法，其特征在于所述抗逆性为抗冻害性、抗盐性和/或抗旱性。9权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因在提高植物抗逆性和/或脱落酸敏感性中的应用。10根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述抗逆性为抗冻害性、抗盐性和/或抗旱性；所述植物为拟南芥。权利要求书CN104072595A1/7页3TABZIP60蛋白及其编码基因与应用技术领域00。
6、01本发明涉及新的蛋白及其编码基因与应用；特别是涉及一种TABZIP60蛋白及其编码基因与应用，属于生物技术领域。背景技术0002由于植物自身生长特点，从种子发育到植株死亡的整个生命过程中，无时无刻不受到干旱、低温和盐等非生物逆境的胁迫。为了在残酷的自然环境中生存下来，植物通过长期的进化，形成了一系列有效的防御机制。包括细胞水平、生理生化和分子水平的机制。植物首先感受逆境信号，通过体内信号传递过程，最后诱导功能蛋白和调节基因表达，使植物产生抗逆性。0003近年来，气候异常，水资源奇缺，可用耕地减少，盐碱地增多，这些不利因素严重威胁国家粮食安全。小麦是我国主要的粮食作物，培育高产抗逆的小麦品种是。
7、保证国家粮食安全的重要措施，抗逆相关基因的挖掘是抗逆分子育种的基石。转录因子在植物抗逆中扮演了非常重要的角色，作为反式作用因子，与逆境相关基因的顺式作用元件结合，激活其下游抗逆基因表达。使植物产生抗逆性。BZIP是植物中普遍存在的一类转录因子家族，它几乎参与调控植物的所有生命现象，如抗逆。在拟南芥和水稻中抗逆相关的BZIP转录因子的功能研究相对比较深入。由于小麦基因组的复杂性，使其整体研究水平比较滞后。小麦的BZIP转录因子抗逆功能研究相对较少。筛选抗逆相关的BZIP转录因子基因，为小麦抗逆分子育种提供候选基因具有重要意义。发明内容0004本发明的目的是提供一种TABZIP60蛋白及其编码基因。
8、与应用，本发明提供的TABZIP60蛋白及其编码基因可以提高植物的抗逆性以及对ABA的敏感性。0005本发明提供一种蛋白，为如下1或2所示00061SEQIDNO2所示的蛋白；00072将SEQIDNO2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。0008所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。0009上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种00101SEQIDNO1所示的DNA分子；00112SEQIDNO9中自5末端起第32位至第1117位核苷酸所示的DNA分子；00123在严格条件下与1或2限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；。
9、00134与1或2或3限定的DNA分子具有90以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。0014含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。说明书CN104072595A2/7页40015一种制备转TABZIP60基因植物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤将上述任一所述编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗逆性和/或脱落酸敏感性增强。0016上述方法中，所述编码基因是通过重组农杆菌导入的，所述重组农杆菌是将含有所述编码基因的重组质粒导入农杆菌得到的；0017所述重组质粒是将SEQIDNO9所示的DNA分子或SE。
10、QIDNO9中自5末端起第32位至第1117位核苷酸所示的DNA分子通过BP反应重组到入门载体上，得到入门质粒；再将入门质粒与目标载体通过LR反应，最终得到目的重组质粒；0018所述入门载体具体为PDONRTM/ZEO，该载体具体购自INVITROGEN公司，产品目录号为12535035；0019所述目标载体具体为PEARLEYGATE100，该载体具体购自INVITROGEN公司；0020所述目标载体PEARLEYGATE100在文献“UNVERT,TURKTASM,BUDAKHINPLANTAEVIDENCEFORTHEINVOLVEMENTOFAUBIQUITINCONJUGATINGE。
11、NZYMEUBCE2CLADEINNEGATIVEREGULATIONOFDISEASERESISTANCEPLANTMOLBIOLREP2013,31323334”中公开过；0021所述农杆菌具体为农杆菌GV3101PMP90，该菌在文献“ERAA,TOMINAGAM,EBINEK,AWAIC,SAITOC,ISHIZAKIK,YAMATOK,KOHCHIT,MAKANOA,UEDATAPPLICATIONOFLIFEACTFACTINDYNAMICSINARABIDOPSISTHALIANAANDTHELIVERWORT,MARCHANTIAPOLYMORPHAPLANTCELLPHYSI。
12、OL2009,5010411048”中公开过。0022上述任一所述的方法中，所述植物为拟南芥。0023上述任一所述的方法中，所述抗逆性为抗冻害性、抗盐性和/或抗旱性。0024上述的蛋白、上述任一所述的编码基因在提高植物抗逆性和/或脱落酸敏感性中的应用也属于本发明的保护范围。0025上述应用中，所述抗逆性为抗冻害性、抗盐性和/或抗旱性；0026所述植物为拟南芥。0027本发明提供的TABZIP60蛋白及其编码基因在提高植物抗旱、抗盐和抗冻害性方面具有重要作用。附图说明0028图1为低温胁迫下小麦TABZIP60基因的相对表达量。0029图2为盐胁迫下小麦TABZIP60基因的相对表达量。0030。
13、图3为PEG胁迫下小麦TABZIP60基因的相对表达量。0031图4为ABA处理下小麦TABZIP60基因的相对表达量。0032图5为低温胁迫下拟南芥的表型。0033图6为盐胁迫下拟南芥的表型。0034图7为干旱胁迫下拟南芥的表型。0035图8为ABA处理下拟南芥的表型。具体实施方式说明书CN104072595A3/7页50036下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。0037下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0038KODPLUS高保真酶购自TOYOBO公司,产品目录号为KOD201。0039入门载体PDONRTM/ZEO购自INVITROGE。
14、N公司，产品目录号为12535035。0040BPCLONASETMENZYMEMIX购自INVITROGEN公司，产品目录号为11789013。0041目标载体PEARLEYGATE100在文献“UNVERT,TURKTASM,BUDAKHINPLANTAEVIDENCEFORTHEINVOLVEMENTOFAUBIQUITINCONJUGATINGENZYMEUBCE2CLADEINNEGATIVEREGULATIONOFDISEASERESISTANCEPLANTMOLBIOLREP2013,31323334”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。0042LRCLONASE。
15、TMENZYMEMIX购自INVITROGEN公司，产品目录号为11791019。0043GV3101PMP90在文献“ERAA,TOMINAGAM,EBINEK,AWAIC,SAITOC,ISHIZAKIK,YAMATOK,KOHCHIT,MAKANOA,UEDATAPPLICATIONOFLIFEACTFACTINDYNAMICSINARABIDOPSISTHALIANAANDTHELIVERWORT,MARCHANTIAPOLYMORPHAPLANTCELLPHYSIOL2009,5010411048”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。0044拟南芥ARABIDOPSI。
16、STHALIANACOLUMBIA0亚型在文献“ZHANGLC,ZHAOGY,XIAC,JIAJZ,LIUXANDKONGXYAWHEATR2R3MYBGENE,TAMYB30B,IMPROVESDROUGHTSTRESSTOLERANCEINTRANSGENICARABIDOPSISJEXPBOT,2012,6358735885”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。0045中国春小麦CHINESESPRINGWHEAT在文献“GUOZA,SONGYX,ZHOURH,RENZL,JIAJZDISCOVERY,EVALUTIONANDDISTRIBUTIONOFHAPLOTYPE。
17、SOFTHEWHEATPADD1GENENEWPHYTOLOGIST2010,185,841851”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。0046实施例1、TABZIP60蛋白及其编码基因的发现0047为了研究小麦BZIP基因在植物抗逆方面的功能，通过生物信息学的方法，从本实验室已经测序的30000条非冗余的小麦全长CDNA序列中筛选出22个编码小麦BZIP蛋白的基因。通过半定量PCR的方法，对该22个小麦BZIP基因在逆境条件下的表达模式进行研究，筛选出受逆境诱导表达的TABZIP60基因。0048TABZIP60基因全长CDNA为1741BP，序列如SEQIDNO1所示。00。
18、49其开放阅读框如SEQIDNO1中自5末端起第3821467位核苷酸所示，TABZIP60蛋白由361个氨基酸残基组成，序列如SEQIDNO2所示。0050实施例2、TABZIP60基因在不同逆境胁迫下的转录水平表达模式0051一、TABZIP60基因在低温胁迫下的表达模式0052对两叶一心期的中国春小麦幼苗置于4处理，分别在处理前0H、处理后1、3、6、12、24和48小时提取小麦幼苗叶子组织的RNA，反转录成CDNA,以其CDNA为模板，进行实时定量PCR分析，得到TABZIP60基因的相对表达量，内参是小麦TUBULIN基因。TABZIP60基因所采用引物如下0053上游引物15CAC。
19、CGATGCCGTATGTTTT3SEQIDNO30054下游引物25TGCCACCTCAGTCTCCAAT3SEQIDNO40055结果如图1所示。说明书CN104072595A4/7页60056图1表明，TABZIP60基因响应低温胁迫诱导。0057二、TABZIP60基因在盐胁迫下的表达模式0058对两叶一心期的中国春小麦幼苗置于250MMNACL水溶液中进行处理，分别在处理前0H、处理后1、3、6、12、24和48小时提取小麦幼苗根组织的RNA，反转录成CDNA,以其CDNA为模板，以上游引物1和下游引物2为引物，进行实时定量PCR分析，得到TABZIP60基因的相对表达量，内参是小麦。
20、TUBULIN基因。0059结果如图2所示。0060图2表明，TABZIP60基因响应盐胁迫诱导。0061三、TABZIP60基因在干旱胁迫下的表达模式0062对两叶一心期的中国春小麦幼苗置于161G/100ML的PEG6000水溶液中进行处理，分别在处理前0H、处理后1、3、6、12、24和48小时提取小麦幼苗根组织的RNA，反转录成CDNA,以其CDNA为模板，以上游引物1和下游引物2为引物，进行实时定量PCR分析，得到TABZIP60基因的相对表达量，内参是小麦TUBULIN基因。0063结果如图3所示。0064图3表明，TABZIP60基因响应干旱胁迫诱导。0065四、TABZIP60。
21、基因在ABA胁迫下的表达模式0066对两叶一心期的中国春小麦幼苗置于200MABA水溶液中进行处理，分别在处理前0H、处理后1、3、6、12、24和48小时提取小麦幼苗根组织的RNA，反转录成CDNA,以其CDNA为模板，以上游引物1和下游引物2为引物，进行实时定量PCR分析，得到TABZIP60基因的相对表达量，内参是小麦TUBULIN基因。0067结果如图4所示。0068图4表明，TABZIP60基因响应ABA诱导表达。0069实施例3、转TABZIP60基因植株的获得和耐逆性鉴定0070一、利用GATEWAY技术构建过表达载体，步骤如下00711、ATTB引物设计0072上游引物35GC。
22、ATGGATTTTCCGGGAGGG3SEQIDNO50073下游引物45TTACCAAGGGCCCGTCAGCG3SEQIDNO600742、根据GATEWAY技术构建表达载体的需要，在上游引物3和下游引物4的5端分别加入ATTB1和ATTB2重组位点下划线标注ATTB1和ATTB2重组位点，分别得到上游引物5和下游引物6。0075上游引物55GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGATTTTCCGGGAGGG30076SEQIDNO70077下游引物65GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACCAAGGGCCCGTCAGCG30078。
23、SEQIDNO800793、以中国春小麦的CDNA为模板，用上游引物5和下游引物6进行PCR扩增，得到ATTBPCR产物，如SEQIDNO9所示，为保证PCR过程的保真性，使用KODPLUS高保真酶进行PCR反应，PCR反应体系和反应程序如下0080说明书CN104072595A5/7页700810082TABZIP60基因序列如SEQIDNO9中自5末端起第32位至第1117位核苷酸所示。00834、按照如下体系和程序进行BP重组反应，得到BP反应产物008400855、入门质粒的获得0086将25LBP反应产物加入50LTOP10感受态细胞进行转化，冰浴30MIN，42热击90S，然后迅速。
24、置于冰上2MIN。加入500LLB培养液，37，210RPM/MIN复苏50MIN，复苏液均匀涂布于加有ZEOCIN浓度为40G/ML的固体LB选择培养基表面，37倒置培养过夜。PDONRTM/ZEO载体自身带有致死基因，不能在培养基上生存。通过步骤4的BP重组反应目标基因片段会取代致死基因，最终得到的克隆即为入门克隆ENTRYCLONE，质粒为入门质粒，将入门质粒送测序，结果正确。00876、按照如下体系和程序进行LR重组反应，得到LR反应产物0088说明书CN104072595A6/7页800897、目标质粒的获得0090转化过程同步骤5，只是将ZEOCIN替换为卡那霉素浓度为50G/ML。
25、。PEARLEYGATE100载体同样带有致死基因，通过LR重组反应致死基因将会被目标基因片段取代，得到的克隆即为目标克隆DESTIANTIONCLONE，质粒为目标质粒，将目标质粒送测序，结果正确。0091二、转TABZIP60基因拟南芥的获得00921、将步骤一获得的目标质粒转化农杆菌GV3101PMP90，得到重组农杆菌。00932、拟南芥侵染及转基因植株筛选及鉴定00941拟南芥的培养0095将拟南芥ARABIDOPSISTHALIANACOLUMBIA0亚型种子用灭菌水含有体积百分含量为10次氯酸钠以及10吐温20的水溶液摇动消毒15MIN，在超净工作台中用灭菌水清洗上述消毒的种子至。
26、少5次。将清洗完的种子均匀播种在MS培养基上。MS平板于4春化3D，然后置于22光照培养箱培养一周。待小苗长出四片真叶后移栽至营养钵中培养，保湿23D。拟南芥的生长对温度比较敏感，2022为比较适宜的培养温度。当拟南芥植株生长至大部分花蕾处于即将开花状态时，进行农杆菌侵染。00962拟南芥的侵染0097采用沾花法用重组农杆菌对步骤1得到的拟南芥进行侵染，将侵染过的拟南芥平放于托盘中，黑暗保湿培养24H，然后放于正常培养条件下培养。拟南芥侵染1周后根据拟南芥的生长状态可再次侵染以提高转化效率，得到转TABZIP60基因拟南芥。00983阳性转TABZIP60基因拟南芥的初步筛选0099收集转TA。
27、BZIP60基因拟南芥T0代种子，于37烘箱中烘干68D，然后4春化3D。0100将种子直接撒播在营养钵中，22保湿培养1周。0101待小苗长出4片真叶后，通过喷洒除草剂BASTA进行阳性转TABZIP60基因拟南芥筛选，非阳性转TABZIP60基因拟南芥在喷洒3天后开始出现萎蔫并停止生长，2周后基本死亡。为了将非阳性转TABZIP60基因拟南芥苗彻底除净，可连续喷洒23次，每次间隔23D。01024阳性转TABZIP60基因拟南芥的鉴定0103CTAB法提取步骤3初步筛选获得的阳性转TABZIP60基因拟南芥叶片的基因组DNA，以其为模板，以基因特异性正向引物7和反向引物8进行PCR扩增，得。
28、到PCR扩增产物，说明书CN104072595A7/7页9将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。0104基因特异性正向引物75GCACCAGCATCAGCAGCAC3SEQIDNO100105基因特异性反向引物85GGATTCACCATCGGAGCAAA3SEQIDNO110106电泳结果表明，步骤3初步筛选获得的阳性转TABZIP60基因拟南芥在PCR扩增之后有约570BP的目的条带，进一步确定为转TABZIP60基因拟南芥。0107将野生型拟南芥进行上述鉴定实验无目的条带。0108用上述方法进行鉴定，直至获得T3代纯合转TABZIP60基因拟南芥以下简称T3代转TABZIP60基因拟南芥。0。
29、109三、转TABZIP60基因拟南芥的抗逆性及ABA表型鉴定01101、抗冻性分析0111将野生型拟南芥WT和三个T3代转TABZIP60基因拟南芥L1，L11，L26的种子在22，12H光照下进行培养，得到3周幼苗，然后将各幼苗在10处理3小时，再恢复培养4天，冷处理前后的各幼苗的生长状态如图5所示。0112图5表明，与野生型拟南芥相比，转TABZIP60基因拟南芥的抗冻性明显提高。01132、抗盐性分析0114将野生型拟南芥WT和三个T3代转TABZIP60基因拟南芥L1，L11，L26的种子在22，12H光照下进行垂直培养，得到5天幼苗，将各幼苗转移到含150MMNACL的MS培养基上。
30、垂直培养，并分别以在不含NACL的MS培养基上垂直培养得到的幼苗为对照。各幼苗的状态如图6所示。0115图6表明，150MMNACL处理后，转TABZIP60基因拟南芥的根长比野生型植株的长，野生型拟南芥的根长明显受到抑制，从而说明转TABZIP60基因拟南芥的抗盐性明显提高。01163、抗旱性分析0117将野生型拟南芥WT和三个T3代转TABZIP60基因拟南芥L1，L11，L26的种子在22，12H光照下进行培养，得到3周幼苗，将幼苗干旱处理而后复水，具体为种幼苗前浇足营养液，之后一直不浇营养液，大约35天后，再浇营养液。干旱处理前后以及复水后的各幼苗的状态如图7所示。0118图7表明，野。
31、生型拟南芥的幼苗在干旱处理后死亡，而转基因拟南芥有一定比例的存活。进一步表明转TABZIP60基因拟南芥的抗旱性明显提高。01194、ABA脱落酸敏感性分析0120将野生型拟南芥WT和三个T3代转TABZIP60基因拟南芥L1，L11，L26的种子在22，12H光照下进行垂直培养，得到5天幼苗，将各幼苗转移到含5MABA的MS培养基上垂直培养，并分别以在不含ABA的MS培养基上垂直培养得到的幼苗为对照。各幼苗的状态如图8所示。0121图8表明，转TABZIP60基因拟南芥对ABA的敏感性提高。说明书CN104072595A1/7页1000010002序列表CN104072595A102/7页110003序列表CN104072595A113/7页120004序列表CN104072595A124/7页130005序列表CN104072595A135/7页140006序列表CN104072595A146/7页150007序列表CN104072595A157/7页16序列表CN104072595A161/3页17图1图2图3图4图5说明书附图CN104072595A172/3页18图6图7说明书附图CN104072595A183/3页19图8说明书附图CN104072595A19。