一种草莓专用抗重茬生物有机肥的制备方法技术领域
本发明属于生物有机肥技术领域，具体涉及一种草莓专用抗重茬生物有机肥的制
备方法。
背景技术
“草莓”素有“水果皇后”之称，深受消费者喜爱。但“重茬病”是草莓栽培的一大难
题，其带来的草莓苗成活率低、结果少、病果\畸果多、果品品质下降等问题给草莓种植者带
来了极大的经济损失。许多研究指出，“重茬病”的主要病因归结为土壤病原菌增多、自毒物
质增多和土壤营养元素亏缺三方面。在提倡绿色、环保、有机、无公害生产的今天，化学农药
正逐渐被生物农药取代，化肥的使用量也正在减少，有机肥的重要性被提到新的高度。
蘑菇菌渣是种植食用菌以后的废菌糠，常由稻草、玉米芯、麦秸等组成，栽培后的
菌渣不仅含有粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、氮、磷、钾、钙、氨基酸等各类营养物质，还含有种类
繁多、数量庞大的微生物群落，尤其是纤维素降解类真菌数量较多，它们分泌的纤维素降解
酶和水解酶也较多。每年在种植蘑菇的地方都会产生大量菌渣，这些菌渣往往被就菇农抛
弃，这不仅是对资源的浪费，还会对环境造成污染。菇渣的肥料化一直是菇渣有效再利用的
重要途径之一。如专利（申请号：200910262948.3）就是对菇渣及禽畜粪便采用微生物发酵
技术进行处理后作为人造基质或有机肥再利用。菇渣质优价廉，将其作为发酵基质与功能
菌种相配合制成生物菌肥，有很好的应用前景和开发价值。
申请号为：201210021687.8，名称为：《一种防治草莓重茬病的生防制剂及制备方
法》的发明专利中提到一种防治草莓重茬病的生防制剂，以山百混合物（山柰与百部等重量
比）、玉米秸秆粉、麦麸为固体原料，以解酚菌为生防菌制成生防制剂很适合用于草莓重茬
地块，该制剂施入重茬地块后，能明显减轻土传病害的发病程度，降低土壤中强自毒物质对
羟基苯甲酸和苯甲酸的含量，促进草莓生长指标的发育，最终能显著提高草莓产量。本发明
产品主要适用于草莓枯萎病、菌核病和黄萎病等土传病害的防治，有利于优化草莓重茬土
壤的理化性状，不污染环境，对人畜安全，成本低，施用方便。但该菌剂配方中含有苦参、枳
实等6种中药材，来源并不十分广泛，而且他获得的是生物菌剂成品，因此制作不易，且难以
进行扩大化生产，且只有生物农药的作用而没有生物肥料的效果。
发明内容
本发明为了解决草莓重茬病的防治且同时提供草莓生物有机肥的问题，提供了一
种草莓专用抗重茬生物有机肥的制备方法。
本发明由如下技术方案实现的：一种草莓专用抗重茬生物有机肥的制备方法，将
畜禽粪和食用菌栽培后的菌渣混合，用解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)
JN2、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudanonaspalustris）和黑曲霉(Aspergillusnige)发
酵食用菌栽培后的菌渣和畜禽粪的混合物，即为草莓专用抗重茬生物有机肥，具体制备方
法如下：
（1）基质混合：将食用菌栽培后的菌渣与牛粪按重量比1:1混合均匀，调整C/N比值为20
~30，pH值调至中性，水分调节至55-65%；
（2）菌剂的制备：
A.解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2菌液的制备：4℃保存的解淀粉
芽孢杆菌JN2接种于羧甲基纤维素钠液体培养基上37℃，100~150rpm摇床培养过夜，制备成
种子液；
将种子液按体积比1%~5%的接种量接种于发酵罐中灭菌的羧甲基纤维素钠液体培养
基中，罐内压保持0.02-0.04MPa，温度37℃，溶解氧1.8±0.2mg/L，转速150r/min，发酵培养
两天，得到JN2发酵液，检测发酵液中有效活菌数为4×108cfu/mL；
B.沼泽红假单胞菌（Rhodopseudanonaspalustris）菌液的制备：GH培养基装满整支
试管，将沼泽红假单胞菌菌种无菌条件接种于GH培养基中，温度30℃，光照强度5000Lx静置
厌氧培养，至菌液变为深红色即得种子液；
将沼泽红假单胞菌扩大培养，培养基和培养条件与制备种子液的方法相同；当菌液颜
色变成深红色时，得到沼泽红假单胞菌发酵液，检测发酵液中有效活菌数为4×108cfu/mL；
C.黑曲霉(Aspergillusnige)菌剂的制备：黑曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖固体培
养基平板上，28℃温度倒置黑暗培养，待长出新鲜菌丝后，挑菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体
培养基中，28℃，100~150rpm摇床培养，待培养基中长出大量菌丝团后，即获得黑曲霉种子
液；
将小麦麸皮洒水拌匀，制成含水率55-65%的麸皮培养基，110-120℃高压灭菌后冷却，
按每千克麸皮培养基接入150mL菌液的比例接入黑曲霉种子液，搅拌均匀，28℃静置培养至
大量孢子产生时停止培养，将培养物置于30℃烘箱内烘干后即得黑曲霉菌粉；
（3）接种微生物发酵：按每平方米混合肥料中接入10kg的比例向混合肥料中加入黑曲
霉菌粉，拌匀后堆置发酵，当温度低于50℃时翻堆后继续发酵，发酵时间为30~45天；发酵完
成后，按每平方混合肥料中接入10L的比例分别加入解淀粉芽孢杆菌菌液和沼泽红假单胞
菌菌液，调整pH值为6~7，水分含量为55-65%，搅拌均匀后，摊成15-25cm的薄层进行第二次
发酵，控制温度为25~30℃，发酵7~10天后，将其搅拌均匀风干至含水率≤15%，即得到草莓
专用抗重茬生物有机肥。
所述羧甲基纤维素钠培养基配方为：羧甲基纤维素钠15g/L，酵母粉1g/L，磷酸二
氢钾1g/L，硝酸铵1g/L，硫酸镁0.5g/L；所述GH培养基配方为：磷酸二氢钾1g/L，乙酸钠1g/
L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵1g/L，氯化钠1g/L，氯化钙0.1g/L，琥珀酸钠1g/L，酵母粉0.5g/L，
蛋白胨0.5g/L，pH值6.2。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2在中国微生物菌种保藏
管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo:10677，保藏日期为：2015年4月1
日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码
为100101。
所述沼泽红假单胞菌（Rhodopseudanonaspalustris）菌种购自中国农业微生物
菌种保藏管理中心，编号ACCC10649。所述黑曲霉(Aspergillusnige)菌种购自中国普通
微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC3.6477。
所制备的草莓专用抗重茬生物有机肥总有效活菌数含量≥4×108CFU/mL。
本发明所采用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2针对草莓重
茬病的主要病原菌，对灰葡萄孢霉（BotrytiscinereaPers.，引起灰霉病）、镰刀菌属
（Fusariumspp.，引起枯萎病）、拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis，引起叶斑病）具有较强拮
抗作用，同时兼有良好的纤维素降解作用，与沼泽红假单胞菌（Rhodopseudanonas
palustris）和黑曲霉(Aspergillusnige)复合作为功能菌群。沼泽红假单胞菌具有增强
植物养分吸收、解毒和刺激植物生长功效；黑曲霉对纤维素具有较强分解能力。将价格低廉
且资源广泛的食用菌栽培后的菌渣和畜禽粪作为主要原料，用制备的复合功能菌群发酵，
发酵后的产物即为能有效防治草莓重茬障害的生物有机肥。
本发明所制备的草莓专用抗重茬生物有机肥与其它生物有机肥的区别在于，它同
时具有下列两种功能：（1）它针对草莓重茬病的主要三种病原菌有较强的拮抗作用，对草莓
重茬病有较高的防效。（2）食用菌栽培后的菌渣中含有丰富的有机质、矿质元素、微量元素、
有机营养物质及生物活性成分等，一方面使得以它为主要原料生产出来的有机肥具有养分
多样性、均衡性和长效性的特点，另一面为添加的功能微生物菌株生长提供了较好的物质
基础，有利于功能菌群的定殖和增殖。该生物有机肥是药也是肥，一招解决了重茬草莓的病
害和肥力问题，质优价廉，有很好的应用前景和开发价值。
附图说明
图1为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2在羧甲基纤维素钠固
体平板上培养2天后刚果红染色显示透明圈的结果图；图2为JN2菌株在羧甲基纤维素钠固
体平板上的形态特征图；图3为JN2菌种在40倍显微镜下观察细胞形态图；图4为活体组织法
测定JN2菌株对灰霉病的防效实验结果图，图中左图为对照组无菌水处理组，右图为JN2发
酵液处理组；图5为解淀粉芽孢杆菌JN2对镰刀菌属和拟盘多毛孢属病原菌的的平板对峙结
果图，图中：A：镰刀菌对照；B镰刀菌与JN2对峙；C：拟盘多毛孢菌对照；D：拟盘多毛孢菌与
JN2对峙；图6为还原糖法测定JN2菌株的滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力的葡萄糖标准
曲线图；图7为不同底物诱导下对JN2菌株的纤维素酶活检测结果图；图8为不同发酵温度对
JN2菌株的纤维素酶活检测结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步阐述，但并不用来限定本发明。
实施例1：一种草莓专用抗重茬生物有机肥的制备方法，将畜禽粪和食用菌栽培后
的菌渣混合，用解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2、沼泽红假单胞菌
（Rhodopseudanonaspalustris）和黑曲霉(Aspergillusnige)发酵食用菌栽培后的菌
渣和畜禽粪的混合物，即为草莓专用抗重茬生物有机肥，具体制备方法如下：
（1）基质混合：将食用菌栽培后的菌渣与牛粪按重量比1:1混合均匀，调整C/N比值为
20，pH值调至中性，水分调节至55%；
（2）菌剂的制备：
A.解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2菌液的制备：4℃保存的解淀粉
芽孢杆菌JN2接种于羧甲基纤维素钠液体培养基上37℃，100rpm摇床培养过夜，制备成种子
液；
将种子液按体积比1%的接种量接种于发酵罐中灭菌的羧甲基纤维素钠液体培养基中，
罐内压保持0.02MPa，温度37℃，溶解氧2.0mg/L，转速150r/min，发酵培养两天，得到JN2发
酵液，检测发酵液中有效活菌数为4×108cfu/mL；
B.沼泽红假单胞菌（Rhodopseudanonaspalustris）菌液的制备：GH培养基装满整支
试管，将沼泽红假单胞菌菌种无菌条件接种于GH培养基中，温度30℃，光照强度5000Lx静置
厌氧培养，至菌液变为深红色即得种子液；
将沼泽红假单胞菌扩大培养，培养基和培养条件与制备种子液的方法相同；当菌液颜
色变成深红色时，得到沼泽红假单胞菌发酵液，检测发酵液中有效活菌数为4×108cfu/mL；
C.黑曲霉(Aspergillusnige)菌剂的制备：黑曲霉菌种接种于常规PDA固体培养基
平板上，28℃温度倒置黑暗培养，待长出新鲜菌丝后，挑菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养
基中，28℃，100rpm摇床培养，待培养基中长出大量菌丝团后，即获得黑曲霉种子液；
将小麦麸皮洒水拌匀，制成含水率55%的麸皮培养基，110-120℃高压灭菌后冷却，按每
千克麸皮培养基接入150mL菌液的比例接入黑曲霉种子液，搅拌均匀，28℃静置培养至大量
孢子产生时停止培养，将培养物置于30℃烘箱内烘干后即得黑曲霉菌粉；
（3）接种微生物发酵：按每平方米混合肥料中接入10kg的比例向混合肥料中加入黑曲
霉菌粉，拌匀后堆置发酵，当温度低于50℃时翻堆后继续发酵，发酵时间为30天；发酵完成
后，按每平方混合肥料中接入10L的比例分别加入解淀粉芽孢杆菌菌液和沼泽红假单胞菌
菌液，调整pH值为6，水分含量为55%，搅拌均匀后，摊成15cm的薄层进行第二次发酵，控制温
度为25℃，发酵10天后，将其搅拌均匀风干至含水率≤15%，即得到草莓专用抗重茬生物有
机肥。
所述羧甲基纤维素钠培养基配方为：羧甲基纤维素钠15g/L，酵母粉1g/L，磷酸二
氢钾1g/L，硝酸铵1g/L，硫酸镁0.5g/L；所述GH培养基配方为：磷酸二氢钾1g/L，乙酸钠1g/
L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵1g/L，氯化钠1g/L，氯化钙0.1g/L，琥珀酸钠1g/L，酵母粉0.5g/L，
蛋白胨0.5g/L，pH值6.2。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2在中国微生物菌种保藏
管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo:10677，保藏日期为：2015年4月1
日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码
为100101。所制备的草莓专用抗重茬生物有机肥总有效活菌数含量≥4×108CFU/mL。
实施例2：一种草莓专用抗重茬生物有机肥的制备方法，将畜禽粪和食用菌栽培后
的菌渣混合，用解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2、沼泽红假单胞菌
（Rhodopseudanonaspalustris）和黑曲霉(Aspergillusnige)发酵食用菌栽培后的菌
渣和畜禽粪的混合物，即为草莓专用抗重茬生物有机肥，具体制备方法如下：
（1）基质混合：将食用菌栽培后的菌渣与牛粪按重量比1:1混合均匀，调整C/N比值为
25，pH值调至中性，水分调节至60%；
（2）菌剂的制备：
A.解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2菌液的制备：4℃保存的解淀粉
芽孢杆菌JN2接种于羧甲基纤维素钠液体培养基上37℃，120rpm摇床培养过夜，制备成种子
液；
将种子液按体积比3%的接种量接种于发酵罐中灭菌的羧甲基纤维素钠液体培养基中，
罐内压保持0.03MPa，温度37℃，溶解氧1.6mg/L，转速150r/min，发酵培养两天，得到JN2发
酵液，检测发酵液中有效活菌数为4×108cfu/mL；
B.沼泽红假单胞菌（Rhodopseudanonaspalustris）菌液的制备：GH培养基装满整支
试管，将沼泽红假单胞菌菌种无菌条件接种于GH培养基中，温度30℃，光照强度5000Lx静置
厌氧培养，至菌液变为深红色即得种子液；
将沼泽红假单胞菌扩大培养，培养基和培养条件与制备种子液的方法相同；当菌液颜
色变成深红色时，得到沼泽红假单胞菌发酵液，检测发酵液中有效活菌数为4×108cfu/mL；
C.黑曲霉(Aspergillusnige)菌剂的制备：黑曲霉菌种接种于常规PDA固体培养基
平板上，28℃温度倒置黑暗培养，待长出新鲜菌丝后，挑菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养
基中，28℃，120rpm摇床培养，待培养基中长出大量菌丝团后，即获得黑曲霉种子液；
将小麦麸皮洒水拌匀，制成含水率60%的麸皮培养基，110-120℃高压灭菌后冷却，按每
千克麸皮培养基接入150mL菌液的比例接入黑曲霉种子液，搅拌均匀，28℃静置培养至大量
孢子产生时停止培养，将培养物置于30℃烘箱内烘干后即得黑曲霉菌粉；
（3）接种微生物发酵：按每平方米混合肥料中接入10kg的比例向混合肥料中加入黑曲
霉菌粉，拌匀后堆置发酵，当温度低于50℃时翻堆后继续发酵，发酵时间为40天；发酵完成
后，按每平方混合肥料中接入10L的比例分别加入解淀粉芽孢杆菌菌液和沼泽红假单胞菌
菌液，调整pH值为7，水分含量为60%，搅拌均匀后，摊成20cm的薄层进行第二次发酵，控制温
度为28℃，发酵8天后，将其搅拌均匀风干至含水率≤15%，即得到草莓专用抗重茬生物有机
肥。
其他方法同实施例1所述方法。
实施例3：一种草莓专用抗重茬生物有机肥的制备方法，将畜禽粪和食用菌栽培后
的菌渣混合，用解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2、沼泽红假单胞菌
（Rhodopseudanonaspalustris）和黑曲霉(Aspergillusnige)发酵食用菌栽培后的菌
渣和畜禽粪的混合物，即为草莓专用抗重茬生物有机肥，具体制备方法如下：
（1）基质混合：将食用菌栽培后的菌渣与牛粪按1:1重量比混合均匀，调整C/N比值为
30，pH值调至中性，水分调节至65%；
（2）菌剂的制备：
A.解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2菌液的制备：4℃保存的解淀粉
芽孢杆菌JN2接种于羧甲基纤维素钠液体培养基上37℃，150rpm摇床培养过夜，制备成种子
液；
将种子液按体积比5%的接种量接种于发酵罐中灭菌的羧甲基纤维素钠液体培养基中，
罐内压保持0.04MPa，温度37℃，溶解氧1.6mg/L，转速150r/min，发酵培养两天，得到JN2发
酵液，检测发酵液中有效活菌数为4×108cfu/mL；
B.沼泽红假单胞菌（Rhodopseudanonaspalustris）菌液的制备：GH培养基装满整支
试管，将沼泽红假单胞菌菌种无菌条件接种于GH培养基中，温度30℃，光照强度5000Lx静置
厌氧培养，至菌液变为深红色即得种子液；
将沼泽红假单胞菌扩大培养，培养基和培养条件与制备种子液的方法相同；当菌液颜
色变成深红色时，得到沼泽红假单胞菌发酵液，检测发酵液中有效活菌数为4×108cfu/mL；
C.黑曲霉(Aspergillusnige)菌剂的制备：黑曲霉菌种接种于常规PDA固体培养基
平板上，28℃温度倒置黑暗培养，待长出新鲜菌丝后，挑菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养
基中，28℃，150rpm摇床培养，待培养基中长出大量菌丝团后，即获得黑曲霉种子液；
将小麦麸皮洒水拌匀，制成含水率65%的麸皮培养基，110-120℃高压灭菌后冷却，按每
千克麸皮培养基接入150mL菌液的比例接入黑曲霉种子液，搅拌均匀，28℃静置培养至大量
孢子产生时停止培养，将培养物置于30℃烘箱内烘干后即得黑曲霉菌粉；
（3）接种微生物发酵：按每平方米混合肥料中接入10kg的比例向混合肥料中加入黑曲
霉菌粉，拌匀后堆置发酵，当温度低于50℃时翻堆后继续发酵，发酵时间为45天；发酵完成
后，按每平方混合肥料中接入10L的比例分别加入解淀粉芽孢杆菌菌液和沼泽红假单胞菌
菌液，调整pH值为7，水分含量为65%，搅拌均匀后，摊成25cm的薄层进行第二次发酵，控制温
度为30℃，发酵10天后，将其搅拌均匀风干至含水率≤15%，即得到草莓专用抗重茬生物有
机肥。
其他方法同实施例1所述方法。
实验例1：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2的分离鉴定：
1.JN2的初筛：采集已经腐熟的牛粪样品10g，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，震荡
10min，充分混匀，即为10-1稀释液；取10-1稀释液1ml放入装有9ml无菌水的灭菌试管中，震
荡，充分混匀，即为10-2稀释液；如此重复，将土壤稀释到10-8浓度。取10-6、10-7、10-8浓度的
稀释液0.2ml涂布在羧甲基纤维素钠固体平板上，37℃，黑暗条件倒置培养。羧甲基纤维素
钠培养基配方为：羧甲基纤维素钠15g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硝酸铵1g/L，
硫酸镁0.5g/L。
2.复筛：待单菌落长出后，挑取单菌落接种于新的羧甲基纤维素钠固体平板，37
℃，恒温培养72h，刚果红染色复筛，筛选出透明圈较大的菌落，编号，转移到新的平板上，多
次划线培养纯化后接于羧甲基纤维素钠固体斜面上，4℃保存用于后续实验。
复筛获得多株透明圈较大的菌株，挑选其中一株培养2天，如图1所示，菌落直径
（d）为2mm，水解圈直径（D）为14mm，D/d值达7，编号为JN2。经人工富集培养，分离纯化得到的
JN2在羧甲基纤维素钠固体平板上的培养特征如图2所示，为：菌落边缘不整齐，呈放射状，
直径2~3cm，浅黄色，不透明，表面湿润。采用简单染色和革兰氏染色观察JN2细胞形态，见图
3，发现该菌呈杆状。
其形态学特征为：在羧甲基纤维素钠固体平板上菌落边缘不整齐，呈放射状，直径
2~3cm，浅黄色，不透明，表面湿润。革兰氏染色呈阳性，杆状，单个、成对或成串出现，有芽
孢，芽孢囊不膨大，芽孢椭圆形，中生。生理生化结果见表1。
表1菌株JN2的生理生化指标
指标
结果
指标
结果
过氧化氢酶实验
＋
水解淀粉实验
＋
接触酶实验
＋
甲基红实验
＋
D-葡萄糖实验
＋
明胶液化实验
＋
L-阿拉伯糖实验
＋
产硫化氢实验
＋
甘露醇实验
＋
柠檬酸实验
－
3.JN2菌株的分子鉴定：对筛选得到的JN2按如下步骤进行分子鉴定：挑取JN2单菌落接
于LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。取200μl菌液，12000rpm离心5min，弃上清，于沉淀
中加入40μl灭菌超纯水，充分混匀后，置于100℃水浴5min裂解，裂解液作为模板进行PCR反
应。PCR引物为通用引物27F和1492R，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列
为：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR体
系为：10×PCRBuffer5μL，dNTPs1.5μL，上下游引物各0.5μL，模板2μL，rTaq酶1μL，加
水补齐至50μL。PCR程序为94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃
5min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后送往北京华大生物工程技术有限公司测序。序
列经blast比对。经测序鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。16SrDNA
如SEQIDNo.1所示。
根据对菌株的形态学、培养特征、生理生化和分子鉴定的研究结果，菌株JN2鉴定
为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。解淀粉芽孢杆菌JN2在中国微生物菌
种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生
物研究所)保藏登记号为CGMCCNo:10677。
实验例2：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2对草莓主要土传病
害的防治作用测定：
1.解淀粉芽孢杆菌JN2对草莓灰霉病的防治：灰霉病在草莓生长期、花期、果期均有可
能发生，病原菌为灰葡萄孢霉（BotrytiscinereaPers.），其菌丝、菌核及分生孢子可以在
土壤或病残体上越冬或越夏，是草莓最严重的土传病害之一。采用叶片法测定JN2发酵原液
对草莓灰霉病的防效。将生长健康、大小一致的草莓叶片从叶柄处剪断，用自来水将叶片表
面冲洗干净，再用70%乙醇进行表面消毒，用灭菌水冲洗干净后，在JN2发酵液中浸渍3min，
晾干，叶面朝上放置于铺有无菌滤纸保湿的培养皿内，叶柄用浸湿的灭菌棉球包裹。灰霉菌
菌丝采取牙签划伤接种方式接种到叶片上。以无菌水代替发酵液作为对照。每组各30片叶
片。实验15天以后进行病害调查。根据每片叶子的变褐情况以目测法对病情进行记载。
草莓叶部病害按5级划分：0级：无病；1级：发病面积占叶表面积1/4以下；2级：发病
面积占叶表面积1/4-1/2；3级：发病面积占叶表面积1/2-1/3；4级：发病面积占叶表面积3/4
以上。
病情指数（%）=。
实验结果见表2、图4，结果显示：对照组只接种灰霉菌，几乎全部染病，叶片出现茶
褐色病斑，病斑逐渐扩大，15天后，有的整片叶子均变为茶褐色，且表面覆盖一层灰褐色菌
丝，病情指数达87.5%。实验组叶片先经JN2处理后再接种HM，15天后，仅有少量叶片出现茶
褐色病斑，病情指数仅为2.5%。说明JN2对草莓灰霉病具有较高的防效。
表2JN2处理对灰霉病的防效
供试叶片总数（片）
病情指数（%）
|
0-HM
30
87.5
JN-HM
30
2.5
2.解淀粉芽孢杆菌JN2对镰刀菌属和拟盘多毛孢属病原菌的拮抗作用：
镰刀菌属真菌（Fusariumspp.）在世界范围内分布广泛，它可危害多种植物，破坏植物
的维管束系统，引起植物萎蔫死亡和器官腐烂，是生产上防治最艰难的土传病害之一。在草
莓上可引起枯萎病，使草莓根部维管束变褐，叶片卷缩、萎蔫直至全株死亡。拟盘多毛孢属
（Pestalotiopsis）是著名的植物病原体品种，在草莓上能引起叶斑病，主要危害叶片，起初
产生红褐色病斑，后中央变为浅褐色，产生轮纹，边缘出现明显的暗褐色坏死带，严重时叶
片枯死。
采用对峙培养验证解淀粉芽孢杆菌JN2对镰刀菌和拟盘多毛孢菌的拮抗作用。镰
刀菌和拟盘多毛孢菌为本实验室保存病害菌种，将病害菌种的新鲜菌丝接种于马铃薯葡萄
糖固体培养基平板中央，按等边三角形三个顶点的方向将JN2接种于病害菌周围，于28℃条
件下黑暗倒置培养。以只接种病害菌，不接种JN2的平板作为对照。7天以后观察病害菌生长
状况。从图5中可以明显看出，与对照相比，接种JN2菌株的镰刀菌和拟盘多毛孢菌生长明显
受到抑制，说明JN2对镰刀菌和拟盘多毛孢菌有强烈的拮抗作用。
实验例3：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2对纤维素的降解作
用的检测：
以羧甲基纤维素酶（CMCase）和滤纸酶活（FPase）为指标优化JN2菌株的发酵条件。采用
国标20287-2006《农用微生物菌剂》中的还原糖法测定滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力。
以1mL酶液，1min产生1μg葡萄糖定义为1个酶活力单位（U）。标准曲线见图6，其回归方程为y
=0.0002x-0.0223，R2值为0.9904，线性关系良好。
1.JN2菌株在不同纤维类底物诱导下纤维素酶活力的变化：以羧甲基纤维素钠、滤
纸条、玉米秸秆粉、稻草粉、锯末为诱导底物，分别配制不同的发酵培养基。具体的基础培养
基配方为：底物15g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硝酸铵1g/L，硫酸镁0.5g/L，取培养了
24h的JN2种子发酵液接种于不同的发酵培养基中，37℃，160r/min摇床培养，5天后离心，
取上清液作为粗酶液，测定酶活。
不同底物的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活值见图7，可见在羧甲基纤维素钠、滤纸
条、玉米秸秆粉、稻草粉、锯末5种诱导底物条件下，所产生的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活
均有差异，其中，玉米秸秆的诱导能力最大，CMC酶活能达到1344U，滤纸酶活能达到835U。故
选择玉米秸秆为最佳诱导底物。
2.JN2菌株在不同pH条件下纤维素酶活力的变化：根据在不同纤维类底物诱导下
纤维素酶活力的检测的结果，以玉米秸秆作为诱导底物，按pH值为3、4、5、6、7、9分别配制不
同的发酵培养基。具体的培养基配方、培养条件同不同纤维类底物诱导下纤维素酶活力检
测的培养基和培养条件。培养5天后测定滤纸酶活力。结果见表3。可见，pH值为7时，JN2产生
滤纸酶活最高，7为最适培养pH条件。
表3不同pH条件下滤纸酶活
pH
3
4
5
6
7
9
滤纸酶活
793
780
805
739
830
726
3.JN2菌株在不同发酵方式、不同发酵时间下纤维素酶活力的变化：设置了静置培养和
摇床培养两种发酵方式，其它培养条件同不同纤维类底物诱导下纤维素酶活力变化的培养
条件，分别培养5、7、10、12、14天时取粗酶液测定滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力。结果
如表4，可见，静置培养时，羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活在第7天时达到高峰；摇床培养时，
羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活在第10天时达到高峰。两种培养方式下，两种酶活的峰值差
异不显著。因此，两种培养方式均可以选择。
表4培养方式和时间对纤维素酶活的影响
4.JN2菌株在不同发酵温度下纤维素酶活力的变化：配制玉米秸秆培养基，按不同纤维
类底物诱导下纤维素酶活力变化检测的方法接种JN2菌株，于20℃、25℃、37℃、50℃四个不
同的培养温度下静置发酵，7天时取粗酶液测定滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力。结果见
图8。可见：温度为20℃时，羧甲基纤维素酶活最高，达1503U；而温度为25℃时，滤纸酶活最
高，达910U。因此，在发酵中，宜选择20~25℃。
实验例4：本发明所制备的草莓专用抗重茬生物有机肥对草莓的温室大棚实验
2013年，以草莓品种红颜为试材，在山西省太原市阳曲县蒲子村蒲丰农林科技有限公
司一座大棚内分两个小区进行实验。该大棚已连续4年栽种草莓，重茬病发病率较高。一个
小区为处理，使用本发明所制备的草莓专用抗重茬生物有机肥；另一个小区为对照，使用市
售的复合肥，其它管理方式均相同。考虑病原微生物能随空气传播，可能会造成不同小区间
相互干扰，所以在两个小区间设高挡板分隔，温室两头留有保护区域。种植方式为小高畦栽
植，小高畦顶宽50cm，下宽70cm，畦高30cm，畦沟底宽25cm左右，每畦栽两行，株间距20~
25cm。每小区包括10垄。于9月20日栽植红颜脱毒苗，苗大小、长势一致。分别于苗期、盛花
期、结果期调查草莓发病率并计算病情指数和相对防效；于草莓生长后期调查草莓生长量
（以干物质重量为衡量指标）；于结果期调查草莓产量、品质（在每处理区段随机选取2垄作
为调查处理的固定区域，从开始收获到结束记载单株产量，最后以每处理的平均单株产量
为计算单元）。
实验结果：表5是使用本发明的生物有机肥对连作大棚草莓土传病害的防治效果。
可以看出，在我们调查的枯萎病、灰霉病、叶斑病三种主要土传病害中，灰霉病的发病率最
高，在结果期最高发病率能达到34.18%，使用本发明的生物有机肥对灰霉病的大田防效也
最高，在苗期能达到100%的防效，在结果期能达到90.23%，有效控制灰霉病的发生。枯萎病
和叶斑病的发生也能得到很好的控制，结果期防效能分别达到67.05%和56.40%。
表5生物有机肥对大棚草莓土传病害防治效果
表6是使用本发明的生物有机肥和使用普通复合肥对大棚草莓苗生长的影响，可以看
出，“生物有机肥”处理小区的草莓苗生长状况与普通复合肥处理小区的草莓苗在叶片数、
叶片面积、茎叶干物重和根系干物重方面没有表现出显著差异。但表7中显示出“生物有机
肥”处理小区果实品质最好，表现为果实大，含糖量高，可滴定酸低，风味好，口感好。因此，
我们认为，本发明的生物有机肥在防治连作草莓重茬病害方面和提高草莓果实品质方面表
现较好。
表6生物有机肥对大棚草莓生长的影响
处理方式
叶片数
叶片面积（cm2）
叶片干物重（g）
茎干物重(g)
根系干物重(g)
生物肥
15a
709a
25.2a
16.4a
26.5a
复合肥
13a
710a
19.8b
15.5a
26.7a
注：同一列中的a、b表示在0.05水平上差异显著。
表7生物有机肥对大棚草莓产量与品质的影响
处理方式
平均单株产量（g）
平均单果重（g）
可溶性固形物（%）
总糖（%）
可滴定酸（%）
糖酸比
生物肥
240a
12.8a
13.7a
8.3a
0.8a
10.4a
复合肥
223a
11.0b
13.2a
6.4b
1.1b
5.8b
注：同一列中的a、b表示在0.05水平上差异显著。
序列表
<110>山西省农业科学院生物技术研究中心、山西省农业科学院果树研究所、山西省农
业科学院农业资源与经济研究所
<120>一种草莓专用抗重茬生物有机肥的制备方法
<160>1
<170>PaUentInVersion3.5
<210>1
<211>1406
<212>DNA
<213>人工序列
<223>解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2的16SrDNA序列
<400>1
<400>1
1AGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACA
61AGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTC
121ACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAAC
181CTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAA
241GGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTT
301AGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAA
361CCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGA
421AGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCG
481TTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAG
541TTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAA
601GGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATC
661TAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGC
721CTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCAC
781TCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGG
841CTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAA
901CGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTT
961AGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCT
1021TTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTG
1081CGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTG
1141GCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAA
1201CTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGA
1261ACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCT
1321TACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTC
1381CCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTA