超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂及制备方法 【技术领域】
本发明涉及生物性微生态制剂及环境保护领域，特别适合水产养殖业和水质净化等水环境改良使用的一种新型超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂及制备方法。
背景技术
水产养殖中，由于池塘老化、底质饵料与大量粪便的沉积，水体中对水产动物有害物质如氨态氮、亚硝态氮、有毒藻类毒素、硫化氢、甲烷等大量积累，特别是长期使用消毒剂和一些杀生性化学药物防治养殖水产动物病害，导致一些水质净化的有益微生物和有益藻类大量死亡，使得水体环境净化能力遭到严重破坏，水体自净能力丧失，养殖水体更加恶化，疾病发生日趋严重，并呈爆发性传播；同时，为了防治病害发生而频繁使用抗菌、杀生药物也引发了一系列环境和社会问题。众所周知，养鱼先养水，水体环境的优化是健康养鱼的首要条件。近年来，人们开始尝试在养殖水体中施用有益微生物制剂来改善养殖生态环境，抑制病原微生物，从而减少疾病的发生。这一方法在养殖实践中已取得了很好的效果。因此，水体中使用大量的有益藻类和有益细菌，能够增加水体溶氧、降低氨氮、抑制致病菌生长、净化和改善养殖水体，减少病害的发生；同时还可提供丰富的水产动物天然饵料、促进养殖对象生长等功能。因此，养殖水域大量增殖的有益藻类与有益细菌是改良水体环境、实现生态调节、进行健康养殖、生产绿色无公害水产品最有效的手段。
另外，活藻、活菌的保存主要通过低温等手段保存，不利于大规模生产和使用。目前，国内外尚未见生产中使用的活藻制剂，而细菌微生态制剂也只有两种剂型：一是将细菌培养物浓缩，低温干燥后，用载体吸附、混匀，获得固体制剂，装袋或装瓶保存；二是将细菌培养物制成菌悬液，装瓶保存。前者在生产中成本高，需要大型的冻干和分离设备，并且产品进入市场因常温贮藏，细菌存活时间短，使用后效果下降；后者细菌经过一段时间后代谢产气引起塑料瓶胀瓶爆裂，同时，细菌常温下死亡很高，大量沉积分层，保存时间很短，6个月细菌总数降低80％以上。所以，能够降低生产成本，无需大型设备投资，生产工艺简单，细菌和藻类能长时间保存而死亡率低地新制剂有着广阔的应用前景。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂，该水质改良剂使用到水域中，不影响水产品的质量和安全，并且无污染、不影响水环境，使用剂量低、成本小、使用方便。
本发明的另一个目的在于，提供上述超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂的制备方法。
实现上述目的的技术解决方案是，一种超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂，其特征在于，含有下列质量比原料：
1)细胞数量≥1020CFU/ml的藻类浓缩液，30％～85％；
2)细胞数量≥1040CFU/ml的细菌浓缩液，10％～60％；
3)藻菌专用营养液，4％～20％；
4)专用保存悬浮剂，0.10％～0.25％；
上述原料的总和为100％；
上述藻类浓缩液选自绿藻或硅藻；
所述的细菌浓缩液为固氮菌、X401产气菌、硝化细菌、亚硝化细菌、酵母菌混合制备的浓缩液；
所述的专用保存悬浮剂是琼脂粉、右旋糖苷、海藻多糖混合物，比例为1 2∶5∶1；
所述的藻菌专用营养液含有下列成分与1000ml水混合而成：
NH4CI 0.21g
Ca(H2PO2)2·H2O+2CaSO2·H2O 0.03g
MgSO4·7H2O 0.07g
NaHCO3 0.11g
KCI 0.03g
鱼粉 0.5g～2.0g。
所述的固氮菌、X401产气菌、硝化细菌、亚硝化细菌、酵母菌混合制备的浓缩液的配方为：X401产气菌30％，固氮菌20％，酵母菌10％，硝化细菌20％，亚硝化细菌20％。
上述超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂的制备方法，其特征在于，依次按下述步骤进行：
a、藻类的培养
将纯培养的绿藻(栅藻、小球藻)或硅藻首先经过一级、二级扩种培养。
藻种的一级培养：在无菌室超净工作台下，将保种在试管斜面上的纯培养栅藻、小球藻为藻源的绿藻或硅藻藻种接种到500ml三角烧瓶中，置光照培养箱内，调节温度25℃，光照照度为5600Lx，使用x06培养液配方，每天摇瓶4-6次，培养72h后藻类浓度超过106CFU/ml时得到一级藻类培养液。
藻种的二级培养：在无菌操作下，利用5kg玻璃广口瓶，在藻种培养室进行二级扩增培养。一般接种的一级藻液容量和新配培养液量的比例为1∶2～1∶3，调节温度25℃，光照照度为5600Lx，使用x06培养液配方，每天摇瓶4-6次，培养48-72h后藻类浓度超过106CFU/ml时得到二级藻类培养液。
大量生产培养：在无菌操作下接种，利用50kg塑料桶或5-10m3的水泥池，在藻种培养室大量生产培养。一般接种的二级藻液容量和新配培养液量的比例为1∶20～1∶30，调节温度25℃，光照照度为5600Lx，使用x06培养液配方，培养液经过消毒处理，进行充气培养，培养池容量大，可采取分次加培养液的方法，第一次培养水量为总水量的60％左右，培养2-3天后，藻细胞已经繁殖到较大的密度，可再加培养液40％继续培养，藻类浓度超过106CFU/ml时得到藻类培养液。x06培养液含有下列成分与1000ml水混合而成：
尿素 0.133g
Ca(H2PO4)2·H2O 0.020g
磷酸 0.020ml
MgSO4·7H2O 0.10g
NaHCO3 0.10g
KCl 0.033g
1％水溶液的FeSO4 0.20ml
5％水溶液的氯化钙 0.05ml
0.05％的鱼粉浸出液 0.5ml；
b、细菌的培养
将纯培养的X401产气菌、固氮菌、酵母菌、硝化细菌、亚硝化细菌菌种首先经过一级、二级扩种培养。
菌种的一级培养：在无菌室超净工作台下，分别将保种在试管斜面上的X401产气菌、同氮菌、酵母菌、硝化细菌、亚硝化细菌菌种接种到盛有普通肉汤培养液的500ml三角烧瓶中，置恒温水浴振荡器中，调节温度25℃，振荡频率为50次/min，连续培养48h后，细菌浓度超过1015CFU/ml时得到一级细菌培养液。
菌种的二级培养：在无菌室超净工作台下，分别将X401产气菌、同氮菌、酵母菌、硝化细菌、亚硝化细菌的一级细菌培养液接种到盛有普通肉汤培养液的5kg玻璃广口瓶中，一级菌悬液体积和新配培养液量的比例为1∶5～1∶10，调节温度25℃，每天人工摇瓶5次，连续培养48h后，细菌浓度超过1015CFU/ml时得到二级细菌培养液。
大量生产培养：在无菌室超净工作台下，分别将X401产气菌、固氮菌、酵母菌、硝化细菌、亚硝化细菌的二级细菌培养液接种到盛有普通肉汤培养液的50-500kg容器中，二级细菌培养液的体积和新配培养液量的比例为1∶10～1∶20，调节温度25℃，连续充气培养48-72h后，当细菌数≥1020CFU/ml后，得到细菌培养液；
c、藻类、细菌培养液浓缩
分别在藻类、细菌培养液中加入絮凝剂铵明矾，使浓度为0.05％，搅拌30分钟，静置过夜后，除去上清液，再分别培养1-2天，置大型离心机离心浓缩得粘稠状藻类、细菌浓缩物；
d、混合浓缩菌液制备
将分别培养的X401产气菌、固氮菌、酵母菌、硝化细菌、亚硝化细菌絮凝、离心浓缩后，按如下配方混合浓缩菌液，其配方为：
X401产气菌 30％
固氮菌 20％
酵母菌 10％
硝化细菌 20％
亚硝化细菌 20％
e、专用保存悬浮剂的制备
以琼脂粉、右旋糖苷、海藻多糖混合物，其比例为12∶5∶1混合，再按权利要求1所述的藻菌专用营养液质量比混合一起，置于不锈钢夹层锅中，控温100℃，加热搅拌5-10分钟，然后保温在45℃下备用，即获得专用保存悬浮剂；
f、藻菌微生态平衡悬浮剂制备
将绿藻、硅藻等有益藻类浓缩液，固氮菌、产气菌、硝化细菌、亚硝化细菌、酵母菌混合浓缩菌液，藻菌专用营养液，上述制备的专用保存悬浮液三种成分按照权利要求1所述质量比混合，加温35℃-40℃，用高速搅拌机搅拌5分钟，冷却室温后再搅拌5分钟，即得超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂。
本发明的超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂的主要作用是：
1)净化水质。
藻类通过光合作用增加水体的溶解氧，提高水产动物的新陈代谢，增强好氧菌对有机质的降解；藻类能够利用细菌降解有机质产生的CO2，加速分裂繁殖，可降低水体中的N、P含量和增强富集金属离子的能力；大量增殖的有益菌则通过氨化作用、硝化作用、反硝化作用、固氮作用，在溶氧丰富的条件下，将水体中的氨态氮(NH3-N)和亚硝态氮(NO2-)等有毒氨氮转化为硝态氮(NO-3)，为藻类所利用，从而起到净化水质的作用；另外，水体中溶解态的磷被悬浮颗粒吸附形成颗粒态磷，经凝絮作用转为沉淀，降低水体中有效磷的含量，从而控制水的富营养化和蓝藻等有毒藻类的繁殖生长，限制硫酸盐和硫化氢(H2S)等的产生。
2)提供水产动物天然饵料，提高水体生产性能
藻类是鱼类、虾蟹的天然饵料，本制剂富含绿藻、硅藻等有益藻类，可在水体迅速繁殖、生长，为养殖对象提供丰富的饵料，促进其生长。同时，益生菌可抑制养殖水体中病原微生物的生长，并逐步形成有益于水产动物生长的有益菌群，减少疾病的发生，提高水体生产性能。
3)控制水体有害藻类、菌类的繁殖与生长
由于该制剂所采用的是高浓缩的有益藻、菌，可迅速在水体中大量繁殖，在水域生态系统中占据优势地位，可抑制其有害藻类、菌类的繁殖与生长。当水体环境发生变化，会导致水体浮游生物特别是浮游植物种群的变化，有害藻类如蓝藻等的大量繁殖，给生产带来灾害。如果使用该制剂，栅藻、小球藻等绿藻大量增殖，就可抑制有害藻类的生长繁殖，最终有益藻类占优势种群，使水体环境得以改善。试验研究发现，有益菌特别是X401产气菌(本研究中从土壤分离获得)、固氮菌的增殖，能够增强有益藻类的大量繁殖，同时也限制了水产动物病原菌的繁殖数量，起到生态防病的目的。
4)为杀生药物使用后的池塘等水体提供有益藻种。
目前，为了杀灭水体中对水产动物有害的生物，在清塘、杀灭有害藻类和杀灭寄生虫时使用了许多杀生药物，结果导致池塘中有益藻类和菌类的死亡，使用该制剂可有效的补充这些有益藻菌。
5)为富营养化水体的浮游植物、水生植物提供光合作用的CO2
大量研究证实，水体富营养化后，藻类及水生植物大量生长繁殖，使水体中CO2的缺乏，光合作用发生障碍，是导致大量藻类死亡的一个原因。
本发明中分离的X401产气菌、酵母菌均可分解有机质产生CO2，供给藻类光合作用所需的能源；此外，固氮菌也可以将游离的氮源转化成被藻类等利用的有机氮，加速藻类的繁殖，起到改良水质的作用。
以超浓缩活藻制剂方式应用到水质改良是本研究的主要特点之一。采用一些特殊的工艺方法，对藻类、细菌进行浓缩，长时间密封保存在含特殊营养保存液容器中，使得藻菌处于休眠状态，并抑制、减缓藻菌的生长繁殖，克服了藻菌不能长期保存的难题。同时，容器中藻菌很低的新陈代谢产生的气体维持一种相对平衡的稳定状态，既制剂中的藻类在光合作用中产生的O2能够被耗氧菌所利用，而菌类释放的CO2又被藻类光合作用吸收，使制剂得以长时间的保存，并克服了以往微生物产品胀气爆瓶的缺陷，这是该项研究的又一主要特点。研究中使用由琼脂粉、右旋糖苷、海藻多糖混合物组成的保存悬浮剂，采用细胞悬浮理论，使得活藻、菌高密度均匀悬浮在液体中，不会发生沉淀、分层和堆积造成的细胞死亡发生，因此，该悬浮剂可使藻、菌长时间保存，并保持其活力。
本发明制剂的使用方法与用量：
制剂规格：有益藻含量≥1015CFU/ml，有益菌含量≥1035CFU/ml。使用时直接泼洒于池塘中，使用剂量为：2000毫升/亩·米。或者可使用提供的快繁培养基，加入1000倍的池塘水先在小水泥池或塑料盆等大容器内增殖2-4天再泼洒，效果会更好。
4、本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明研制的活藻、活菌具有双重的水质改良作用，与其它纯单一细菌的微生物制剂在改良水质方面相比，其主要特点为：具有活的有益藻类，且采用菌、藻的超浓缩工艺，其细胞数量是一般其它微生物制剂的1040倍以上；因具有活藻、活菌，可分解有机质，利用氨氮等有害物质，产生大量的氧气，其水质净化效率显著高于只含细菌的微生态制剂；大量增殖后的藻类在净化水体同时还为水中的经济动物，特别是鱼类、虾蟹提供丰富的天然饵料，这是一般微生态制剂不能实现的；制剂提供的有益绿藻、细菌在水体中大量增殖，有益细菌不但可促进有益藻类的大量增殖，而且能抑制有害藻类和病原菌的生长繁殖，实现生态防病的目的；能为使用过杀生药物的池塘等水体提供、补充有益藻种；X401产气菌和酵母菌分解有机质产生的CO2供给藻类及水生植物光合作用的能源，固氮菌可以将游离的氮源转化成被藻类等植物利用的有机氮，加速了藻类的繁殖，起到肥水作用，其它微生态制剂均没有这些功能。
另外，该制剂与现有微生态制剂相比，主要不同之处为：采用超浓缩活藻、菌制剂方式，解决了活藻、菌，特别是藻类不能在生产中长期保存及微生态制剂产气胀瓶的问题。
所以，超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂在生产上完全可以替代其它细菌组成的微生态制剂，可广泛用于各种鱼类、虾蟹等养殖水体，改良水质，减少水产动物疾病的发生，同时可提供丰富的天然饵料，具有较好的社会和经济效益。
【具体实施方式】
以下结合发明人给出的实施例和试验实施方式对本发明作进一步的详细说明，但本发明不局限于这些实施例，凡在本发明的配方范围内所进行的等效变换均属本发明的保护范围。
实施例1：
超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂按质量比以100份计：绿藻等有益藻类浓缩液(细胞数量≥1020CFU/ml)85份、固氮菌等有益细菌浓缩液(细胞数量≥1040CFU/ml)10份、专用营养液4.75份、保存悬浮剂(琼脂粉、右旋糖苷、海藻多糖混合物，比例为12∶5∶1)0.25份。
其制备方法按照下列步骤进行：
a、藻类的培养
将纯培养的绿藻(栅藻、小球藻)或硅藻首先经过一级、二级扩种培养。
藻种的一级培养：在无菌室超净工作台下，将保种在试管斜面上的纯培养栅藻、小球藻为藻源的绿藻或硅藻藻种接种到500ml三角烧瓶中，置光照培养箱内，调节温度25℃，光照照度为5600Lx，使用x06培养液配方，每天摇瓶4-6次，培养72h后藻类浓度超过106CFU/ml时得到一级藻类培养液。
藻种的二级培养：在无菌操作下，利用5kg玻璃广口瓶，在藻种培养室进行二级扩增培养。一般接种的一级藻液容量和新配培养液量的比例为1∶2～1∶3，调节温度25℃，光照照度为5600Lx，使用x06培养液配方，每天摇瓶4-6次，培养48-72h后藻类浓度超过106CFU/ml时得到二级藻类培养液。
大量生产培养：在无菌操作下接种，利用50kg塑料桶或5-10m3的水泥池，在藻种培养室大量生产培养。一般接种的二级藻液容量和新配培养液量的比例为1∶20～1∶30，调节温度25℃，光照照度为5600Lx，使用x06培养液配方，培养液经过消毒处理，进行充气培养，藻类浓度超过106CFU/ml时得到藻类培养液。
b、细菌的培养
将纯培养的X401产气菌、固氮菌、酵母菌、硝化细菌、亚硝化细菌菌种首先经过一级、二级扩种培养。
菌种的一级培养：在无菌室超净工作台下，分别将保种在试管斜面上的X401产气菌、固氮菌、酵母菌、硝化细菌、亚硝化细菌菌种接种到盛有普通肉汤培养液的500ml三角烧瓶中，置恒温水浴振荡器中，调节温度25℃，振荡频率为50次/min，连续培养48h后，细菌浓度超过1015CFU/ml时得到一级细菌培养液。
菌种的二级培养：在无菌室超净工作台下，分别将X401产气菌、固氮菌、酵母菌、硝化细菌、亚硝化细菌的一级细菌培养液接种到盛有普通肉汤培养液的5kg玻璃广口瓶中，一级菌悬液体积和新配培养液量的比例为1∶5～1∶10，调节温度25℃，每天人工摇瓶5次，连续培养48h后，细菌浓度超过1015CFU/ml时得到二级细菌培养液。
大量生产培养：在无菌室超净工作台下，分别将X401产气菌、固氮菌、酵母菌、硝化细菌、业硝化细菌的二级细菌培养液接种到盛有普通肉汤培养液的50-500kg容器中，二级细菌培养液的体积和新配培养液量的比例为1∶10～1∶20，调节温度25℃，连续充气培养48-72h后，当细菌数≥1020CFU/ml后，得到细菌培养液；
c、藻、菌浓缩方法
分别在藻类、细菌培养液中加入絮凝剂铵明矾，使浓度为0.05％，搅拌30分钟，静置过夜后，除去上清液，再分别培养1-2天，置大型离心机离心浓缩得粘稠状藻类、细菌浓缩物，并进行细胞计数。
d、混合浓缩菌液制备
将分别培养的X401产气菌、固氮菌、酵母菌、硝化细菌、亚硝化细菌絮凝、离心浓缩后，按配方配制成混合浓缩菌液(X401产气菌30％、固氮菌20％、酵母菌10％、硝化细菌20％、亚硝化细菌20％)
e、专用保存悬浮剂的制备
以琼脂粉、右旋糖苷、海藻多糖混合物，其比例为12∶5∶1混合，再按权利要求1所述的藻菌专用营养液质量比混合一起，置于不锈钢夹层锅中，控温100℃，加热搅拌5-10分钟，然后保温在45℃下备用，即获得专用保存悬浮剂；
f、藻菌微生态平衡悬浮剂制备
称量绿藻等有益藻类浓缩液(细胞数量1020CFU/ml)80kg，X401产气菌3kg、固氮菌2kg、酵母菌1kg、硝化细菌2kg、亚硝化细菌2kg，分别加入搅拌器中混合均匀；称量琼脂粉133g、右旋糖苷56g、海藻多糖11g相继加入10Kg的专用营养液中，置于不锈钢夹层锅中，控温100℃，加热搅拌5-10分钟，冷却45℃后，倾倒在称好的藻菌混合液中，用高速搅拌机搅拌5分钟，冷却1-2小时，再搅拌5分钟，即得超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂。
实施例2：
超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂按质量比以100份计：硅藻等有益藻类浓缩液(细胞数量≥1020CFU/ml)60份、固氮菌等有益细菌浓缩液(细胞数量≥1040CFU/ml)30份、专用营养液9.85份、保存悬浮剂(琼脂粉、右旋糖苷、海藻多糖混合物，比例为12∶5∶1)0.15份。其制备方法同实施例1。
实施例3：
超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂按质量比以100份计：绿藻等有益藻类浓缩液(细胞数量≥1020CFU/ml)50份、固氮菌等有益细菌浓缩液(细胞数量≥1040CFU/ml)35份、专用营养液14.80份、保存悬浮剂(琼脂粉、右旋糖苷、海藻多糖混合物，比例为12∶5∶1)0.20份。其制备方法同实施例1。
实施例4：
超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂按质量比以100份计：硅藻等有益藻类浓缩液(细胞数量≥1020CFU/ml)30份、固氮菌等有益细菌浓缩液(细胞数量≥1040CFU/ml)55份、专用营养液14.9份、保存悬浮剂(琼脂粉、右旋糖苷、海藻多糖混合物，比例为12∶5∶1)0.10份。其制备方法同实施例1。
实施例5：
超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂按质量比以100份计：绿藻等有益藻类浓缩液(细胞数量≥1020CFU/ml)40份、固氮菌等有益细菌浓缩液(细胞数量≥1040CFU/ml)55份、专用营养液4.9份、保存悬浮剂(琼脂粉、右旋糖苷、海藻多糖混合物，比例为12∶5∶1)0.10份。其制备方法同实施例1。
实施例6：
超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂按质量比以100份计：硅藻等有益藻类浓缩液(细胞数量≥1020CFU/ml)70份、固氮菌等有益细菌浓缩液(细胞数量≥1040CFU/ml)24份、专用营养液5.9份、保存悬浮剂(琼脂粉、右旋糖苷、海藻多糖混合物，比例为12∶5∶1)0.10份。其制备方法同实施例1。
实施例7：
超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂按质量比以100份计：硅藻等有益藻类浓缩液(细胞数量≥1020CFU/ml)50份、固氮菌等有益细菌浓缩液(细胞数量≥1040CFU/ml)35份、专用营养液14.75份、保存悬浮剂(琼脂粉、右旋糖苷、海藻多糖混合物，比例为12∶5∶1)0.25份。其制备方法同实施例1。
试验实施例：超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂生产使用效果试验
在2003年4月10日至2003年10月10日间，在宝鸡市眉县渔场选择了6个池塘进行“超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂”生产试验，池塘为建设20多年的老池塘，塘泥很厚，亚硝酸盐、氨氮含量多年来剧高不降，时有泛塘发生，每年鱼病爆发频繁，对养殖生产造成很大的损失，经过使用该制剂后，与对照池塘相比，无论是增产还是减少疾病的发生都产生显著的效果，有关试验资料如下：
1.材料与方法
超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂，规格，1000ml/瓶，含量：栅藻、小球藻等绿藻：≥1015CFU/ml，有益细菌总数≥1035CFU/ml。使用剂量为：2000ml/亩·米。
试验地点：宝鸡市眉县渔场。6个面积均为5亩的老池塘，1、2号池混养鲤、鲫、草、鳊、鲢、鳙鱼，由水花培育到鱼种，3号池塘对照组；4、5号池混养鲤、鲫、草、鳊、鲢、鳙鱼，由鱼种养殖到成鱼，6号池塘对照组。
使用前，对1-6号池塘统一加水后施肥，主要是鸡粪、碳氨等。1、2、4、5号池塘按使用说明同时使用超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂，3、6号池塘设对照。使用后在第3d、4d、5d、6d、7d分别测定各项指标，并在养殖生产中每30d再使用1次，每隔20d测定浮游植物生物量。试验中，统一在第10d，1、2、3号池塘放养水花，每亩15万尾；4、5、6号池塘放养平均体重为120g的鱼种，每亩放养1200尾。日常管理采用施肥、投喂颗粒饲料相结合，定期换水、开设增氧机、疾病防治，记录管理发病情况。在试验时间段共使用了4次。
1.1 浮游植物定量与水体透明度测定
在池塘四周离岸1m处和池塘中央各选1采样点用采水器采样，分别采集表层、底层水，用1％的碘液固定，静置24h浓缩定容，细胞计数板显微镜观察计数，按照1L水公式N＝Cs/Fs·Fn×V/v×Pn(N浮游植物数量，Cs计数框面积mm2，Fs一个视野的面积mm2，Fn计数过的视野数，V1L水浓缩后的体积mL，v计数框体积mL，Pn在Fn视野中，所计数到的浮游植物数量)计算出浮游植物数量，再通过优势藻类换算成生物量(mg/L)。并与对照组比较。每次采样固定在下午14:00时进行。
采用塞奇Sechi板法测定水体透明度。
1.2池底有机物降解测定与水体优势藻类的检查
定期在各池塘池底挖取底泥，检测黑泥颜色变化情况，以此测定对池底有机物降解能力。
定点采集水样，统计计算出各池塘藻类种类、数量，观察生产时期使用制剂对水体藻类种群的影响。
1.3水体中溶解氧、亚硝酸盐、氨氮含量的测定
在下午15:00时采水样，采用北京大学化学系研制的水质快速分析盒测定溶解氧、亚硝酸盐、氨氮含量。
1.4底层水细菌数量的检查
在养殖生产期的第20d、40d、60d、80d、100d、120d、140d、160d、180d采集1、2、3号池塘底层水样，应用平板菌落计数统计水体底层细菌种类与变化规律。
1.5 鱼种、成鱼生长性能和发病情况
定期随即捞取鱼苗、鱼种或成鱼进行称重，检查发病与管理情况，并与对照组比较。
2结果
2.1浮游植物定量与水体透明度测定
对池塘四周离岸1m处和池塘中央各选1采样点采的样进行计数，计算浮游植物生物量(mg/L)平均值。水温在20-30℃。在使用该制剂最初的7d结果见下表1，在养殖生产中每30d再使用1次，每隔20d测定浮游植物生物量结果见表2。由表1看出，刚加入河水后，所有6个池塘在最初第0d、1d，试验组1、2、4、5号池塘浮游植物生物量与透明度与对照组3、6一致，从3d～7d，试验组1、2号池塘浮游植物生物量与透明度与对照组3显示显著差异p＜0.01，试验组4、5号池塘浮游植物生物量与透明度与对照组6显著差异p＜0.01。表2结果表明，从1d～180d生产中，试验组1、2、4、5号池塘由于前二者是从水花到鱼种的培育，每20d的浮游植物生物量与透明度呈现100d以前升高，100d出现下降趋势，后二者4、5号池塘，由于是从鱼种养到成鱼阶段，对浮游植物利用较低，从20d以后，基本维持在一定的水平。在测定的第20d、40d、60d、80d、100d、120d、140d、160d、180d，试验组1、2号池塘与对照组3号池塘，试验组4、5号池塘与对照组6号池塘在浮游植物生物量与透明度均呈现显著差异p＜0.01。
表1使用制剂最初7d内池塘浮游植物生物量与透明度
池塘编号 浮游植物生物量mg/L·透明度cm 0d mg/L cm 1d mg/L cm 2d mg/L cm 3d mg/L cm 4d mg/L cm 5d mg/L cm 6d mg/L cm 7d mg/L cm 1 5.4 60 5.8 60 9.2 50 19.8 40 30.6 35 41.5 30 65.5 25 77.6 20 2 5.3 60 5.9 60 9.5 50 19.5 40 30.0 35 40.9 30 68.7 25 78.9 20 3 5.3 60 5.8 60 6.5 60 10.1 50 14.4 48 19.7 40 25.8 35 32.4 30 4 5.3 60 5.6 60 9.7 50 20.4 40 31.2 35 41.6 30 68.4 25 80.8 20 5 5.4 60 5.5 60 9.1 50 21.3 40 30.5 35 41.6 30 69.9 25 78.2 20 6 5.3 60 5.7 60 6.8 60 11.0 50 15.0 47 19.5 40 26.4 35 33.3 30
表2使用制剂每20d池塘浮游植物生物量池塘编号 浮游植物生物量mg/L·透明度cm 第20d mg/L cm 第40d mg/L cm 第80d mg/L cm 第100d mg/L cm 第120d mg/L cm 第140d mg/L cm 第160d mg/L cm 第180d mg/L cm 1 125.5 20 132.0 20 130.8 20 132.6 20 120.2 25 101.4 30 106.4 30 98.6 30 2 128.9 20 140.2 20 132.4 20 128.0 20 122.8 25 113.9 30 105.5 30 100.7 30 3对照 58.9 35 55.8 35 59.7 35 67.2 30 70.6 30 79.1 30 67.6 35 65.5 35 4 136.4 20 133.3 20 130.7 20 121.4 25 113.8 25 112.0 25 119.5 25 112.9 25 5 135.0 20 130.5 20 128.6 25 120.3 25 119.2 25 113.8 25 110.4 25 99.89 25 6对照 75.6 30 78.1 30 77.5 30 89.4 30 88.7 30 65.5 35 62.1 40 60.3 40
2.2池底有机物降解测定与水体优势藻类的检查
定期在各池塘池底挖取底泥观察黑泥颜色变化，各池塘检测结果见表3。由表可以看出，在1、2、3号池塘因为是培育鱼种，前期阶段主要是施肥和泼洒豆浆，对照组3号池120d以前池底黑泥颜色无显著变化，但从120d以后养殖阶段，由于投喂颗粒饲料，池塘底泥颜色变黑加深；而1、2试验池在80d、100d取样结果显示无黑泥层，在120d-180d时间内，由于使用配合饲料投喂，但由于使用该制剂，黑泥颜色较浅并持续稳定，为制剂发挥作用的结果；在4、5、6号成鱼养殖池，由于一开始便使用配合饲料养殖，4、5号试验池塘黑泥颜色比开始试验前变浅、厚度变薄，并一直稳定，而对照组6号池从60d-80d黑泥颜色、厚度均加深，120d-180d间，颜色更深，厚度达12-20cm，是前者的2倍多。总之，试验组与对照组在底泥黑泥颜色、厚度增加均显示显著差异p＜0.01。
在生产期间，定期对各个池塘采样检查藻类种类与生物量，发现在使用水质改良剂后3-4d，即可观察到池水出现清新亮丽的黄绿或茶褐的水色，并一直维持稳定。有益藻类绿藻和硅藻约占90％，而蓝藻以及杂藻约占5-10％；对照组绿藻和硅藻约占70-80％，杂藻占20-30％，说明该水质改良剂能够促进硅藻、绿藻等优良单细胞藻类的繁殖生长，对蓝藻等杂藻有明显的抑制作用。
表3使用制剂每20d池底有机物降解情况池塘编号 黑泥色泽变化情况 0d 20d 40d 60d 80d 100d 120d 140d 160d 180d 1 2 3对照 4 5 6对照 +++ ++ + + - - + + + + +++ ++ + + - - + + + + +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ + + + + + + + + +++ ++ + + + + + + + + +++ +++ +++ ++++ ++++ +++++ +++++ +++++ +++++ +++++
注：+表示黑泥存在；-表示黑泥消失。“+”的多少表示黑泥的程度，越多表示越严重。
2.3水体中溶解氧、亚硝酸根离子、氨氮含量的测定
表4使用制剂最初7d内池塘溶解氧、亚硝酸根离子、氨氮含量变化(水温20-23℃) 池塘编号 0d mg/L 1d mg/L 2d mg/L 3d mg/L 4d mg/L 5d mg/L 6d mg/L 7d mg/L 1 DO NO2- NH3-N 8.0-9.0 0.15 1.42 9.0-10.0 0.15 1.42 10-11 0.15 1.40 11-12 0.10 1.10 13-14 0.10 0.85 13-14 0.015 0.65 13-14 0.010 0.55 13-14 0.005 0.45 2 DO NO2- NH3-N 8.0-9.0 0.15 1.45 9.0-10.0 0.15 1.45 10-11 0.15 1.42 11-12 0.10 1.20 13-14 0.10 1.10 13-14 0.015 0.80 13-14 0.010 0.55 13-14 0.005 0.45 3对照DO NO2- NH3-N 8.0-9.0 0.15 1.45 8.0-9.0 0.15 1.45 8.0-9.0 0.15 1.45 8.0-9.0 0.15 1.43 8.0-9.0 0.15 1.40 9.0-10.0 0.15 1.30 9.0-10.0 0.15 1.20 9.0-10.0 0.15 1.10 4 DO NO2- NH3-N 8.0-9.0 0.15 1.43 9.0-10.0 0.15 1.43 10-11 0.15 1.40 11-12 0.10 1.30 13-14 0.10 1.20 13-14 0.015 0.90 13-14 0.010 0.55 13-14 0.005 0.50 5 DO NO2- NH3-N 8.0-9.0 0.15 1.45 9.0-10.0 0.15 1.45 10-11 0.15 1.42 11-12 0.10 1.30 13-14 0.10 1.20 13-14 0.015 0.90 13-14 0.010 0.60 13-14 0.005 0.55 6对照DO NO2- NH3-N 8 0-9.0 0.15 1.45 8.0-9.0 0.15 1.45 8.0-9.0 0.15 1.45 8.0-9.0 0.15 1.43 8.0-9.0 0.15 1.40 9.0-10.0 0.15 1.30 9.0-10.0 0.15 1.20 9.0-10.0 0.15 1.10
在下午15:00时采水样，采用北京大学化学系研制的水质快速分析盒测定溶解氧(DO值)、亚硝酸盐、氨氮含量，结果见表4、表5.由表4可以看出，DO值从从0d～7d之间，1、2、3、4号池塘使用制剂，藻类大繁殖在增加以及产生的氧气逐渐生高，均在第4d达到饱和值13-14mg/L；池塘水体中含亚硝酸根离子从0.15mg/L在0d～7d内快速下降，全部达到0.005mg/L，说明制剂中大量有益细菌增殖后作用的结果，而3、6号池塘对照组亚硝酸根离子含量没有发生变化；池塘中由于使用了碳酸氢氨，NH3-N含量很高，对照组3、6号池塘没有发生显著降低，而1、2、4、5号池塘使用制剂后，由于有益藻类与有益细菌大量繁殖利用了氨氮，从4d～7d，水体含量与对照组显著降低，呈显著差异p＜0.01。
表5使用制剂在0-180d内池塘溶解氧、亚硝酸盐、氨氮含量变化池塘编号 20d mg/L 40d mg/L 60d mg/L 80d mg/L 100d mg/L 120d mg/L 140d mg/L 180d mg/L 1 DO NO2- NH3-N 12.0-13.0 0.005 0.10 12.0-13.0 0.005 0.10 11.0-12.0 0.005 0.07 10.0-11.0 0.015 0.06 10.0-11.0 0.015 0.09 9.0-10.0 0.020 0.08 9.0-10.0 0.025 0.08 9.0-10.0 0.05 0.06 2 DO NO2- NH3-N 12.0-13.0 0.005 0.09 12.0-13.0 0.005 0.10 11.0-12.0 0.005 0.06 10.0-11.0 0.015 0.09 10.0-11.0 0.015 0.09 9.0-10. 0.020 0.07 9.0-10.0 0.025 0.05 9.0-10.0 0.05 0.07 3对照DO NO2- NH3-N 7.0-8.0 0.16 0.68 7.0-8.0 0.17 0.64 6.0-7.0 0.20 0.69 6.0-7.0 0.23 0.67 7.0-8.0 0.26 0.56 6.0-7.0 0.26 0.79 6.0-7.0 0.28 0.80 6.0-7.0 0.33 0.81 4 DO NO2- NH3-N 12.0-13.0 0.010 0.10 12.0-13.0 0.015 0.15 11.0-12.0 0.035 0.09 10.0-11.0 0.035 0.08 9.0-10.0 0.055 0.10 9.0-10.0 0.050 0.13 8.0-9.0 0.056 0.09 7.0-8.0 0.058 0.10 5 DO NO2- NH3-N 12.0-13.0 0.010 0.10 12.0-13.0 0.015 0.15 11.0-12.0 0.015 0.07 10.0-11.0 0.030 0.08 9.0-10.0 0.035 0.09 9.0-10.0 0.045 0.11 8.0-9.0 0.055 0.09 7.0-8.0 0.065 0.08 6对照DO NO2- NH3-N 7.0-8.0 0.16 0.68 7.0-8.0 0.17 0.64 6.0-7.0 0.20 0.69 6.0-7.0 0.23 0.67 7.0-8.0 0.26 0.56 6.0-7.0 0.26 0.79 6.0-7.0 0.28 0.80 6.0-7.0 0.33 0.81
表5可以看出，在20d-180d生产时期，1、2、4、5号各个池塘亚硝酸盐、氨氮含量没有明显的升高，主要水质改良剂发挥了作用，而对照组3号池，虽然养殖是鱼种，前期阶段没有使用配合饲料，提高不大，但后期阶段使用配合饲料后，均明显升高；特别是6号池，一直投喂饲料，所以，亚硝酸盐、氨氮显著升高，溶氧处于较低水平。所以，本发明的水质改良剂能够显著分解亚硝酸盐、氨氮。
2.4底层水细菌数量的检查
对各个池塘底层水采样，检查细菌种类、数量见表6所示。制剂投放于养殖池塘中以后，有益微生物能迅速繁殖成为优势菌群，主要是分解亚硝酸盐、氨氮，另外，大量有益菌繁殖后，可以通过食物、场所的竞争以及分泌类似抗生素的物质，直接或间接地抑制有害病菌的生长繁殖。
表6池塘每20d细菌种类与数量(106CFU/mL)池塘编号 浮游植物生物量mg/L·透明度cm 第20d 第40d 第80d 第100d 第120d 第140d 第160d 第180d 1总细菌 硝化细菌 亚硝化细菌 酵母菌 30 12 10 8 35 10 16 7 38 13 12 13 32 10 10 11 37 12 9 14 43 9 16 13 35 8 16 9 38 13 12 8 2总细菌 硝化细菌 亚硝化细菌 酵母菌 33 7 5 10 38 8 7 11 39 12 10 10 35 14 9 6 33 10 7 10 38 9 11 13 35 10 7 6 35 8 12 5 3总细菌 硝化细菌 亚硝化细菌 酵母菌 22 0.4 0.6 0.01 24 0.8 0.6 0.03 20 0.5 0.4 0.05 16 0.4 0.2 0.07 18 0.7 0.7 0.08 17 0.9 0.5 0.09 16 0.5 0.6 0.04 17 0.8 0.07 0.05
2.5鱼种、成鱼生长性能和发病情况
鱼种培育过程中，1、2号试验池塘一直没有使用消毒剂，中期使用硫酸铜和敌百虫杀虫各1次，生产中没有发生其它疾病发生；4、5号池塘用药次数总3次，1次是杀虫剂敌百虫，2次是二氧化氯，生产期间爆发1次烂鳃病、1次指环虫病；3号对照池塘在8月份发生细菌性败血病，6号对照池塘发病3次，1次烂鳃病、1次细菌性败血病、1次肠炎，生产中，每20d使用1次消毒剂，共使用5次，主要是使用该制剂后降解进入养殖池的各种有机物，单细胞藻类与有益细菌的大量繁殖生长，抑制了病原菌的繁殖；同时藻类的增殖，有效地增加溶氧，消除有毒因子，营造了良好的生态环境。养殖动物生长在宽松的环境中，必然摄食活跃，生长速度快，特别是鱼苗到鱼种培育中，制剂中的藻类增殖对生产产生很大的作用，降低了生产中使用饲料的量，也降低了生产成本(见表7所示)，1、2、3号池塘饲料费用相同下，1、2号池试验组平均亩产量与对照组3号池塘平均高出108.5kg，平均体重超过27g，试验组与对照组均表现显著差异p＜0.01，同样，4、5号成鱼池塘与6号池塘对照组比较，平均体重与产量也表现显著差异p＜0.01，它们与对照组相比生产成本降低。鱼病防治费用表明，试验组比对照组费用低的多。
表7各池塘产量、生长状况、饲料成本、疾病防治药物费用池塘编号 平均亩产量(kg) 平均体重(g) 平均每亩饲料费(元) 平均每亩药物费(元) 1 2 3对照 4 5 6对照 564 132.5 2600 20 589 125.1 2600 20 468 101.8 2600 70 846 865.2 2500 50 881 879.6 2500 50 795 769.5 2500 130
3.结论
总之，使用本发明的超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂，能够净化水质，增加水体的溶解氧，降低水体中的氨态氮(NH3-N)和亚硝态氮(NO2-)等；同时，提供水产动物天然饵料，提高水体生产性能；控制有害藻类、菌类的繁殖与生长，有益菌的增殖，也限制了水产动物病原菌的繁殖数量，起到生态防病的目的，所以，该制剂具有广阔的应用价值。