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1、10申请公布号CN104055948A43申请公布日20140924CN104055948A21申请号201410336819522申请日20140716A61K36/87200601A61P35/0020060171申请人崔新明地址266200山东省青岛市即墨市温泉镇七沟村179号72发明人董燕子54发明名称一种诱导肿瘤细胞凋亡的中药提取物及其制备工艺和应用57摘要本发明公开了一种诱导肿瘤细胞凋亡的中药提取物及其制备工艺和应用，属于中药材提取技术领域，所述的中药提取物为毛叶白粉藤水提物。本发明所述中药提取物按如下方法制备而成将毛叶白粉藤原料置于提取容器中，先后用浓度为9095（V/V）乙醇、。
2、7075（V/V）乙醇各回流提取13次，弃掉醇提液，所得药渣加水煎煮14次，过滤得水提液，浓缩成稠膏，干燥，粉碎，得毛叶白粉藤水提物。本发明涉及的中药提取物由单一的中草药制备而成，其不仅可以抑制肿瘤细胞增殖，而且可以诱导肿瘤细胞凋亡。51INTCL权利要求书1页说明书3页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图1页10申请公布号CN104055948ACN104055948A1/1页21一种诱导肿瘤细胞凋亡的中药提取物，其特征在于所述的中药提取物为毛叶白粉藤水提物。2一种制备如权利要求1所述诱导肿瘤细胞凋亡的中药提取物的工艺，其特征在于所述工艺包括以。
3、下步骤将毛叶白粉藤原料置于提取容器中，先后用浓度为9095V/V乙醇、7075V/V乙醇各回流提取13次，弃掉醇提液，所得药渣加水煎煮14次，过滤得水提液，浓缩成稠膏，干燥，粉碎，得毛叶白粉藤水提物。3根据权利要求2所述制备诱导肿瘤细胞凋亡的中药提取物的工艺，其特征在于每次乙醇回流提取的时间为13H。4根据权利要求2所述制备诱导肿瘤细胞凋亡的中药提取物的工艺，其特征在于每次药渣加水煎煮的时间为12H。5权利要求1所述的毛叶白粉藤水提物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。6权利要求1所述的毛叶白粉藤水提物在制备诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。权利要求书CN104055948A1/3页3一种诱导。
4、肿瘤细胞凋亡的中药提取物及其制备工艺和应用技术领域0001本发明属于中药材提取技术领域，涉及一种诱导肿瘤细胞凋亡的中药提取物及其制备工艺和应用。背景技术0002目前，对于癌症的治疗尽管结合了外科手术，化学疗法，及放射性疗法，但是其治愈率还是很低的。化学疗法的低成功率原因在于当前的化学疗法是以迅速分化的肿瘤细胞为靶子的。这种方法对潜伏的或者生长缓慢的肿瘤细胞是低效率的。这种疗法还影响迅速分化的正常细胞，引起有害的副作用。0003近些年出现了一种治疗癌症的新方法，该方法以最近刚被发现的生物学现象“细胞凋亡”为基础，细胞凋亡又被称为“细胞的程序化死亡”或者“细胞自杀”TOMEI等人，“细胞凋亡”细胞。
5、死亡的分子基础。冷泉港实验室出版社，1991。与细胞损伤导致的细胞死亡相比，细胞凋亡是基因介导的细胞主动自毁过程并且为生物学上有意义的功能服务。最近有这样一种观点认为，癌症是由不充分的细胞凋亡引起的COPE,FOANDWILLE,JJ,“APOPTOSIS”THEMOLECULARBASISOFCELLDEATH，冷泉港实验室出版社，PP61,1991。这种观点为癌症治疗开创了一种新的思路肿瘤细胞可以通过激励细胞凋亡被杀死。以正常发展中的诸过程为基础，细胞凋亡的调谐作用是一种控制肿瘤细胞增殖的潜在机制。恢复肿瘤细胞中的细胞凋亡机制是一种值得尝试的方法，因为至少在理论上它将导致细胞自杀死亡。00。
6、04中药材毛叶白粉藤为葡萄科植物毛叶白粉藤的藤茎。目前，该药材被用于跌打损伤、扭伤。风湿关节疼痛、骨折、痈疮肿毒。等疾病，尚无文献报道毛叶白粉藤或其提取物具有诱导肿瘤细胞凋亡的功效。发明内容0005基于细胞的程序化死亡的研究，本发明的目的在于提供一种诱导肿瘤细胞凋亡的中药提取物及其制备工艺和应用。0006为了实现本能发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了如下技术方案一种诱导肿瘤细胞凋亡的中药提取物，所述的中药提取物为毛叶白粉藤水提物。0007本发明所述中药提取物的制备工艺，该工艺包括如下步骤将毛叶白粉藤原料置于提取容器中，先后用浓度为9095（V/V）乙醇、7075（V/V）。
7、乙醇各回流提取13次，弃掉醇提液，所得药渣加水煎煮14次，过滤得水提液，浓缩成稠膏，干燥，粉碎，得毛叶白粉藤水提物。0008在上述诱导肿瘤细胞凋亡的中药提取物的制备工艺中，优选每次乙醇回流提取的时间为13H；优选每次药渣加水煎煮的时间为12H。0009本发明所述诱导肿瘤细胞凋亡的中药提取物，其中每次乙醇回流提取的时间为说明书CN104055948A2/3页435H；每次药渣加水煎煮的时间为125H。0010细胞增殖过度和细胞凋亡异常是肿瘤发生的生物学基础。因此，如何诱导细胞进入凋亡是肿瘤治疗取得成功的关键。本发明人通过实验研究表明，毛叶白粉藤水提物不仅可以抑制人喉癌HEP2细胞增殖，而且可以诱。
8、导该细胞进入凋亡。因此，本发明的另一个目的在于提供一种制药用途，即上述的毛叶白粉藤水提物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用；或者，上述的毛叶白粉藤水提物在制备诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。进一步优选地上述的毛叶白粉藤水提物在制备抑制人喉癌HEP2细胞增殖的药物中的应用；或者，上述的毛叶白粉藤水提物在制备诱导人喉癌HEP2细胞凋亡的药物中的应用。0011与现有技术相比，本发明涉及的中药提取物由单一的中草药制备而成，其不仅可以抑制肿瘤细胞增殖，而且可以诱导肿瘤细胞凋亡。另外，该提取物来源于天然植物，因此毒副作用低，属于“绿色治疗药物”的范畴，可望被开发成抗肿瘤的一线用药。附图说明0012图1不。
9、同浓度毛叶白粉藤水提物对HEP2细胞增殖的抑制率曲线图。具体实施方式0013以下是本发明毛叶白粉藤水提物干粉的制备实施例和效果试验例，对本发明做进一步说明。但是，本发明的保护范围并不受限于以下实施例，凡是基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。0014实施例1毛叶白粉藤水提物干粉的制备毛叶白粉藤干品1KG，粉碎，置回流提取装置中，先后用浓度为95（V/V）乙醇12L、70（V/V）乙醇10L各回流提取2次，每次2H，弃掉醇提液，所得药渣加水15L，煎煮2次，每次2H，合并两次水提液，滤过，浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎成细粉，过100目筛，得毛叶白粉藤水提物干粉。0015实施例2毛叶白粉。
10、藤水提物抑制肿瘤细胞生长的试验研究取实施例1制备的毛叶白粉藤水提物干粉，分别将其干粉溶于含10胎牛血清的1640完全培养液，使水提物浓度分别为150、200、250、300、400、500、600G/ML备用。人喉癌HEP2细胞株，用含10胎牛血清的1640完全培养液于37恒温、5CO2、95饱和湿度条件下培养，取对数生长期的HEP2细胞，以每孔1104个接种于96孔板，每孔200L。过夜培养后弃上清，将配置好的不同浓度150、200、250、300、400、500、600G/ML的毛叶白粉藤水提物溶液分别加入培养板，并设置空白对照组只加含10胎牛血清的1640完全培养液，每孔200L，分别培。
11、养24、48、72H。结束前4H每孔加入5MG/MLMTT溶液20L。培养结束后弃上清，每孔加二甲基亚砜DMSO200L，避光轻微振荡10MIN。于酶标仪490NM波长处测定各孔的吸光度A，并按下式计算抑制率抑制率1A实验组A阴性对照100，实验重复3次。试验结果参见图1。0016根据图1可以看出，MTT结果显示150、200、250、300、400、500、600GML的毛叶白粉藤水提物在不同程度上均能抑制HEP2细胞的增殖，其抑制作用随浓度增加、时间的延长而加强，呈剂量和时间依赖性。0017实施例3毛叶白粉藤水提物诱导肿瘤细胞凋亡的试验研究说明书CN104055948A3/3页5人喉癌HE。
12、P2细胞株，用含10胎牛血清的1640完全培养液于37恒温、5CO2、95饱和湿度条件下培养。取对数生长期的HEP2细胞，以2105孔接种于铺有盖玻片的6孔板中，用不同浓度150、250、300G/ML的毛叶白粉藤水提物（实施例1制备）及05G/ML阿霉素分别处理48H，并设置阴性对照组。培养结束后弃上清，细胞爬片用PBS洗涤三次，于10G/ML的HOECHST33258染色液中避光孵育10MIN，取出细胞爬片用PBS洗涤3次，于荧光显微镜下观察。0018HOECHST33258荧光染色后，未经药物处理的阴性对照组细胞呈弥漫性均匀荧光，且荧光较弱。在各用药组中，HEP2细胞在形态学上发生明显改变，核固缩呈致密的颗粒状强荧光，尤其是毛叶白粉藤水提物高剂量组出现凋亡的典型形态学变化，可见清晰的凋亡小体。说明书CN104055948A1/1页6图1说明书附图CN104055948A。