一种微生物复合菌剂在处理石化污水污泥中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103755039 A (43)申请公布日 2014.04.30 CN 103755039 A (21)申请号 201310742337.5 (22)申请日 2013.12.30 C02F 3/34(2006.01) C02F 11/02(2006.01) C02F 101/32(2006.01) (71)申请人兰州石化职业技术学院地址 730060 甘肃省兰州市西固区山丹街 1 号 (72)发明人张满效谢小冬张威陈拓刘光琇 (74)专利代理机构北京中恒高博知识产权代理有限公司 11249 代理人张秋云 (54) 发明名称一种微生物复合菌剂在处理。

2、石化污水污泥中的应用 (57) 摘要本发明提供一种微生物复合菌剂在处理石化污水污泥中的应用。具体为： 1）制备生物载体：在聚亚苯基氧化物中加入戊二醛悬浮搅拌，洗涤后加入含 CaCl2的 PBS 缓冲液静置； 2）微生物复合菌剂的扩大培养； 3）将步骤（2）得到的扩大培养后的微生物复合菌剂放入步骤（1）制备的生物载体中； 4）将步骤（3）得到的载有微生物复合菌剂的生物载体加入石化污水中，微生物复合菌剂继续增值至稳定期，在生物载体表面形成生物膜，进行新陈代谢，吸附、吸收、消化、分解石化污水和污泥中有机污染物和重金属，使之转化。

3、成为稳定的无害化物质。本申请人通过研究发现，该微生物复合菌剂能很好的处理石化的污水污泥。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 8 页附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图3页 (10)申请公布号 CN 103755039 A CN 103755039 A 1/1 页 2 1. 一种微生物复合菌剂在处理石化污水污泥中的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于：所述应用的步骤如下：（1）制备生物载体：在聚亚苯基氧化物中加入戊二醛悬浮搅拌，洗涤后加入含 CaCl2的 PBS 。

4、缓冲液静置；（2）微生物复合菌剂的扩大培养；（3）将步骤（2）得到的扩大培养后的微生物复合菌剂放入步骤（1）制备的生物载体中；（4）将步骤（3）得到的载有微生物复合菌剂的生物载体加入石化污水中，微生物复合菌剂继续增值至稳定期，在生物载体表面形成生物膜，进行新陈代谢，吸附、吸收、消化、分解石化污水和污泥中有机污染物和重金属，使之转化成为稳定的无害化物质。 3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（2）中所述扩大培养是将微生物复合菌剂涂布于 LB 固体培养基中，于 20-30、 150 rpm/min 的摇床上振荡培养 24-4。

5、8 小时，至微生物复合菌剂浓度为 103个 /ml。 4. 根据权利要求 3 所述的应用，其特征在于：所述振荡培养的温度为 30。 5. 根据权利要求 2 所述的应用，其特征在于：步骤（3）中将步骤（2）得到的扩大培养后的微生物复合菌剂放入步骤（1）制备的生物载体中后，在 20-25下搅拌 30min， 4静置 48 小时。 6. 根据权利要求 5 所述的应用，其特征在于：所述搅拌的温度为 20。权利要求书 CN 103755039 A 2 1/8 页 3 一种微生物复合菌剂在处理石化污水污泥中的应用技术领域 0001 本发明属于微生物技术领域。

6、，具体涉及一种微生物复合菌剂在处理石化污水污泥中的应用。背景技术 0002 目前利用微生物处理工业废水中石油化工污水污泥的研究并不多，能用于水处理的有效石油降解菌的更少。卢显妍等从广州石化污水处理厂废水中分离出 2 株菌株，运用自配的含油废水做实验用水，经过 7 天的处理， 2 株菌株 COD 去除率分别为 70% 和 50% ；最高 COD 去除率为 83.67% 和 57.49%。发明内容 0003 本发明提供了一种微生物复合菌剂在处理石化污水污泥中的应用，能很好的处理石化污水污泥。 0004 本发明提供了一种微生物复合菌剂在处理石化污水污泥中的应用。 0005 优。

7、选地，所述应用的步骤如下： 1) 制备生物载体：在聚亚苯基氧化物中加入戊二醛悬浮搅拌，洗涤后加入含 CaCl2的 PBS 缓冲液静置； 2) 微生物复合菌剂的扩大培养； 3) 将步骤（2）得到的扩大培养后的微生物复合菌剂放入步骤（1）制备的生物载体中； 4) 将步骤（3）得到的载有微生物复合菌剂的生物载体加入石化污水中，微生物复合菌剂继续增值至稳定期，在生物载体表面形成生物膜，进行新陈代谢，吸附、吸收、消化、分解石化污水和污泥中有机污染物和重金属，使之转化成为稳定的无害化物质。 0006 优选地，步骤（2）中所述扩大培养是将微生物复合菌剂涂。

8、布于 LB 固体培养基中，于 20-30 、 150 rpm/min 的摇床上振荡培养 24-48 小时，至微生物复合菌剂浓度为 103个 /ml。 0007 进一步地，所述振荡培养的温度为 30。 0008 在此温度范围内振荡培养得到的复合菌剂，复合菌剂的成活率高，活性强。 0009 优选地，步骤（3）中将步骤（2）得到的扩大培养后的微生物复合菌剂放入步骤（1）制备的生物载体中后，在 20-25下搅拌 30min， 4静置 48 小时。 0010 进一步地，所述搅拌的温度为 20。 0011 在此温度下搅拌，能将微生物复合菌剂很好的固定在生物载体上。 0012 。

9、本申请人通过研究发现，由中国科学院寒区旱区环境与工程研究所馈赠的微生物复合菌剂能很好的处理石化的污水污泥。 0013 本申请人进一步的对其进行分析，发现该微生物菌剂由 22 种菌株组成。每种菌株对 CODcr 均有很好的处理效果。 0014 本申请人进一步对其中的假单胞菌属的三株菌株进行了研究，发现假单胞菌属说明书 CN 103755039 A 3 2/8 页 4 lsd03、假单胞菌属lsd05菌株对苯酚具有很好的处理效果；假单胞菌属BDP01菌株对萘、蒽有很的处理效果。 0015 本发明所述的微生物复合菌剂对污染物去除效果 CODcr 最高可达 87.1% ；通。

10、过对菌群里能降解环境中威胁最大的芳烃类化合物假单胞菌属 3 菌株鉴定和研究，发现：假单胞菌属的 lsd03、 lsd05 在 0-1000 mgL-1的苯酚浓度中生长良好，高浓度下达到对数生长期的时间较低浓度的要长，延长培养时间可以降解高浓度的苯酚；假单胞菌属的 BDP01 具有较好的多环芳烃降解能力 , 15d 内可累积降解 89.64% 的萘和 77.21% 的蒽，适量添加 Tween80 降解萘的能力提高到 96.132%，降解蒽的能力提高到 89.916%。附图说明 0016 图 1 为微生物复合菌剂中编号 1-7 菌株针对 CODcr 的去除率；图 2。

11、为微生物复合菌剂中编号 8-14 菌株针对 CODcr 的去除率；图 3 为微生物复合菌剂中编号 15-22 菌株针对 CODcr 的去除率；图4a为lsd03在不同浓度苯酚中的OD600值， 4b为lsd05在不同浓度苯酚中的OD600值；图 5 为接种量对 BDP01 降解萘的影响；图 6 为接种量对 BDP01 降解蒽的影响。具体实施方式 0017 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，。

12、均设置三次重复实验，结果取平均值。 0018 本发明中使用的微生物复合菌剂由中国科学院寒区旱区环境与工程研究所环境微生物实验室馈赠。 0019 实施例 1 应用微生物复合菌剂处理石化污水污泥的方法如下： 1、生物载体的制备：在孔径为 250m，表面积为 60m2/g 的 1g 聚亚苯基氧化物中加入 50ml 5% 戊二醛悬浮搅拌 48 小时，用 2、 4- 二硝基肼洗涤，水洗，加入含 0.75mol/L CaCl2的 50mmol/L PBS（pH5.7）缓冲液室温静置 12 小时；使得微生物易于结膜繁衍生存，即微生物易于固定； 2、将微生物复合菌剂涂布于。

13、LB固体培养基中，于30、 150rpm/min的摇床上振荡培养 24-48 小时，至微生物复合菌剂浓度为 103个 /ml ； 3、将步骤（2）制备的 50ml 微生物复合菌剂悬浮液放入步骤（1）制备的 6g 生物载体中，在 20下搅拌 30min， 4静置 48 小时，在生物载体上逐渐形成菌群生物膜，滤干待用。 0020 4、将石化污水首先通过格栅，格栅间隙 6mm，清除柵渣，以拦截污水中粗大的悬浮物杂质，去除可能堵塞水泵机组及管道阀门的较粗大悬浮物，并保证后续处理设施能正常运行；再通过隔油池，隔油池主要用于分离去除废水中悬浮状态的油品，其规格依。

14、水流量大小而定。石化污水通过隔油池时，油品上浮水面，由集油管输送到集油管中流入脱水罐，沉淀下来的重油及其他杂质，积聚到池底污泥斗中，通过排泥管进入污泥管中，经过隔油处理说明书 CN 103755039 A 4 3/8 页 5 的废水则进入调节池中，在 20-35下，将步骤（3）得到的载有微生物复合菌剂的生物载体投入调节池中，微生物复合菌剂继续增值至稳定期，在生物载体表面形成生物膜，进行新陈代谢，吸附、吸收、消化、分解污水和污泥中有机污染物和重金属，使之转化成为稳定的无害化物质。 0021 实施例 2 应用微生物复合菌剂处理石化污水污泥的方法如。

15、下： 1、生物载体的制备：在孔径为 200m，表面积为 70m2/g 的 1g 聚亚苯基氧化物中加入 50ml 5% 戊二醛悬浮搅拌 48 小时，用 2、 4- 二硝基肼洗涤，水洗，加入含 0.75mol/L CaCl2的 50mmol/L PBS（pH5.7）缓冲液室温静置 12 小时；使得微生物易于结膜繁衍生存，即微生物易于固定； 2、将微生物复合菌剂涂布于LB固体培养基中，于20、 150rpm/min的摇床上振荡培养 24-48 小时，至微生物复合菌剂浓度为 103个 /ml ； 3、将步骤（2）制备的 50ml 微生物复合菌剂悬浮液放入步骤（。

16、1）制备的 6g 生物载体中，在 25下搅拌 30min， 4静置 48 小时，在生物载体上逐渐形成菌群生物膜，滤干待用。 0022 4、将石化污水首先通过格栅，格栅间隙 6mm，清除柵渣，以拦截污水中粗大的悬浮物杂质，去除可能堵塞水泵机组及管道阀门的较粗大悬浮物，并保证后续处理设施能正常运行；再通过隔油池，隔油池主要用于分离去除废水中悬浮状态的油品，其规格依水流量大小而定。石化污水通过隔油池时，油品上浮水面，由集油管输送到集油管中流入脱水罐，沉淀下来的重油及其他杂质，积聚到池底污泥斗中，通过排泥管进入污泥管中，经过隔油处理的废水则进入调节池中。

17、，在 20-35下，将步骤（3）得到的载有微生物复合菌剂的生物载体投入调节池中，微生物复合菌剂继续增值至稳定期，在生物载体表面形成生物膜，进行新陈代谢，吸附、吸收、消化、分解污水和污泥中有机污染物和重金属，使之转化成为稳定的无害化物质。 0023 以下是应用本发明实施例 1 中所述的微生物复合菌剂处理石化污水污泥的方法进行具体试验的结果数据。 0024 试验污水取自取兰州石化污水处理厂进水口，污水中应用本发明所述的微生物复合菌剂处理石化污水污泥的方法处理前后各项指标参见表 1。 0025 表 1 说明书 CN 103755039 A 5 4/8 页 6 。

18、。 0026 经测定，本发明所述的微生物复合菌剂由 22 种菌组成， 22 种菌所属属及其在微生物复合菌剂中所占质量份数见表 2。 0027 表 2 微生物复合菌剂及各组分具体质量份数说明书 CN 103755039 A 6 5/8 页 7 。 0028 表 3 和图 1-3 是表 2 中各单个菌株分别应用上述的处理石化污水污泥方法针对 CODcr（用重铬酸钾法测得的化学需氧量）的去除效果。 0029 表 3 不同菌种对 CODcr 的去除率（%）说明书 CN 103755039 A 7 6/8 页 8 。 0030 从表 3 和图 1-3 中可以看出，在前 3 天，菌。

19、种 3， 11， 12， 14， s1， s2， s3， s4， s5， w1， w5 和 w7 均有很好的处理效果， CODcr 去除率都达到 50%。菌种 1 的去除效果不是很好，去除率还未达到 10%。而菌种 2， 4， 13，和 s3 也有较好的效果，去除率都达到了 45% 以上。其他的菌种的 CODcr 去除率都在 20%-40% 之间。经过 6 天处理，大部分细菌的 CODcr 去除率有了进一步的提高。到了第 9 天，除了菌种 1， 6， 7， 8 和 10，所有的细菌的去除率都达到 50% 以上。最终大部分细菌都能达到 70% 以上的去除效果，取得了理想的效果。

20、。 0031 经过比较，大部分细菌 ( 菌种 3， 11， 12， 14， s1， s2， s3， s4， s5， w1， w5 和 w7) 在前期就取得了很好的处理效果，随着继续降解，最终都取得不错的降解率，说明这些细菌能很快的适应实验污水的环境。随着降解的继续，降解速率有所下降，这可能是随着降解的进行，实验污水中有机物浓度逐渐降低有很大关系。随着污水中营养物质的降低，水样中实验菌株容易降解的成分减少 , 剩余的是其较难降解的成分。原来污水中的大量微生物因为营养物质的稀少而死亡或者活性降低，从而导致细菌的降解速率的下降或者死亡。也可能是水样中实验菌株的某些代谢产物。

21、的积累会抑制其自身细胞的生长繁殖。菌种1， 5， 6， 9和10在前期的处理效果较差，随后处理效率有所提高，最终也能达到 70% 以上的 CODcr 去除率。这也许是这些菌种需要经过较长一段时间对污水的适应。经过一段时间的适应，菌种适应了实验污水的环境，处理效率也就自然有了较大的提升。其中菌种 1 经过 12 天的连续处理，处理率还未达到 50% ；菌种 6 和 10 经过 9 天也未达到 50%。菌种 7 和 8 与其他菌种相比，处理效果不是很好，经过 18 天的处理，污水的 CODcr 仍为 683.74mg/L 和 558.27mg/L，去除率分别为 54。

22、.4% 和 62.8%。除了菌种 7， 8 和 w5，其他的菌种经过 18 天的连续处理，污水的处理 CODcr 均可达到 73.3% 以上。上述实验进一步说明本发明所述的微生物复合菌剂对污水说明书 CN 103755039 A 8 7/8 页 9 的处理效果良好。 0032 本申请人进一步的研究了微生物复合菌剂中假单胞菌属 lsd03、假单胞菌属 lsd05 菌株对不同苯酚浓度对生长量的影响。 0033 苯酚液体选择培养基制备方法：将K2HPO4 5.17g、 KH2PO4 1.7g加ddH2O配制成10mL 盐溶液，再加 ddH2O 至 1000mL，调 pH 7.0。

23、-7.2， 121灭菌 20min，待冷却后再定量加入除菌后的苯酚（121灭菌）。 0034 将 lsd03、 lsd05 菌株在不含苯酚的 50 mL LB 液体培养基中 30， 150 rmin-1分别震荡培养 24h 至对数生长期，按 1 接种量分别接种到含有不同浓度苯酚（0、 400、 700、 1000、 1300、 1500、 1700、 2000 mgL-1）的 50 mL 苯酚液体选择培养基中， 30， 150 rmin- 1震荡培养，每 12h 取一次样，测定其 OD600，至 120h。 0035 结果表明， lsd03、 lsd05 菌株在 130。

24、0-2000 mgL-1浓度的苯酚中生长均接近停滞状态，但在0-1000 mgL-1的苯酚浓度中生长良好（参见图4 lsd03 a、 lsd05 b）。该结果表明两菌株的最大苯酚耐受浓度为 1000 mgL-1。但在 1000 mgL-1苯酚浓度下菌株达到对数生长期的时间较低浓度的要长，因此在实践中，欲使其降解高浓度的苯酚，可适当延长培养时间。 0036 本申请人还研究了微生物复合菌剂中假单胞菌属 BDP01 菌株对萘、蒽的降解效果。 0037 BDP01菌株在LB液体培养基中48h内呈对数生长， 48h到72h进入生长稳定期,72 h 后开始进入衰亡期；其最佳培养温。

25、度为 30，最适生长 pH 为中性或弱碱性。该菌能在萘和蒽的质量浓度分别为 100 mgL -1 和 50mgL -1 的无机盐液体培养基中良好生长，与已报道的其他微生物比较， BDP01 在较短时间内具有较强的降解多环芳烃能力， 1% 的接种量 15d 内可降解 89. 64% 的萘和 77. 21% 的蒽。 0038 一、 BDP01 菌株对萘、蒽的降解能力的测定： 1、标准曲线的绘制：分别配制不同浓度的萘、蒽溶液，置于 3mL 的石英比色皿中，用紫外分光光度计分别测定对应工作波长下的吸光度值 ( 萘： 275nm，蒽： 254nm)，以吸光度值为纵坐标。

26、，萘或蒽的浓度为横坐标绘制标准曲线。其中，萘标准曲线和蒽标准曲线如式 (1) 和 (2) 所示： y =0. 2722x -0. 2916 R2 =0. 9982 (1) y =0. 1999x -0. 2183 R2 =0. 9986 (2)。 0039 2、降解能力测定：配制萘浓度为 100 mg L-1、蒽浓度为 50 mg L-1的无机盐液体培养基： (NH4 )SO4 3g， KH2PO4 0.5g， Na2 HPO4 0.5g， MgSO4 0.3g，微量元素溶液 1mL，加入相应质量的萘或蒽，调 pH = 7.0，以 ddH2O 定容至 1000mL， 1。

27、21灭菌 20min，备用。 0040 其中,微量元素溶液的配制为： FeCl3 0. 3 g， FeSO4 7H2O 0. 3 g， MnSO4 H2O 0.15 g， ZnSO4 0.14 g， CoCl2 0.2 g，以 ddH2O 定容至 1000mL，过滤除菌后备用。 0041 将对数生长期的 BDP01 菌按 1% 的接种量接入无机盐液体培养基中， 35、 150rmin-1下恒温振荡培养。培养过程中每 72h 取样 1 次，整瓶提取培养液，用有机溶剂 ( 萘用正己烷，蒽用环己烷 ) 振荡萃取 3 次，萃取液经定容后用紫外分光光度计分析。检测对应波长 ( 萘：。

28、275nm，蒽： 254nm) 下的吸光值，根据标准曲线计算其降解率 (Wen et al. , 2005; Zhang et al. , 2004)，实验做 3 个重复。 0042 本申请人利用特异性引物对BDP01菌株进行扩增，扩增出大小为400 bp左右的邻说明书 CN 103755039 A 9 8/8 页 10 苯二酚 2, 3- 双加氧酶（C23O）基因片段 , 其序列与 NCBI 数据库中的 C23O 基因同源性最高为 92%，从基因水平上证实了 BDP01 菌株具有可降解多环芳烃的遗传基础。该酶在 20 65 以邻苯二酚为底物时 , 细胞裂解液中酶活力变。

29、化范围为 13. 10-540. 86 U。 0043 二、接种量对 BDP01 降解萘、蒽的影响接种量对 BDP01 降解萘、蒽的影响如图 5 和 6。从图中可知，接种量对 BDP01 降解萘、蒽的影响并不大， 0.5、 1、 1.5、 2%的接种量15d对萘、蒽的降解率都很相近，但总的来说1%的接种量对萘的降解率最大，达到 89.64% ； 1.5% 的接种量对蒽的降解率最大，达到 77.21%。 0044 三、不同 pH、温度、接种量、吐温 80 含量对蒽的降解试验效果参见表 4。 0045 表 4 BDP01 降解蒽的正交实验结果。 0046 由图 5。

30、、 6 和表 4 可知： 1. BDP01 对萘、蒽有较强的降解能力，接种量对其降解率的影响不大，总体来看， 1% 的接种量 15d 可降解 89.64% 的萘， 1.5% 的接种量 15d 可降解 77.21% 的蒽。 0047 2. 适量 Tween80 的加入可大幅提升 BDP01 降解能力，在培养基中加入 0.5% 的 Tween80可将BDP01 15d降解萘的能力提高到96.132%，降解蒽的能力提高到89.916%。但是实验结果同样也表明，加入过多的 Tween80 反而会降低 BDP01 降解萘、蒽的效率。 0048 3. 通过正交实验可知， pH 对 B。

31、DP01 降解萘的影响极为显著，吐温 80 影响为显著，温度和接种量影响不显著。Tween80 对 BDP01 降解蒽的影响极为显著， pH 值和温度影响显著，接种量影响不显著。 0049 上述实验进一步说明本发明所述的微生物复合菌剂对污水的处理效果良好。 0050 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书 CN 103755039 A 10 1/3 页 11 图 1 图 2 说明书附图 CN 103755039 A 11 2/3 页 12 图 3 图 4 说明书附图 CN 103755039 A 12 3/3 页 13 图 5 图 6 说明书附图 CN 103755039 A 13 。

摘要
申请专利号：	CN201310742337.5	申请日：	2013.12.30
公开号：	CN103755039A	公开日：	2014.04.30
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的撤回IPC(主分类):C02F 3/34申请公布日:20140430\|\|\|公开
IPC分类号：	C02F3/34; C02F11/02; C02F101/32(2006.01)N	主分类号：	C02F3/34
申请人：	兰州石化职业技术学院
发明人：	张满效; 谢小冬; 张威; 陈拓; 刘光琇
地址：	730060 甘肃省兰州市西固区山丹街1号
优先权：
专利代理机构：	北京中恒高博知识产权代理有限公司 11249	代理人：	张秋云
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内容摘要

本发明提供一种微生物复合菌剂在处理石化污水污泥中的应用。具体为：1）制备生物载体：在聚亚苯基氧化物中加入戊二醛悬浮搅拌，洗涤后加入含CaCl2的PBS缓冲液静置；2）微生物复合菌剂的扩大培养；3）将步骤（2）得到的扩大培养后的微生物复合菌剂放入步骤（1）制备的生物载体中；4）将步骤（3）得到的载有微生物复合菌剂的生物载体加入石化污水中，微生物复合菌剂继续增值至稳定期，在生物载体表面形成生物膜，进行新陈代谢，吸附、吸收、消化、分解石化污水和污泥中有机污染物和重金属，使之转化成为稳定的无害化物质。本申请人通过研究发现，该微生物复合菌剂能很好的处理石化的污水污泥。

权利要求书

权利要求书
1.  一种微生物复合菌剂在处理石化污水污泥中的应用。

2.  根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用的步骤如下：
（1）制备生物载体：在聚亚苯基氧化物中加入戊二醛悬浮搅拌，洗涤后加入含 CaCl2的PBS缓冲液静置；
（2）微生物复合菌剂的扩大培养；
（3）将步骤（2）得到的扩大培养后的微生物复合菌剂放入步骤（1）制备的生物载体中；
（4）将步骤（3）得到的载有微生物复合菌剂的生物载体加入石化污水中，微生物复合菌剂继续增值至稳定期，在生物载体表面形成生物膜，进行新陈代谢，吸附、吸收、消化、分解石化污水和污泥中有机污染物和重金属，使之转化成为稳定的无害化物质。

3.  根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（2）中所述扩大培养是将微生物复合菌剂涂布于LB固体培养基中，于20-30℃、150 rpm/min的摇床上振荡培养24-48小时，至微生物复合菌剂浓度为103个/ml。

4.  根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述振荡培养的温度为30℃。

5.  根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（3）中将步骤（2）得到的扩大培养后的微生物复合菌剂放入步骤（1）制备的生物载体中后，在20-25℃下搅拌30min，4℃静置48小时。

6.  根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述搅拌的温度为20℃。

说明书

说明书一种微生物复合菌剂在处理石化污水污泥中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种微生物复合菌剂在处理石化污水污泥中的应用。
背景技术
目前利用微生物处理工业废水中石油化工污水污泥的研究并不多，能用于水处理的有效石油降解菌的更少。卢显妍等从广州石化污水处理厂废水中分离出2株菌株，运用自配的含油废水做实验用水，经过7天的处理，2株菌株COD去除率分别为70%和50%；最高COD去除率为83.67%和57.49%。
发明内容
本发明提供了一种微生物复合菌剂在处理石化污水污泥中的应用，能很好的处理石化污水污泥。
    本发明提供了一种微生物复合菌剂在处理石化污水污泥中的应用。
    优选地，所述应用的步骤如下：
1)        制备生物载体：在聚亚苯基氧化物中加入戊二醛悬浮搅拌，洗涤后加入含 CaCl2的PBS缓冲液静置；
2)        微生物复合菌剂的扩大培养；
3)        将步骤（2）得到的扩大培养后的微生物复合菌剂放入步骤（1）制备的生物载体中；
4)        将步骤（3）得到的载有微生物复合菌剂的生物载体加入石化污水中，微生物复合菌剂继续增值至稳定期，在生物载体表面形成生物膜，进行新陈代谢，吸附、吸收、消化、分解石化污水和污泥中有机污染物和重金属，使之转化成为稳定的无害化物质。
优选地，步骤（2）中所述扩大培养是将微生物复合菌剂涂布于LB固体培养基中，于20-30 ℃、150 rpm/min的摇床上振荡培养24-48小时，至微生物复合菌剂浓度为103个/ml。
进一步地，所述振荡培养的温度为30℃。
在此温度范围内振荡培养得到的复合菌剂，复合菌剂的成活率高，活性强。
优选地，步骤（3）中将步骤（2）得到的扩大培养后的微生物复合菌剂放入步骤（1）制备的生物载体中后，在20-25℃下搅拌30min，4℃静置48小时。
进一步地，所述搅拌的温度为20℃。
在此温度下搅拌，能将微生物复合菌剂很好的固定在生物载体上。
本申请人通过研究发现，由中国科学院寒区旱区环境与工程研究所馈赠的微生物复合菌剂能很好的处理石化的污水污泥。
本申请人进一步的对其进行分析，发现该微生物菌剂由22种菌株组成。每种菌株对CODcr均有很好的处理效果。
本申请人进一步对其中的假单胞菌属的三株菌株进行了研究，发现假单胞菌属lsd03、假单胞菌属lsd05菌株对苯酚具有很好的处理效果；假单胞菌属BDP01菌株对萘、蒽有很的处理效果。
本发明所述的微生物复合菌剂对污染物去除效果CODcr最高可达87.1%；通过对菌群里能降解环境中威胁最大的芳烃类化合物假单胞菌属3菌株鉴定和研究，发现：假单胞菌属的lsd03、lsd05在0-1000 mgL-1的苯酚浓度中生长良好，高浓度下达到对数生长期的时间较低浓度的要长，延长培养时间可以降解高浓度的苯酚；假单胞菌属的BDP01具有较好的多环芳烃降解能力, 15d内可累积降解89.64% 的萘和77.21% 的蒽，适量添加Tween80降解萘的能力提高到96.132%，降解蒽的能力提高到89.916%。
附图说明
图1为微生物复合菌剂中编号1-7菌株针对CODcr的去除率；
图2为微生物复合菌剂中编号8-14菌株针对CODcr的去除率；
图3为微生物复合菌剂中编号15-22菌株针对CODcr的去除率；
图4a为lsd03在不同浓度苯酚中的OD600值，4b为lsd05在不同浓度苯酚中的OD600值；
图5为接种量对BDP01降解萘的影响；
图6为接种量对BDP01降解蒽的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明中使用的微生物复合菌剂由中国科学院寒区旱区环境与工程研究所环境微生物实验室馈赠。
实施例1
应用微生物复合菌剂处理石化污水污泥的方法如下：
1、生物载体的制备：在孔径为250μm，表面积为60m2/g的1g聚亚苯基氧化物中加入50ml 5%戊二醛悬浮搅拌48小时，用2、4-二硝基肼洗涤，水洗，加入含0.75mol/L CaCl2的50mmol/L PBS（pH5.7）缓冲液室温静置12小时；使得微生物易于结膜繁衍生存，即微生物易于固定；
2、将微生物复合菌剂涂布于LB固体培养基中，于30℃、150rpm/min的摇床上振荡培养24-48小时，至微生物复合菌剂浓度为103个/ml；
3、将步骤（2）制备的50ml微生物复合菌剂悬浮液放入步骤（1）制备的6g生物载体中，在20℃下搅拌30min，4℃静置48小时，在生物载体上逐渐形成菌群生物膜，滤干待用。
4、将石化污水首先通过格栅，格栅间隙6mm，清除柵渣，以拦截污水中粗大的悬浮物杂质，去除可能堵塞水泵机组及管道阀门的较粗大悬浮物，并保证后续处理设施能正常运行；再通过隔油池，隔油池主要用于分离去除废水中悬浮状态的油品，其规格依水流量大小而定。石化污水通过隔油池时，油品上浮水面，由集油管输送到集油管中流入脱水罐，沉淀下来的重油及其他杂质，积聚到池底污泥斗中，通过排泥管进入污泥管中，经过隔油处理的废水则进入调节池中，在20-35℃下，将步骤（3）得到的载有微生物复合菌剂的生物载体投入调节池中，微生物复合菌剂继续增值至稳定期，在生物载体表面形成生物膜，进行新陈代谢，吸附、吸收、消化、分解污水和污泥中有机污染物和重金属，使之转化成为稳定的无害化物质。
实施例2
应用微生物复合菌剂处理石化污水污泥的方法如下：
1、生物载体的制备：在孔径为200μm，表面积为70m2/g的1g聚亚苯基氧化物中加入50ml 5%戊二醛悬浮搅拌48小时，用2、4-二硝基肼洗涤，水洗，加入含0.75mol/L CaCl2的50mmol/L PBS（pH5.7）缓冲液室温静置12小时；使得微生物易于结膜繁衍生存，即微生物易于固定；
2、将微生物复合菌剂涂布于LB固体培养基中，于20℃、150rpm/min的摇床上振荡培养24-48小时，至微生物复合菌剂浓度为103个/ml；
3、将步骤（2）制备的50ml微生物复合菌剂悬浮液放入步骤（1）制备的6g生物载体中，在25℃下搅拌30min，4℃静置48小时，在生物载体上逐渐形成菌群生物膜，滤干待用。
4、将石化污水首先通过格栅，格栅间隙6mm，清除柵渣，以拦截污水中粗大的悬浮物杂质，去除可能堵塞水泵机组及管道阀门的较粗大悬浮物，并保证后续处理设施能正常运行；再通过隔油池，隔油池主要用于分离去除废水中悬浮状态的油品，其规格依水流量大小而定。石化污水通过隔油池时，油品上浮水面，由集油管输送到集油管中流入脱水罐，沉淀下来的重油及其他杂质，积聚到池底污泥斗中，通过排泥管进入污泥管中，经过隔油处理的废水则进入调节池中，在20-35℃下，将步骤（3）得到的载有微生物复合菌剂的生物载体投入调节池中，微生物复合菌剂继续增值至稳定期，在生物载体表面形成生物膜，进行新陈代谢，吸附、吸收、消化、分解污水和污泥中有机污染物和重金属，使之转化成为稳定的无害化物质。
以下是应用本发明实施例1中所述的微生物复合菌剂处理石化污水污泥的方法进行具体试验的结果数据。
试验污水取自取兰州石化污水处理厂进水口，污水中应用本发明所述的微生物复合菌剂处理石化污水污泥的方法处理前后各项指标参见表1。
表1
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经测定，本发明所述的微生物复合菌剂由22种菌组成，22种菌所属属及其在微生物复合菌剂中所占质量份数见表2。
表2 微生物复合菌剂及各组分具体质量份数
。
表3和图1-3是表2中各单个菌株分别应用上述的处理石化污水污泥方法针对CODcr（用重铬酸钾法测得的化学需氧量）的去除效果。
表3 不同菌种对CODcr的去除率（%）
。
从表3和图1-3中可以看出，在前3天，菌种3，11，12，14，s1，s2，s3，s4，s5，w1，w5和w7均有很好的处理效果，CODcr去除率都达到50%。菌种1的去除效果不是很好，去除率还未达到10%。而菌种2，4，13，和s3也有较好的效果，去除率都达到了45%以上。其他的菌种的CODcr去除率都在20%-40%之间。经过6天处理，大部分细菌的CODcr去除率有了进一步的提高。到了第9天，除了菌种1，6，7，8和10，所有的细菌的去除率都达到50%以上。最终大部分细菌都能达到70%以上的去除效果，取得了理想的效果。
经过比较，大部分细菌(菌种3，11，12，14，s1，s2，s3，s4，s5，w1，w5和w7)在前期就取得了很好的处理效果，随着继续降解，最终都取得不错的降解率，说明这些细菌能很快的适应实验污水的环境。随着降解的继续，降解速率有所下降，这可能是随着降解的进行，实验污水中有机物浓度逐渐降低有很大关系。随着污水中营养物质的降低，水样中实验菌株容易降解的成分减少,剩余的是其较难降解的成分。原来污水中的大量微生物因为营养物质的稀少而死亡或者活性降低，从而导致细菌的降解速率的下降或者死亡。也可能是水样中实验菌株的某些代谢产物的积累会抑制其自身细胞的生长繁殖。菌种1，5，6，9和10在前期的处理效果较差，随后处理效率有所提高，最终也能达到70%以上的CODcr去除率。这也许是这些菌种需要经过较长一段时间对污水的适应。经过一段时间的适应，菌种适应了实验污水的环境，处理效率也就自然有了较大的提升。其中菌种1经过12天的连续处理，处理率还未达到50%；菌种6和10经过9天也未达到50%。菌种7和8与其他菌种相比，处理效果不是很好，经过18天的处理，污水的CODcr仍为683.74mg/L和558.27mg/L，去除率分别为54.4%和62.8%。除了菌种7，8和w5，其他的菌种经过18天的连续处理，污水的处理CODcr均可达到73.3%以上。上述实验进一步说明本发明所述的微生物复合菌剂对污水的处理效果良好。
本申请人进一步的研究了微生物复合菌剂中假单胞菌属lsd03、假单胞菌属lsd05菌株对不同苯酚浓度对生长量的影响。
苯酚液体选择培养基制备方法：将K2HPO4 5.17g、KH2PO4 1.7g加ddH2O配制成10mL盐溶液，再加ddH2O至1000mL，调pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min，待冷却后再定量加入除菌后的苯酚（121℃灭菌）。
将lsd03、lsd05菌株在不含苯酚的50 mL LB液体培养基中30℃，150 rmin-1分别震荡培养24h至对数生长期，按1﹪接种量分别接种到含有不同浓度苯酚（0、400、700、1000、1300、1500、1700、2000 mgL-1）的50 mL苯酚液体选择培养基中，30℃，150 rmin- 1震荡培养，每12h取一次样，测定其OD600，至120h。
结果表明，lsd03、lsd05菌株在1300-2000 mgL-1浓度的苯酚中生长均接近停滞状态，但在0-1000 mgL-1的苯酚浓度中生长良好（参见图4 lsd03 a、lsd05 b）。该结果表明两菌株的最大苯酚耐受浓度为1000 mgL-1。但在1000 mgL-1苯酚浓度下菌株达到对数生长期的时间较低浓度的要长，因此在实践中，欲使其降解高浓度的苯酚，可适当延长培养时间。
本申请人还研究了微生物复合菌剂中假单胞菌属BDP01菌株对萘、蒽的降解效果。
BDP01菌株在LB液体培养基中48h内呈对数生长，48h到72h进入生长稳定期,72 h后开始进入衰亡期；其最佳培养温度为30℃，最适生长pH为中性或弱碱性。该菌能在萘和蒽的质量浓度分别为100 mg·L -1 和50mg·L -1 的无机盐液体培养基中良好生长，与已报道的其他微生物比较，BDP01 在较短时间内具有较强的降解多环芳烃能力，1%的接种量15d 内可降解89. 64%的萘和77. 21%的蒽。
一、BDP01菌株对萘、蒽的降解能力的测定：
1、标准曲线的绘制：分别配制不同浓度的萘、蒽溶液，置于3mL的石英比色皿中，用紫外分光光度计分别测定对应工作波长下的吸光度值(萘：275nm，蒽：254nm)，以吸光度值为纵坐标，萘或蒽的浓度为横坐标绘制标准曲线。其中，萘标准曲线和蒽标准曲线如式(1)和(2)所示：
y =0. 2722x -0. 2916　R2 =0. 9982 (1)
y =0. 1999x -0. 2183　R2 =0. 9986 (2)。
2、降解能力测定：
①配制萘浓度为100 mg·L-1、蒽浓度为50 mg·L-1的无机盐液体培养基：(NH4 )SO4 3g，KH2PO4 0.5g，Na2 HPO4 0.5g，MgSO4 0.3g，微量元素溶液1mL，加入相应质量的萘或蒽，调pH = 7.0，以ddH2O定容至1000mL，121℃灭菌20min，备用。
其中,微量元素溶液的配制为：FeCl3 0. 3 g，FeSO4·7H2O 0. 3 g，MnSO4 H2O 0.15 g，ZnSO4 0.14 g，CoCl2 0.2 g，以ddH2O定容至1000mL，过滤除菌后备用。
②将对数生长期的BDP01菌按1%的接种量接入无机盐液体培养基中，35℃、150r·min-1下恒温振荡培养。培养过程中每72h取样1次，整瓶提取培养液，用有机溶剂(萘用正己烷，蒽用环己烷)振荡萃取3次，萃取液经定容后用紫外分光光度计分析。检测对应波长(萘：275nm，蒽：254nm)下的吸光值，根据标准曲线计算其降解率(Wen et al. , 2005; Zhang et al. , 2004)，实验做3个重复。
本申请人利用特异性引物对BDP01菌株进行扩增，扩增出大小为400 bp左右的邻苯二酚2, 3-双加氧酶（C23O）基因片段, 其序列与NCBI数据库中的C23O基因同源性最高为92%，从基因水平上证实了BDP01菌株具有可降解多环芳烃的遗传基础。该酶在20 ~ 65 ℃以邻苯二酚为底物时, 细胞裂解液中酶活力变化范围为13. 10-540. 86 U。
二、接种量对BDP01降解萘、蒽的影响
接种量对BDP01降解萘、蒽的影响如图5和6。从图中可知，接种量对BDP01降解萘、蒽的影响并不大，0.5、1、1.5、2%的接种量15d对萘、蒽的降解率都很相近，但总的来说1%的接种量对萘的降解率最大，达到89.64%；1.5%的接种量对蒽的降解率最大，达到77.21%。
三、不同pH、温度、接种量、吐温80含量对蒽的降解试验效果参见表4。
表4 BDP01降解蒽的正交实验结果
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由图5、6和表4可知：
1. BDP01对萘、蒽有较强的降解能力，接种量对其降解率的影响不大，总体来看，1%的接种量15d可降解89.64%的萘，1.5%的接种量15d可降解77.21%的蒽。
2. 适量Tween80的加入可大幅提升BDP01降解能力，在培养基中加入0.5%的Tween80可将BDP01 15d降解萘的能力提高到96.132%，降解蒽的能力提高到89.916%。但是实验结果同样也表明，加入过多的Tween80反而会降低BDP01降解萘、蒽的效率。
3. 通过正交实验可知，pH对BDP01降解萘的影响极为显著，吐温80影响为显著，温度和接种量影响不显著。Tween80对BDP01降解蒽的影响极为显著，pH值和温度影响显著，接种量影响不显著。
上述实验进一步说明本发明所述的微生物复合菌剂对污水的处理效果良好。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。