一种高活性锰过氧化氢酶模拟物及其制备方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103709199 A (43)申请公布日 2014.04.09 CN 103709199 A (21)申请号 201310699343.7 (22)申请日 2013.12.19 C07F 13/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) B01J 31/22(2006.01) (71)申请人 江苏大学 地址 212013 江苏省镇江市京口区学府路 301 号 (72)发明人 陈秋云 王志伟 (54) 发明名称 一种高活性锰过氧化氢酶模拟物及其制备方 法和应用 (57) 摘要 本发明提供一种高活性的锰过氧化氢酶模拟 物及这种化合物的合成制备方法。所。

2、述高活性的 锰过氧化氢酶模拟物名称为 （2- 二 （二吡啶甲基） 胺 -N-8- 喹啉乙酰胺） 二水合醋酸锰 ； 其制备方法 为 ： 首先制备了 2- 二 （2- 吡啶甲基） 胺 -N-8- 喹 啉乙酰胺配体 QA-DPA， 然后将该配体与醋酸锰混 合后加入无水乙醇反应， 乙醚沉淀， 过滤， 即得到 （2-二 （2-吡啶甲基） 胺-N-8-喹啉乙酰胺） 二水合 醋酸锰。该锰过氧化氢酶模拟物表现出较好的抗 癌活性 ； 并且该锰过氧化氢酶模拟物能催化 H2O2 歧化为 O2和 H2O。其活性与天然酶的活性接近， 与天然的酶相比， 该模拟物分子量小， 具有良好的 细胞渗透性， 化合物性能稳定， 具有。

3、良好的运用前 景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103709199 A CN 103709199 A 1/2 页 2 1. 一种高活性锰过氧化氢酶模拟物， 其特征在于， 所述高活性锰过氧化氢酶模 拟物名称为 （2- 二 （二吡啶甲基）胺 -N-8- 喹啉乙酰胺）二水合醋酸锰， 标记为 (QA-DPA)2Mn2(H2O)2(-Ac)Ac， 其中 QA-DPA 代表 2- 二 （2- 吡啶甲基） 胺 -N-8- 喹啉乙酰 胺配体，。

4、 该高活性锰过氧化氢酶模拟物结构式为 ： 。 2. 一种高活性锰过氧化氢酶模拟物的制备方法， 其特征在于， 按照以下步骤进 行 ： （1） 将 8- 氨基喹啉与氯乙酰氯混合后加入二氯甲烷反应 ； （2） 向混合体系中依次加入二 （2- 吡啶甲基） 胺和三乙胺， 氮气保护下， 油浴回流 ； （3） 反应结束后用饱和盐水萃取洗涤， 水相使用二氯甲烷萃取， 合并有机相， 无水硫酸 钠干燥， 旋蒸出溶剂， 得红色油状物 ； （4） 将红色油状物经硅胶柱层析分离， 用乙酸乙酯洗脱， 得到淡黄色粘稠液体， 即为 2- 二 （2- 吡啶甲基） 胺 -N-8- 喹啉乙酰胺， 简称 QA-DPA ； （5）将 。

5、QA-DPA 与醋酸锰混合后加入无水乙醇反应， 乙醚扩散， 然后过滤， 得到 褐色固体， 即为 （2- 二 （2- 吡啶甲基）胺 -N-8- 喹啉乙酰胺）二水合醋酸锰， 标记为 (QA-DPA)2Mn2(H2O)2(-Ac)Ac。 3. 根据权利要求 2 所述的一种高活性锰过氧化氢酶模拟物的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中所述的 8- 氨基喹啉与氯乙酰氯的摩尔比为 1:2 2:1 ； 所述 8- 氨基喹啉在混合 液中的浓度为 0.033-0.1mol/L ； 所述反应为 40反应 2 10 h。 4. 根据权利要求 2 所述的一种高活性锰过氧化氢酶模拟物的制备方法， 其特征在于， 步。

6、骤 （2） 中二 （2- 吡啶甲基） 胺与 8- 氨基喹啉摩尔比为 1:2 2:1 ； 三乙胺与二 （2- 吡啶甲 基） 胺的摩尔比为 3:1 1:3 ； 所述油浴回流为 80回流 4 16h。 5. 根据权利要求 2 所述的一种高活性锰过氧化氢酶模拟物的制备方法， 其特征在于， 步骤 （5） 中所述的 QA-DPA 与醋酸锰的摩尔比为 1:2 2:1 ； 混合液中 QA-DPA 的浓度为 0.02-0.15mol/L ； 所述反应为 75反应 1 4h。 6. 根据权利要求 3 所述的一种高活性锰过氧化氢酶模拟物的制备方法， 其特征在于， 8- 氨基喹啉与氯乙酰氯摩尔比 1:1， 加入 15。

7、0mL 的 CH2Cl2， 40反应 6h。 7. 根据权利要求 4 所述的一种高活性锰过氧化氢酶模拟物的制备方法， 其特征在于， 所述的二 （2- 吡啶甲基） 胺与 8- 氨基喹啉摩尔比为 1:1.2 ； 三乙胺与二 （2- 吡啶甲基） 胺的 摩尔比为 1:1 ； 80油浴回流 10h。 8. 根据权利要求 5 所述的一种高活性锰过氧化氢酶模拟物的制备方法， 其特征在于， 所述的 QA-DPA 与醋酸锰的摩尔比为 1: 1.1， 混合后加入无水乙醇 50 mL， 75反应 3h。 权 利 要 求 书 CN 103709199 A 2 2/2 页 3 9. 根据权利要求 2 所述的一种高活性锰。

8、过氧化氢酶模拟物的制备方法， 其特征在于， 所制备的高活性锰过氧化氢酶模拟物应用于催化 H2O2 岐化为氧气。 10. 根据权利要求 2 所述的一种高活性锰过氧化氢酶模拟物的制备方法， 其特征在于， 所制备的高活性锰过氧化氢酶模拟物应用于抗肿瘤活性研究。 权 利 要 求 书 CN 103709199 A 3 1/5 页 4 一种高活性锰过氧化氢酶模拟物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于仿生药物制备及运用领域， 涉及一种高活性锰过氧化氢酶模拟物的制 备及其在体外模拟催化 H2O2歧化反应的活性和抗肿瘤方面的运用研究。 背景技术 0002 近年来， 人们对肿瘤细胞研究不断深入， 研。

9、究发现肿瘤细胞是一种缺氧， 低 pH 的 微环境， H2O2在实体肿瘤中浓度较普通细胞中高， H2O2浓度增加与肿瘤细胞的恶性转变有着 直接或者间接的关系， 线粒体是 H2O2的主要来源。Mn(II) 作为生物体内重要的微量元素在 生物体代谢， 特别是在氧代谢中发挥着重要的作用。 Mn(II)具有很好的亲线粒体性， Mn(II) 一旦进入细胞后就很容易被线粒体捕捉， 通过 Ca2+通道进入线粒体内。Mn(II) 过氧化氢酶 能够催化歧化过氧化氢产生氧气， 过氧化氢酶模拟研究表明一些合成的锰的过氧化氢酶也 具有很高的催化歧化活性。因此， 具有过氧化氢酶模拟活性的锰的配合物可望作为一种调 节肿瘤细。

10、胞 H2O2和氧代谢的调节剂， 诱导肿瘤细胞死亡。通过高效的锰的过氧化氢模拟酶 来降解肿瘤的产物过氧化氢浓度提高氧气的浓度调解细胞的代谢， 一方面可以降低肿瘤细 胞内的过氧化氢的浓度， 能抑制肿瘤的恶化， 另一方面， 利用氧气来调节肿瘤的缺氧环境， 也可以抑制肿瘤的生长， 这样就达到了双重的作用。 (Zhou DF, Chen QY, Qi Y, Fu HJ, Li Z, Zhao KD, Gao J. Anticancer Activity, Attenuation on the Absorption of Calcium in Mitochondria, and Catalase Acti。

11、vity for Manganese Complexes of N-Substituted Di(picolyl)amine. J. Inorg Chem. 2011; 50: 6929-6937， Kar P, Drew MGB, Ghosh A. Synthesis, structure and catalase activity of three new manganese( ) complexes with a N, N, O donor Schiff-base ligand. Inorg Chimica Acta. 2013; 405: 349-355.) 。锰有亲线粒体性， 而线粒。

12、体是过氧化氢的主要来源之一， 因此能使药 物的效果更好， 并且与过氧化氢作用的产物是水。这为成功设计一种具有低毒性， 副作 用小， 更高效的金属抗癌药物提供了可能 （Noritake Y, Umezawa N, Kato N, Higuchi T. Manganese Salen Complexes with Acid-Base Catalytic Auxiliary: Functional Mimetics of Catalase. J. Inorg Chem. 2013; 52: 3653-3662. )。 但目前报道的过氧 化氢酶模拟物的活性与从生物体内分离得到的过氧化氢酶活性差别较大，。

13、 而从生物体内分 离得到的过氧化氢酶难进入细胞， 因此根据天然酶活性中心的结构研究发展高活性锰过氧 化氢酶模拟物具有重要意义。这里我们报道一种高活性的小分子过氧化氢酶模拟酶， 其活 性与天然酶相近， 且化合物能进入细胞达到抗肿瘤的作用。 发明内容 0003 本发明的一个目的是提供一种高活性的锰过氧化氢酶模拟物， 本发明另外一个目 的是提供这种化合物的合成制备方法。 0004 本发明提供一种高活性的锰过氧化氢酶模拟物， 是一种锰配合物，（2- 二 （二吡啶 甲基） 胺 -N-8- 喹啉乙酰胺） 二水合醋酸锰， 标记为 (QA-DPA)2Mn2(H2O)2(-Ac)Ac， 其中 说 明 书 CN 。

14、103709199 A 4 2/5 页 5 QA-DPA 代表 2- 二 （2- 吡啶甲基） 胺 -N-8- 喹啉乙酰胺配体， 该锰过氧化氢酶模拟物结构式 如下 ： 本发明提供一种高活性的锰过氧化氢酶模拟物，（2- 二 （二吡啶甲基） 胺 -N-8- 喹啉乙 酰胺） 二水合醋酸锰的制备方法， 具体步骤如下 ： （1） 将 8- 氨基喹啉与氯乙酰氯混合后加入二氯甲烷 （CH2Cl2 ） 反应 ； （2） 向混合体系中依次加入二 （2- 吡啶甲基） 胺和三乙胺， 氮气保护下， 油浴回流 ； （3） 反应结束后用饱和盐水萃取洗涤， 水相使用二氯甲烷萃取， 合并有机相， 无水硫酸 钠干燥， 旋蒸出溶剂。

15、， 得红色油状物 ； （4） 将红色油状物经硅胶柱层析分离， 用乙酸乙酯洗脱， 得到淡黄色粘稠液体， 即为 2- 二 （2- 吡啶甲基） 胺 -N-8- 喹啉乙酰胺， 简称 QA-DPA。 0005 （5）将 QA-DPA 与醋酸锰混合后加入无水乙醇反应， 乙醚扩散， 然后过滤， 得 到褐色固体， 即为 （2- 二 （2- 吡啶甲基）胺 -N-8- 喹啉乙酰胺）二水合醋酸锰， 标记为 (QA-DPA)2Mn2(H2O)2(-Ac)Ac。 0006 其中， 步骤 （1） 中所述的8-氨基喹啉与氯乙酰氯的摩尔比为1:22:1 ； 所述8-氨 基喹啉在混合液中的浓度为 0.033-0.1mol/L 。

16、； 所述反应为 40反应 2 10 h。 0007 其中， 步骤 （2） 中二 （2- 吡啶甲基） 胺与 8- 氨基喹啉摩尔比为 1:2 2:1 ； 三乙胺 与二 （2- 吡啶甲基） 胺的摩尔比为 3:1 1:3 ； 所述油浴回流为 80回流 4 16h。 0008 其中， 步骤 （5）中所述的 QA-DPA 与醋酸锰的摩尔比为 1:2 2:1 ； 混合液中 QA-DPA 的浓度为 0.02-0.15mol/L ； 所述反应为 75反应 1 4h。 0009 本发明的一个较优公开例中， 步骤 （1） 中 8- 氨基喹啉与氯乙酰氯摩尔比 1:1， 加入 150mL CH2Cl2， 40反应 6h。

17、。 0010 本发明的一个较优公开例中， 步骤 （2） 中所述的二 （2-吡啶甲基） 胺与8-氨基喹啉 摩尔比 1:1.2 三乙胺与二 （2- 吡啶甲基） 胺的摩尔比为 1:1， 氮气保护， 80油浴回流 10h。 0011 本发明的一个较优公开例中， 步骤 （5） 中所述的QA-DPA与醋酸锰摩尔比1: 1.1混 合后加入无水乙醇 50 mL， 75反应 3h。 0012 本发明制得的 (QA-DPA)2Mn2(H2O)2(-Ac)Ac， 其分子式为 C50H62Mn2N10O8， 元素分 析实测值C, 57.40; H, 5.50; N, 13.96, 理论值C, 57.69; H, 5.。

18、96; N, 13.46%; 红外 特征峰 ： (O H) 3424 m, (=CH) 3060 m, ( CH2 ) 2908 m, as(COO ) 1558 s, sym(COO) 1423 s, (CH, pyridine) 768 s . 紫外特征吸收峰 ： 210 nm, 257 nm, 358 nm。 说 明 书 CN 103709199 A 5 3/5 页 6 0013 本发明的优点在于 ： 本发明利用锰配合物模拟过氧化氢酶在 Tris-HCl 缓冲溶液 （pH = 7.4） 中催化 H2O2歧 化为 O2和 H2O， 通过测定反应中氧气的释放量， 进而由 Hill 方程 （V。

19、0 = Vmax sn/(Km + s n)） 拟合得出 K m 值， 由 Kcat = Vmax/Et 计算得出化合物 kcat/KM 值， 与报道的锰配合物相比， 该锰过氧化氢酶模拟物在Tris-HCl缓冲溶液中的kcat/KM 值为9226。 其活性与已报道的锰 配合物相比， 该化合物的过氧化氢酶活性提高了 2 倍， 其活性与天然酶的活性接近， 而且在 文献中过氧化氢酶模拟物大多是在乙腈中溶液中， 本发明制备的锰过氧化氢酶模拟物即使 在 Tris-HCl 缓冲溶液也具有高过氧化氢酶活性。与天然的酶相比， 该模拟物分子量小， 具 有良好的细胞渗透性， 且化合物性能稳定， 是一种在生物医药领。

20、域有良好运用前景的过氧 化氢酶模拟物。 0014 附图说明 ： 图 1 为锰过氧化氢酶模拟物 (QA-DPA)2Mn2(H2O)2(-Ac)Ac 在不同条件下歧化 H2O2 的氧气释放速率。其中 H2O2为 0.5 mL 的 30 % H2O2， 溶剂体积为 5 mL ； 锰配合物为 0.34 mmol/L， “” 表示 37乙腈中 ； 锰配合物为 1 mmol/L，“” 表示 37 Tris HCl 中， “” 表示 0 Tris HCl 中。 0015 具体实施方式 ： 本发明所用的溶剂皆为分析纯， 用 5 分子筛进行除水处理， 所用试剂未加特殊说明直 接应用而未经任何特殊处理。乙醇 （分。

21、析纯， 上海中试化工总公司） ； 二氯甲烷 （分析纯， 上 海中试化工总公司） ； 乙酸乙酯 （分析纯， 上海中试化工总公司） ； 三乙胺、 氯化钠 （分析纯， 上 海化学试剂有限公司） ； 2,4- 二甲基吡咯、 3- 氯甲基苯甲酰氯、 二 （2- 吡啶甲基） 购自 Sigma 公司。美国 Nicolet 20DXB FR-IR 型傅立叶红外光谱仪， KBr 压片， 4004000cm-1； 日本岛津 UV-2450型紫外可见分光光度仪， 800-190 nm ； DHG-9140A型电热恒温鼓风干箱 （上海-恒 科技有限公司） ； DZF-6051 型真空干燥箱 （上海 - 恒科技有限公司。

22、） 。 0016 下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明， 以使本领域技术人员更好地理解 本发明， 但本发明并不局限于以下实施例。 0017 实施例 1 ： 8- 氨基喹啉 （720 mg， 5 mmol） 与氯乙酰氯 （565 mg， 5 mmol） 摩尔比为 1:1 混合后加 入 CH2Cl2 150 mL， 混合溶液中 8- 氨基喹啉的浓度为 0.033mol/L， 40反应 6h 然后加入二 （2- 吡啶甲基） 胺 （825 mg， 4.17 mmol） ， 三乙胺 （420 mg， 4.17 mmol） ， 氮气保护下 80油浴 回流 10 h ； 反应结束后， 使用 330 mL。

23、 饱和盐水萃取洗涤， 水相使用 330 mL 二氯甲烷萃 取， 合并有机相， 无水硫酸钠干燥， 旋蒸出溶剂， 得红色油状物 ； 硅胶柱层析分离， 使用乙酸 乙酯洗脱， 得到淡黄色粘稠液体 QA-DPA 1.34g。产率 70%。QA-DPA(1.34 g， 3.5 mmol) 和 MnAc24H2O（875 mg, 3.85 mmol） 的乙醇溶液 50mL， 混合溶液中 QA-DPA 的浓度为 0.07 mol/L， 75加热回流 3h ； 反应完毕后， 在旋转蒸发仪上浓缩， 乙醚沉淀， 得褐色固体， 真空 干燥。产率 80%。 0018 实施例 2 ： 8- 氨基喹啉 （720 mg, 5。

24、 mmol） 与氯乙酰氯 （1.13 g, 10 mmol） 以摩尔比为 1:2 混合 后加入 CH2Cl2 50 mL， 混合溶液中 8- 氨基喹啉的浓度为 0.1mol/L， 40反应 2h ； 然后加入 二 （2- 吡啶甲基） 胺 （500m g， 2.5 mmol） ， 三乙胺 （758 mg， 7.5 mmol） ， 氮气保护下 80油 说 明 书 CN 103709199 A 6 4/5 页 7 浴回流 4h ； 反应结束后， 使用 330 mL 饱和盐水萃取洗涤， 水相使用 330 mL 二氯甲烷萃 取， 合并有机相， 无水硫酸钠干燥， 旋蒸出溶剂， 得红色油状物 ； 硅胶柱层析。

25、分离， 使用乙酸 乙酯洗脱， 得到淡黄色粘稠液体 1.14 g， 产率为 58%。将配体 QA-DPA （1.14 g, 3 mmol） 和 MnAc2 4H2O（1.44 g, 6 mmol） 的乙醇溶液 20 mL， 混合溶液中 QA-DPA 的浓度为 0.15 mol/ L， 75加热回流 1h ； 反应完毕后， 在旋转蒸发仪上浓缩， 乙醚沉淀， 真空干燥。产率 65%。 0019 实施例 3 ： 8- 氨基喹啉 （720 mg, 5 mmol） 与氯乙酰氯 （282 mg, 2.5 mmol） 以摩尔比为 2:1 混 合后加入 CH2Cl2 100 mL， 混合溶液中 8- 氨基喹啉的。

26、浓度为 0.05 mol/L， 40反应 10 h ； 然 后加入二 （2- 吡啶甲基） 胺 （2 g， 10 mmol） ， 三乙胺 （333 mg， 3.3 mmol） ， 氮气保护下 80 油浴回流 6 h ； 反应结束后， 使用 330 mL 饱和盐水萃取洗涤， 水相使用 330 mL 二氯甲 烷萃取， 合并有机相， 无水硫酸钠干燥， 旋蒸出溶剂， 得红色油状物 ； 硅胶柱层析分离， 使用 乙酸乙酯洗脱， 得到淡黄色粘稠液体 0.76 g， 产率为 41 %。将配体 (0.76 g, 2 mmol) 和 MnAc2 4H2O(250 mg, 1 mmol)的乙醇溶液100 mL， 混合。

27、溶液中QA-DPA的浓度为0.02 mol/ L， 75加热回流 2h ； 反应完毕后， 在旋转蒸发仪上浓缩， 乙醚沉淀， 得褐色固体， 真空干燥。 产率 45%。 0020 实施例 4 ： 8- 氨基喹啉 （720 mg, 5 mmol） 与氯乙酰氯 （680 mg, 6 mmol） 以摩尔比为 1:1.2 混 合后加入 CH2Cl2 150 mL， 混合溶液中 8- 氨基喹啉的浓度为 0.033 mol/L， 40反应 8h ； 然 后加入二 （2-吡啶甲基） 胺 （650 mg， 3.3 mmol） ， 三乙胺 （170 mg， 1.65 mmol） ， 氮气保护下， 80油浴回流 16。

28、 h ； 反应结束后， 使用 330 mL 饱和盐水萃取洗涤， 水相使用 330 mL 二 氯甲烷萃取， 合并有机相， 无水硫酸钠干燥， 旋蒸出溶剂， 得红色油状物 ； 硅胶柱层析分离， 使用乙酸乙酯洗脱， 得到淡黄色粘稠液体 0.75 g， 产率为 55%。将配体 （750 mg, 2 mmol） 和 MnAc24H2O（750 mg, 3 mmol) 的乙醇溶液 60 mL， 混合溶液中 QA-DPA 的浓度为 0.033 mol/L， 75加热回流 3h ； 反应完毕后， 在旋转蒸发仪上浓缩， 乙醚沉淀， 得褐色固体， 真空 干燥， 产率 52%。 0021 实施例 5 ： 8- 氨基喹。

29、啉 （720 mg, 5 mmol） 与氯乙酰氯 （850 mg, 7.5 mmol） 以摩尔比为 1:1.5 混合后加入 CH2Cl2 120 mL， 混合溶液中 8- 氨基喹啉的浓度为 0.042 mol/L， 40反应 6h ； 然后加入二 （2-吡啶甲基） 胺 （792 mg， 4 mmol） ， 三乙胺 （270 mg， 2.67 mmol） ， 氮气保护下， 80油浴回流 12h ； 反应结束后， 使用 330 mL 饱和盐水萃取洗涤， 水相使用 330 mL 二 氯甲烷萃取， 合并有机相， 无水硫酸钠干燥， 旋蒸出溶剂， 得褐色油状物 ； 硅胶柱层析分离， 使用乙酸乙酯洗脱， 得。

30、到黄色粘稠液体 0.92 g， 产率为 60%。将配体 （920 mg, 2 mmol） 和 MnAc24H2O（800 mg, 3.2 mmol) 的乙醇溶液 40 mL， 混合溶液中 QA-DPA 的浓度为 0.05 mol/L， 75加热回流 4 h ； 反应完毕后， 在旋转蒸发仪上浓缩， 乙醚沉淀， 得褐色固体， 真空 干燥， 产率 57%。 0022 通过测定锰过氧化氢酶模拟物与过氧化氢作用过程中所产生的氧气的总量和速 度不同来测定配合物的过氧化氢酶活性。氧气的量的测定装置为自制装置 ： 将一根 25 mL 去掉橡皮管和玻璃尖嘴的碱式滴定管固定在铁架台上， 装满水， 并将滴定管接橡皮。

31、管一段 用滴管的橡胶乳头塞紧， 倒置在水槽里， 并调节水位到刻度的 25 mL 处。将长嘴滴管的前端 说 明 书 CN 103709199 A 7 5/5 页 8 弯曲 90 度， 另一端接上橡皮管， 将弯曲的一段插入倒置滴定管的下端， 接橡皮管的一段与 反应装置上带橡皮塞的弯玻璃管连接。通过间隔一定的时间来读取滴定管上水位置的刻 度， 来测定反应中生成氧气的体积。分别在乙腈溶液中和 Tris-HCl 缓冲溶液中 0和 37 条件下测定配合物的动力学曲线。不同浓度的过氧化氢溶液分别通过用乙腈或 Tris-HCl 缓冲溶液稀释 30% 浓度的过氧化氢溶液制备。 0023 实施例 6 ： 向 25。

32、 mL 圆底烧瓶中加入浓度为 0.34 mmol/L 的锰过氧化氢酶模拟物的乙腈溶液 5 mL， 置于37下。 强力搅拌10 min， 使溶液温度达到冰浴温度后向其中快速加入浓度为wt% = 30% 的过氧化氢溶液 0.2 mL， 每隔 0.5 min 记录产生氧气的体积。 0024 实施例 7 ： 向25 mL 圆底烧瓶中加入浓度为1 mmol/L的锰过氧化氢酶模拟物的Tris-HCl缓冲溶 液5 mL， 置于0下。 强力搅拌10 min， 使溶液温度达到一定温度后向其中快速加入不同浓 度的过氧化氢溶液 0.5 mL， 每隔 0.5 min 记录产生氧气的体积。 0025 实施例 8 ： 向。

33、25 mL 圆底烧瓶中加入浓度为1 mmol/L的锰过氧化氢酶模拟物的Tris-HCl缓冲溶 液 5 mL， 置于 37下。强力搅拌 10 min， 使溶液温度达到一定温度后向其中快速加入浓度 为wt% = 30%的过氧化氢溶液0.2 mL， 迅速塞上橡皮塞， 并将滴管弯曲部分快速插入滴定管 的下端。每隔 0.5 min 记录产生氧气的体积。 0026 实施例 9 ： 本发明制备的锰过氧化氢酶模拟物的抗肿瘤活性研究 ： 以实施例 4 得到的锰过氧化氢 酶模拟物为受试化合物。 0027 采用 MTT 法， 通过测定配合物对肝癌细胞 （HepG-2 cells） 的抑制率来研究配合物 的体外抗肿瘤。

34、活性。 KPF6和5-氟尿嘧啶用来作为细胞毒性的空白对照。 将HepG-2 细胞在 含 10% 热灭活的胎牛血清 （FCS） 的 RPMI1640 培养液中， 于 CO2培养箱 （37， 5%CO2、 饱和湿 度） 内连续培养。 取对数生长期细胞， 消化、 计数， 以2104/ml的密度接种于96孔培养板中， 每孔100 l。 培养 24 h后， 分别用浓度为1 mol/L， 5mol/L, 10mol/L , 30mol/ L , 50mol/L, 75mol/L 和 100mol/L 的配合物水溶液加入培养基中作用 24h。吸 取去上清液， 每孔加入100 mmol/L MTT (1mg/ml), 继续培养4h, 吸取上清液， 用酶标仪 在 570 nm 处测定吸光度值。 采用 IC50 计算软件求出半数抑制浓度 （IC50) 为 26.12。实 验结果显示该锰过氧化氢酶模拟物对肿瘤细表现出较好的抗癌活性， 这说明化合物可作为 一种低毒性的酶模拟物来抑制肿瘤生长， 可望运用于肿瘤的治疗。 说 明 书 CN 103709199 A 8 1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103709199 A 9 。