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一种比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法.pdf

  • 上传人:Y0****01
  • 文档编号:6163907
  • 上传时间:2019-05-15
  • 格式:PDF
  • 页数:12
  • 大小:1.53MB
  • 摘要
    申请专利号:

    CN201410109919.4

    申请日:

    2014.03.21

    公开号:

    CN103837626A

    公开日:

    2014.06.04

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情:

    授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/36申请日:20140321|||公开

    IPC分类号:

    G01N30/36; G01N30/02

    主分类号:

    G01N30/36

    申请人:

    武汉武药科技有限公司

    发明人:

    吴雪英; 乔春莲; 于艳春; 杨波; 耿海明

    地址:

    430074 湖北省武汉市东湖开发区光谷创业街6栋2楼

    优先权:

    专利代理机构:

    北京鼎佳达知识产权代理事务所(普通合伙) 11348

    代理人:

    侯蔚寰

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    内容摘要

    本发明属于医药技术领域,具体涉及一种比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法,检测方法为高效液相色谱法;本发明提供了一种检测方法,克服了比伐卢定不易从色谱柱上洗脱下来的缺点;本发明的技术方案特点是:以磷酸溶液为流动相A,甲醇为流动相B,其中,流动相A为0.05%~0.10%磷酸溶液,磷酸溶液要用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01~4.00;采用梯度洗脱的方式,该梯度洗脱的方式很容易将比伐卢定从色谱柱上洗脱下来。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种高效液相色谱法测定比伐卢定中三氟乙酸含量的方法,色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,其特征在于:流动相由流动相A、流动相B组成,磷酸溶液为流动相A,甲醇为流动相B,洗脱方式采用梯度洗脱。

    2.  根据权利要求1所述测定方法,其特征在于:梯度洗脱的方式,包括流动相浓度,洗脱时间如下表:


    3.  根据权利要求2所述测定方法,其特征在于:梯度洗脱的方式,包括流动相浓度,洗脱时间如下表:



    4.  根据权利要求1所述测定方法,其特征在于:流动相A为0.05%~0.10%磷酸溶液。

    5.  根据权利要求4所述测定方法,其特征在于:磷酸溶液要用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01~4.00。

    6.  根据权利要求1~5任一项所述的测定方法,比伐卢定中三氟乙酸含量的测定方法如下:
    精密称取三氟乙酸对照品适量,用流动相配制成每1ml中含1mg三氟乙酸的溶液,作为对照品溶液;精密称取比伐卢定适量,用流动相配制成每1ml中含比伐卢定10mg的溶液,作为供试品溶液;照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定;用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以0.05%~0.10%磷酸溶液(用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01~4.00)为流动相A,甲醇为流动相B,进行梯度洗脱,流速为0.8~1.5ml/min,柱温为25~35℃,检测波长为200~220nm,进样量为20μl,梯度洗脱;
    梯度洗脱的方式,包括流动相浓度,洗脱时间如下表:

    分别精密量取供试品溶液和对照品溶液,注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算,得到样品中三氟乙酸的含量。

    说明书

    说明书一种比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法
    技术领域:
    本发明属于医药技术领域,具体涉及一种高效液相色谱法测定比伐卢定中三氟乙酸含量的方法。
    背景技术:
    比伐卢定为新型抗凝药,抗凝成分是水蛭素衍生物(片段),系一合成20肽,相对分子量2180。本品为凝血酶直接的、特异的、可逆性抑制剂。无论凝血酶处于血循环中还是与血栓结合,本品均可与其催化位点和阴离子结合位点(又称底物识别位点)发生特异性结合,从而直接抑制凝血酶的活性。因凝血酶可水解本品多肽顺序中Arg3和Pro4之间的肽键,使本品失活,所以本品对凝血酶的抑制作用是可逆而短暂的,大大降低了临时抗凝带来的出血风险,使该药在高危患者中也得到了广泛的应用,取得了较好的临床应用效果。
    在比伐卢定的合成工艺中,为保护比伐卢定的氨基游离而遭受氧化而变质,最后一步是将比伐卢定制成三氟乙酸盐,以保证比伐卢定的质量。通过检测比伐卢定中三氟乙酸的含量,来保证其均已成盐(全部成盐后,三氟乙酸的理论含量为9.5%)。
    三氟乙酸的含量测定方法多采用气相色谱法,由于三氟乙酸的 极性大,酸性强,所以对气相色谱柱损伤大,分析成本高,且效果不很理想。而用氧瓶燃烧法测定氟的含量,操作繁琐且误差较大。也可以考虑用强酸型阳离子交换色谱柱测定三氟乙酸的含量,但也不是实验室常用手段。
    目前比伐卢定中三氟乙酸的含量测定已发表(高效液相色谱法测定比伐卢定中三氟乙酸含量,中国生化药物杂志,2010年第30卷第2期)的方法为HPLC法,具体如下:
    精密称取三氟乙酸对照品适量,用流动相配制成每1ml中含0.5mg三氟乙酸的溶液,作为对照品溶液;精密称取比伐卢定适量,用流动相配制成每1ml中含比伐卢定5mg的溶液,作为供试品溶液。照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。用十八烷基硅烷键合硅胶(C18柱)为填充剂,以0.07%磷酸溶液(pH3.0)-甲醇(98:2)为流动相;流速为1.0ml/min;柱温为30℃;检测波长为210nm。分别精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算,得到样品中三氟乙酸的含量。
    经研究发现,在实际操作过程中,上述方法存在不足:采用上述流动相无法将比伐卢定从C18柱上洗脱下来,虽多次进样尚未发现其对三氟乙酸测定存在干扰,但主峰未洗脱易使色谱柱污染而减少其寿命。
    发明内容:
    为了解决上述问题,本发明的技术方案是提供了一种检测方法,克服了比伐卢定不易从色谱柱上洗脱下来的缺点。本发明的技术方案特点是:以磷酸溶液为流动相A,甲醇为流动相B,其中,流动相A为0.05%~0.10%磷酸溶液,磷酸溶液要用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01~4.00;采用梯度洗脱的方式,该梯度洗脱的方式很容易将比伐卢定从色谱柱上洗脱下来。
    本发明的具体的梯度洗脱的方式,包括流动相浓度,洗脱时间如下表:

    其中优选梯度洗脱的方式,包括流动相浓度,洗脱时间如下表:


    本发明通过梯度洗脱的方式,使得比伐卢定能够从C18柱上洗脱,并且确保了三氟乙酸和比伐卢定的分离度符合要求,从而确保了比伐卢定原料的质量可控(结果见附图1-3)。
    本发明还对比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法进行了深入研究:
    1.色谱条件的选择
    (1)流动相
    我们通过实验比较了以0.07%磷酸溶液(pH3.0)-甲醇(98:2)为流动相和以0.05%~0.10%磷酸溶液(用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01~4.00)为流动相A,甲醇为流动相B,进行梯度洗脱的流动相测定样品的色谱图。以0.07%磷酸溶液(pH3.0)-甲醇(98:2)为流动相的样品色谱图,比伐卢定峰未洗脱出;而以0.05%~0.10%磷酸溶液(用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01~4.00)为流动相A,甲醇为流动相B,进行梯度洗脱的流动相测定样品的色谱图,基线平稳,三氟乙酸与比伐卢定完全分离,峰型对称,响应高(见图1和图2)
    (2)样品浓度
    为了能准确的检测出样品中所含三氟乙酸的量,我们分别比较了进样量为20μl浓度为5mg/ml,10mg/ml和15mg/ml的供试品的色谱图和三氟乙酸含量,实验结果表明,浓度为10mg/ml的样品测得三氟乙酸含量最高,且主峰峰型对称没有过载,因此确定比伐卢定中三氟乙酸含量测定样品浓度为10mg/ml。
    2.检测条件的验证
    (1)专属性
    取比伐卢定样品约100mg,加流动相溶解并稀释制成浓度为10mg/ml的溶液,同时向供试液中加含量占5%的三氟乙酸,取20μl注入色谱仪,记录色谱图。结果表明,在此检测条件下,样品中的三氟乙酸可以和主成分达到完全分离,专属性强。
    (2)检测限
    精密称取三氟乙酸对照品适量,加流动相溶解,并经多步稀释后,作为供试液,取20μl注入色谱仪,记录色谱图,到峰高为基线噪音的三倍,测得三氟乙酸最小检出浓度为3.97μg/ml。
    (3)线性
    精密称取三氟乙酸对照品适量,加流动相溶解,并分别稀释制成198.4μg/ml,297.6μg/ml,396.8μg/ml,496.0μg/ml,992.0μg/ml的溶液。各取20μl注入色谱仪,计算线性和相关系数。该方法的线性回归方程为Y=557.0X–4783,r=0.9999,线性范围为198.4μg/ml~992.0μg/ml。
    (4)回收率
    用加样回收法,精密称取供试品100mg至10ml量瓶,流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,作为回收率空白溶液;另精密量取三氟乙酸溶液(含三氟乙酸10mg/ml)0.8ml,1.0ml,1.2ml各3份,分别置10ml量瓶中,空白溶液稀释至刻度,摇匀,作为回收率测定溶液。分别精密量取对照品溶液、空白溶液和回收率测定溶液各20μl,注入色谱仪,并计算回收率。该方法的平均回收率为99.9%,RSD为0.41%。
    本发明比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法如下:
    精密称取三氟乙酸对照品适量,用流动相配制成每1ml中含1mg三氟乙酸的溶液,作为对照品溶液;精密称取比伐卢定适量,用流动相配制成每1ml中含比伐卢定10mg的溶液,作为供试品溶液。照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以0.05%~0.10%磷酸溶液(用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01~4.00)为流动相A,甲醇为流动相B,进行梯度洗脱;流速为0.8~1.5ml/min;柱温为25~35℃;检测波长为200~220nm,进样量为20μl。梯度洗脱。
    梯度洗脱的方式,包括流动相浓度,洗脱时间如下表:


    分别精密量取供试品溶液和对照品溶液,注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算,得到样品中三氟乙酸的含量。
    附图说明:
    图1为以磷酸溶液-甲醇为流动相等度洗脱的色谱图,1、三氟乙酸;图2为以磷酸溶液-甲醇为流动相梯度洗脱的色谱图,1、三氟乙酸,2、比伐卢定;
    图3为以磷酸溶液-甲醇为流动相梯度洗脱的空白溶剂的色谱图
    具体实施方式:
    下面通过具体实施例的方式对本发明做进一步详述,但不应理解为是对本发明保护范围的限制,凡基于上述技术思想,利用本领域普通技术知识和惯用手段所做的修改、替换、变更均属于本发明的范围。
    实施例1:比伐卢定中三氟乙酸的含量测定之一:
    1、实验仪器及色谱条件
    戴安U3000高效液相色谱仪,伊力特C18色谱柱(5μm, 4.6*200mm),以0.05%磷酸溶液(用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01)为流动相A,甲醇为流动相B,进行梯度洗脱;流速为0.8~1.5ml/min;柱温为25~35℃;检测波长为200~220nm,梯度洗脱程序如下:

    2、样品的测定
    精密称取三氟乙酸对照品适量,用流动相(流动相A为0.05%磷酸溶液,磷酸溶液要用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01,流动相B为甲醇,流动相A:B为95:5V/V)配制成每1ml中含1mg三氟乙酸的溶液,作为对照品溶液;精密称取比伐卢定适量,用上述相同的流动相配制成每1ml中含比伐卢定10mg的溶液,作为供试品溶液。照比伐卢定中三氟乙酸含量测定项下的色谱条件,精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算,得到样品中三氟乙酸的含量(见图2)。
    实施例2:比伐卢定中三氟乙酸的含量测定之二:
    1、实验仪器及色谱条件
    戴安U3000高效液相色谱仪,伊力特C18色谱柱(5μm,4.6*200mm),以0.08%磷酸溶液(用10%氢氧化钠溶液调pH值至4.00)为流动相A,甲醇为流动相B,进行梯度洗脱;流速为0.8~1.5ml/min;柱温为25~35℃;检测波长为200~220nm,梯度洗脱的方式,包括流动相浓度,洗脱时间如下表:

    2、样品的测定
    精密称取三氟乙酸对照品适量,用流动相(流动相A为0.08%磷酸溶液,磷酸溶液要用10%氢氧化钠溶液调pH值至4.00,流动相B为甲醇,流动相A:B为92:8V/V)配制成每1ml中含1mg三 氟乙酸的溶液,作为对照品溶液;精密称取比伐卢定适量,用上述相同的流动相配制成每1ml中含比伐卢定10mg的溶液,作为供试品溶液。照比伐卢定中三氟乙酸含量测定项下的色谱条件,精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算,得到样品中三氟乙酸的含量。
    实施例3:比伐卢定中三氟乙酸的含量测定之三:
    1、实验仪器及色谱条件
    戴安U3000高效液相色谱仪,伊力特C18色谱柱(5μm,4.6*200mm),以0.10%磷酸溶液(用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.51)为流动相A,甲醇为流动相B,进行梯度洗脱;流速为0.8~1.5ml/min;柱温为25~35℃;检测波长为200~220nm,梯度洗脱程序如下:

    2、样品的测定
    精密称取三氟乙酸对照品适量,用流动相(流动相A为0.10%磷酸溶液,磷酸溶液要用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.51,流动相B为甲醇,流动相A:B为98:2V/V)配制成每1ml中含1mg三氟乙酸的溶液,作为对照品溶液;精密称取比伐卢定适量,用上述相同的流动相配制成每1ml中含比伐卢定10mg的溶液,作为供试品溶液。照比伐卢定中三氟乙酸含量测定项下的色谱条件,精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算,得到样品中三氟乙酸的含量。

    关 键  词:
    一种 伐卢定中三氟 乙酸 含量 测定 方法
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