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1、(10)申请公布号 CN 103837626 A (43)申请公布日 2014.06.04 CN 103837626 A (21)申请号 201410109919.4 (22)申请日 2014.03.21 G01N 30/36(2006.01) G01N 30/02(2006.01) (71)申请人 武汉武药科技有限公司 地址 430074 湖北省武汉市东湖开发区光谷 创业街 6 栋 2 楼 (72)发明人 吴雪英 乔春莲 于艳春 杨波 耿海明 (74)专利代理机构 北京鼎佳达知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 11348 代理人 侯蔚寰 (54) 发明名称 一种比伐卢定中三氟乙酸的含量测。
2、定方法 (57) 摘要 本发明属于医药技术领域, 具体涉及一种比 伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法, 检测方法 为高效液相色谱法 ; 本发明提供了一种检测方 法, 克服了比伐卢定不易从色谱柱上洗脱下来 的缺点 ; 本发明的技术方案特点是 : 以磷酸溶液 为流动相 A, 甲醇为流动相 B, 其中, 流动相 A 为 0.05% 0.10% 磷酸溶液, 磷酸溶液要用 10% 氢氧 化钠溶液调 pH 值至 3.01 4.00 ; 采用梯度洗脱 的方式, 该梯度洗脱的方式很容易将比伐卢定从 色谱柱上洗脱下来。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国。
3、国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103837626 A CN 103837626 A 1/2 页 2 1. 一种高效液相色谱法测定比伐卢定中三氟乙酸含量的方法, 色谱柱采用十八烷基硅 烷键合硅胶为填充剂, 其特征在于 : 流动相由流动相A、 流动相B组成, 磷酸溶液为流动相A, 甲醇为流动相 B, 洗脱方式采用梯度洗脱。 2. 根据权利要求 1 所述测定方法, 其特征在于 : 梯度洗脱的方式, 包括流动相浓度, 洗 脱时间如下表 : 3. 根据权利要求 2 所述测定方法, 其特征在于 : 梯度洗脱的方式, 包括流动相浓度, 。
4、洗 脱时间如下表 : 4. 根据权利要求 1 所述测定方法, 其特征在于 : 流动相 A 为 0.05% 0.10% 磷酸溶液。 5. 根据权利要求 4 所述测定方法, 其特征在于 : 磷酸溶液要用 10% 氢氧化钠溶液调 pH 权 利 要 求 书 CN 103837626 A 2 2/2 页 3 值至 3.01 4.00。 6. 根据权利要求 1 5 任一项所述的测定方法, 比伐卢定中三氟乙酸含量的测定方法 如下 : 精密称取三氟乙酸对照品适量, 用流动相配制成每1ml中含1mg三氟乙酸的溶液, 作为 对照品溶液 ; 精密称取比伐卢定适量, 用流动相配制成每1ml中含比伐卢定10mg的溶液,。
5、 作 为供试品溶液 ; 照高效液相色谱法 (中国药典 2010 年版二部附录 V D) 测定 ; 用十八烷基硅 烷键合硅胶为填充剂, 以 0.05% 0.10% 磷酸溶液 (用 10% 氢氧化钠溶液调 pH 值至 3.01 4.00) 为流动相 A, 甲醇为流动相 B, 进行梯度洗脱, 流速为 0.8 1.5ml/min, 柱温为 25 35, 检测波长为 200 220nm, 进样量为 20l, 梯度洗脱 ; 梯度洗脱的方式, 包括流动相浓度, 洗脱时间如下表 : 分别精密量取供试品溶液和对照品溶液, 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按外标法以峰 面积计算, 得到样品中三氟乙酸的含量。 权 。
6、利 要 求 书 CN 103837626 A 3 1/7 页 4 一种比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法 技术领域 : 0001 本发明属于医药技术领域, 具体涉及一种高效液相色谱法测定比伐卢定中三氟乙 酸含量的方法。 背景技术 : 0002 比伐卢定为新型抗凝药, 抗凝成分是水蛭素衍生物 (片段) , 系一合成20肽, 相对分 子量 2180。本品为凝血酶直接的、 特异的、 可逆性抑制剂。无论凝血酶处于血循环中还是 与血栓结合, 本品均可与其催化位点和阴离子结合位点 (又称底物识别位点) 发生特异性结 合, 从而直接抑制凝血酶的活性。因凝血酶可水解本品多肽顺序中 Arg3 和 Pro4 之间的。
7、肽 键, 使本品失活, 所以本品对凝血酶的抑制作用是可逆而短暂的, 大大降低了临时抗凝带来 的出血风险, 使该药在高危患者中也得到了广泛的应用, 取得了较好的临床应用效果。 0003 在比伐卢定的合成工艺中, 为保护比伐卢定的氨基游离而遭受氧化而变质, 最后 一步是将比伐卢定制成三氟乙酸盐, 以保证比伐卢定的质量。通过检测比伐卢定中三氟乙 酸的含量, 来保证其均已成盐 (全部成盐后, 三氟乙酸的理论含量为 9.5%) 。 0004 三氟乙酸的含量测定方法多采用气相色谱法, 由于三氟乙酸的极性大, 酸性强, 所 以对气相色谱柱损伤大, 分析成本高, 且效果不很理想。而用氧瓶燃烧法测定氟的含量, 。
8、操 作繁琐且误差较大。也可以考虑用强酸型阳离子交换色谱柱测定三氟乙酸的含量, 但也不 是实验室常用手段。 0005 目前比伐卢定中三氟乙酸的含量测定已发表 (高效液相色谱法测定比伐卢定中三 氟乙酸含量, 中国生化药物杂志, 2010 年第 30 卷第 2 期) 的方法为 HPLC 法, 具体如下 : 0006 精密称取三氟乙酸对照品适量, 用流动相配制成每 1ml 中含 0.5mg 三氟乙酸的溶 液, 作为对照品溶液 ; 精密称取比伐卢定适量, 用流动相配制成每 1ml 中含比伐卢定 5mg 的 溶液, 作为供试品溶液。照高效液相色谱法 (中国药典 2010 年版二部附录 V D) 测定。用 。
9、十八烷基硅烷键合硅胶 (C18 柱) 为填充剂, 以 0.07% 磷酸溶液 (pH3.0) - 甲醇 (98:2) 为流 动相 ; 流速为 1.0ml/min ; 柱温为 30 ; 检测波长为 210nm。分别精密量取供试品溶液和对 照品溶液各 20l, 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按外标法以峰面积计算, 得到样品中三氟 乙酸的含量。 0007 经研究发现, 在实际操作过程中, 上述方法存在不足 : 采用上述流动相无法将比伐 卢定从 C18 柱上洗脱下来, 虽多次进样尚未发现其对三氟乙酸测定存在干扰, 但主峰未洗 脱易使色谱柱污染而减少其寿命。 发明内容 : 0008 为了解决上述问题, 。
10、本发明的技术方案是提供了一种检测方法, 克服了比伐卢定 不易从色谱柱上洗脱下来的缺点。本发明的技术方案特点是 : 以磷酸溶液为流动相 A, 甲醇 为流动相B, 其中, 流动相A为0.05%0.10%磷酸溶液, 磷酸溶液要用10%氢氧化钠溶液调 pH值至3.014.00 ; 采用梯度洗脱的方式, 该梯度洗脱的方式很容易将比伐卢定从色谱柱 说 明 书 CN 103837626 A 4 2/7 页 5 上洗脱下来。 0009 本发明的具体的梯度洗脱的方式, 包括流动相浓度, 洗脱时间如下表 : 0010 0011 其中优选梯度洗脱的方式, 包括流动相浓度, 洗脱时间如下表 : 0012 0013 0。
11、014 本发明通过梯度洗脱的方式, 使得比伐卢定能够从 C18 柱上洗脱, 并且确保了三 氟乙酸和比伐卢定的分离度符合要求, 从而确保了比伐卢定原料的质量可控 (结果见附图 1-3) 。 0015 本发明还对比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法进行了深入研究 : 0016 1. 色谱条件的选择 0017 (1) 流动相 说 明 书 CN 103837626 A 5 3/7 页 6 0018 我们通过实验比较了以 0.07% 磷酸溶液 (pH3.0) - 甲醇 (98:2)为流动相和以 0.05% 0.10% 磷酸溶液 (用 10% 氢氧化钠溶液调 pH 值至 3.01 4.00) 为流动相 A, 。
12、甲醇 为流动相 B, 进行梯度洗脱的流动相测定样品的色谱图。以 0.07% 磷酸溶液 (pH3.0) - 甲醇 (98:2) 为流动相的样品色谱图, 比伐卢定峰未洗脱出 ; 而以 0.05% 0.10% 磷酸溶液 (用 10% 氢氧化钠溶液调 pH 值至 3.01 4.00) 为流动相 A, 甲醇为流动相 B, 进行梯度洗脱的流 动相测定样品的色谱图, 基线平稳, 三氟乙酸与比伐卢定完全分离, 峰型对称, 响应高 (见图 1 和图 2) 0019 (2) 样品浓度 0020 为了能准确的检测出样品中所含三氟乙酸的量, 我们分别比较了进样量为 20l 浓度为 5mg/ml, 10mg/ml 和 。
13、15mg/ml 的供试品的色谱图和三氟乙酸含量, 实验结果表明, 浓 度为 10mg/ml 的样品测得三氟乙酸含量最高, 且主峰峰型对称没有过载, 因此确定比伐卢 定中三氟乙酸含量测定样品浓度为 10mg/ml。 0021 2. 检测条件的验证 0022 (1) 专属性 0023 取比伐卢定样品约 100mg, 加流动相溶解并稀释制成浓度为 10mg/ml 的溶液, 同时 向供试液中加含量占 5% 的三氟乙酸, 取 20l 注入色谱仪, 记录色谱图。结果表明, 在此检 测条件下, 样品中的三氟乙酸可以和主成分达到完全分离, 专属性强。 0024 (2) 检测限 0025 精密称取三氟乙酸对照品。
14、适量, 加流动相溶解, 并经多步稀释后, 作为供试液, 取 20l 注入色谱仪, 记录色谱图, 到峰高为基线噪音的三倍, 测得三氟乙酸最小检出浓度为 3.97g/ml。 0026 (3) 线性 0027 精密称取三氟乙酸对照品适量, 加流动相溶解, 并分别稀释制成 198.4g/ml, 297.6g/ml, 396.8g/ml, 496.0g/ml, 992.0g/ml 的溶液。各取 20l 注入色谱仪, 计算线性和相关系数。该方法的线性回归方程为 Y=557.0X4783, r=0.9999, 线性范围为 198.4g/ml 992.0g/ml。 0028 (4) 回收率 0029 用加样回。
15、收法, 精密称取供试品100mg至10ml量瓶, 流动相溶解并稀释至刻度, 摇 匀, 作为回收率空白溶液 ; 另精密量取三氟乙酸溶液 (含三氟乙酸 10mg/ml) 0.8ml, 1.0ml, 1.2ml 各 3 份, 分别置 10ml 量瓶中, 空白溶液稀释至刻度, 摇匀, 作为回收率测定溶液。分 别精密量取对照品溶液、 空白溶液和回收率测定溶液各 20l, 注入色谱仪, 并计算回收率。 该方法的平均回收率为 99.9%, RSD 为 0.41%。 0030 本发明比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法如下 : 0031 精密称取三氟乙酸对照品适量, 用流动相配制成每1ml中含1mg三氟乙酸的溶液。
16、, 作为对照品溶液 ; 精密称取比伐卢定适量, 用流动相配制成每 1ml 中含比伐卢定 10mg 的溶 液, 作为供试品溶液。照高效液相色谱法 (中国药典 2010 年版二部附录 V D) 测定。用十八 烷基硅烷键合硅胶为填充剂, 以 0.05% 0.10% 磷酸溶液 (用 10% 氢氧化钠溶液调 pH 值至 3.01 4.00) 为流动相 A, 甲醇为流动相 B, 进行梯度洗脱 ; 流速为 0.8 1.5ml/min ; 柱温 为 25 35 ; 检测波长为 200 220nm, 进样量为 20l。梯度洗脱。 说 明 书 CN 103837626 A 6 4/7 页 7 0032 梯度洗脱的。
17、方式, 包括流动相浓度, 洗脱时间如下表 : 0033 0034 0035 分别精密量取供试品溶液和对照品溶液, 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按外标法 以峰面积计算, 得到样品中三氟乙酸的含量。 附图说明 : 0036 图1为以磷酸溶液-甲醇为流动相等度洗脱的色谱图, 1、 三氟乙酸 ; 图2为以磷酸 溶液 - 甲醇为流动相梯度洗脱的色谱图, 1、 三氟乙酸, 2、 比伐卢定 ; 0037 图 3 为以磷酸溶液 - 甲醇为流动相梯度洗脱的空白溶剂的色谱图 具体实施方式 : 0038 下面通过具体实施例的方式对本发明做进一步详述, 但不应理解为是对本发明保 护范围的限制, 凡基于上述技术思想。
18、, 利用本领域普通技术知识和惯用手段所做的修改、 替 换、 变更均属于本发明的范围。 0039 实施例 1 : 比伐卢定中三氟乙酸的含量测定之一 : 0040 1、 实验仪器及色谱条件 0041 戴安U3000高效液相色谱仪, 伊力特C18色谱柱 (5m, 4.6*200mm) , 以0.05%磷酸 溶液 (用 10% 氢氧化钠溶液调 pH 值至 3.01) 为流动相 A, 甲醇为流动相 B, 进行梯度洗脱 ; 流 速为 0.8 1.5ml/min ; 柱温为 25 35 ; 检测波长为 200 220nm, 梯度洗脱程序如下 : 说 明 书 CN 103837626 A 7 5/7 页 8 。
19、0042 0043 2、 样品的测定 0044 精密称取三氟乙酸对照品适量, 用流动相 (流动相 A 为 0.05% 磷酸溶液, 磷酸溶液 要用 10% 氢氧化钠溶液调 pH 值至 3.01, 流动相 B 为甲醇, 流动相 A:B 为 95:5V/V) 配制成 每 1ml 中含 1mg 三氟乙酸的溶液, 作为对照品溶液 ; 精密称取比伐卢定适量, 用上述相同的 流动相配制成每 1ml 中含比伐卢定 10mg 的溶液, 作为供试品溶液。照比伐卢定中三氟乙酸 含量测定项下的色谱条件, 精密量取供试品溶液和对照品溶液各 20l 分别注入液相色谱 仪, 记录色谱图, 按外标法以峰面积计算, 得到样品中。
20、三氟乙酸的含量 (见图 2) 。 0045 实施例 2 : 比伐卢定中三氟乙酸的含量测定之二 : 0046 1、 实验仪器及色谱条件 0047 戴安U3000高效液相色谱仪, 伊力特C18色谱柱 (5m, 4.6*200mm) , 以0.08%磷酸 溶液 (用 10% 氢氧化钠溶液调 pH 值至 4.00) 为流动相 A, 甲醇为流动相 B, 进行梯度洗脱 ; 流 速为 0.8 1.5ml/min ; 柱温为 25 35 ; 检测波长为 200 220nm, 梯度洗脱的方式, 包 括流动相浓度, 洗脱时间如下表 : 说 明 书 CN 103837626 A 8 6/7 页 9 0048 004。
21、9 2、 样品的测定 0050 精密称取三氟乙酸对照品适量, 用流动相 (流动相 A 为 0.08% 磷酸溶液, 磷酸溶液 要用 10% 氢氧化钠溶液调 pH 值至 4.00, 流动相 B 为甲醇, 流动相 A : B 为 92:8V/V) 配制成 每 1ml 中含 1mg 三氟乙酸的溶液, 作为对照品溶液 ; 精密称取比伐卢定适量, 用上述相同的 流动相配制成每 1ml 中含比伐卢定 10mg 的溶液, 作为供试品溶液。照比伐卢定中三氟乙酸 含量测定项下的色谱条件, 精密量取供试品溶液和对照品溶液各 20l 分别注入液相色谱 仪, 记录色谱图, 按外标法以峰面积计算, 得到样品中三氟乙酸的含。
22、量。 0051 实施例 3 : 比伐卢定中三氟乙酸的含量测定之三 : 0052 1、 实验仪器及色谱条件 0053 戴安U3000高效液相色谱仪, 伊力特C18色谱柱 (5m, 4.6*200mm) , 以0.10%磷酸 溶液 (用 10% 氢氧化钠溶液调 pH 值至 3.51) 为流动相 A, 甲醇为流动相 B, 进行梯度洗脱 ; 流 速为 0.8 1.5ml/min ; 柱温为 25 35 ; 检测波长为 200 220nm, 梯度洗脱程序如下 : 说 明 书 CN 103837626 A 9 7/7 页 10 0054 0055 2、 样品的测定 0056 精密称取三氟乙酸对照品适量, 。
23、用流动相 (流动相 A 为 0.10% 磷酸溶液, 磷酸溶液 要用 10% 氢氧化钠溶液调 pH 值至 3.51, 流动相 B 为甲醇, 流动相 A:B 为 98:2V/V) 配制成 每 1ml 中含 1mg 三氟乙酸的溶液, 作为对照品溶液 ; 精密称取比伐卢定适量, 用上述相同的 流动相配制成每 1ml 中含比伐卢定 10mg 的溶液, 作为供试品溶液。照比伐卢定中三氟乙酸 含量测定项下的色谱条件, 精密量取供试品溶液和对照品溶液各 20l 分别注入液相色谱 仪, 记录色谱图, 按外标法以峰面积计算, 得到样品中三氟乙酸的含量。 说 明 书 CN 103837626 A 10 1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103837626 A 11 2/2 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 103837626 A 12 。