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1、(10)申请公布号 CN 103837673 A (43)申请公布日 2014.06.04 CN 103837673 A (21)申请号 201410098657.6 (22)申请日 2014.03.18 G01N 33/50(2006.01) G01N 1/38(2006.01) (71)申请人 张嵩 地址 330029 江西省南昌市高新技术开发区 南京东路1515 号 108 栋 1 单元2301 室 (72)发明人 张嵩 (74)专利代理机构 北京市合德专利事务所 11244 代理人 王文会 刘榜美 (54) 发明名称 一种检测盐酸溴己新原料的细菌内毒素含量 的方法 (57) 摘要 本发。
2、明的目的是提供一种灵敏、 可靠的方法， 能快速检测出盐酸溴己新原料中细菌内毒素的含 量。方法具体操作如下 ： 取盐酸溴己新粉末， 用 DMSO( 二甲基亚砜 ) 溶解， 进行预干扰实验， 找出 最大稀释倍数 ； 按找出的最大稀释倍数 1600 倍， 制备盐酸溴己新供试液， 与两个不同厂家的灵敏 度为0.25EUml的鲎试剂进行干扰实验， 最终确 认是否存在干扰因素的影响， 确认细菌内毒素的 限度值 ； 按照无干扰时的最大有效稀释倍数稀释 盐酸溴己新溶液， 再进行细菌内毒素检查。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申。
3、请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103837673 A CN 103837673 A 1/1 页 2 1. 一种检测盐酸溴己新原料的细菌内毒素含量的方法， 其特征在于先通过预干扰试验 找出最大稀释倍数 ； 再按最大稀释倍数制备供试液进行干扰试验， 验证确认有无干扰 ： 最 大稀释倍数为 1600 倍 ； 盐酸溴己新内毒素限值为 10EU mg。 2. 权利要求 1 所述的检验方法， 其特征在于盐酸溴己新原料用 DMSO( 二甲基亚砜 ) 溶 解。 3. 如权利要求 1 所述的检验方法， 其特征在于盐酸溴己新的浓度为 1 20mg ml， 最 佳为 10mg ml。 4。
4、. 如权利要求 1 所述的检验方法， 采用如下方法操作 ： 1) 鲎试剂灵敏度复核实验， 按照 中华人民共和国药典 二部附录细菌内毒素检查法规 定， 进行鲎试剂的标示灵敏度复核 ； 2) 预干扰实验 ： 取盐酸溴己新粉末， 用 DMSO( 二甲基亚砜 ) 溶解、 制备成浓度为 1 20mgml的盐酸溴己新溶液， 再用细菌内毒素检查用水分别稀释至200倍、 400倍、 800倍、 1600 倍、 3200 倍， 将此系列浓度溶液记为 A ； 在上述试验液中加入细菌内毒素标准溶液， 使 每一浓度的实验液中均含有2(为所用鲎试剂的标示灵敏度)浓度的细菌内毒素， 记此 系列溶液为 B ； 取灵敏度为 。
5、0.25EU ml 的两个不同厂家的鲎试剂， 分别与上述 A 和 B 进行 反应， 每一浓度重复两管， 并设阳性和阴性对照， 进行预干扰试验， 找出最大稀释倍数 ； 3) 干扰实验 ： 再按找出的最大稀释倍数， 制备盐酸溴己新供试液， 与两个不同厂家的 灵敏度为0.25EUml的鲎试剂进行干扰实验， 最终确认是否存在干扰因素的影响， 确认细 菌内毒素的限度值 ； 4) 细菌内毒素检查 ： 按照无干扰时的最大有效稀释倍数稀释盐酸溴己新溶液， 再进行 细菌内毒素检查。 权 利 要 求 书 CN 103837673 A 2 1/5 页 3 一种检测盐酸溴己新原料的细菌内毒素含量的方法 技术领域 00。
6、01 本发明属于微生物检验领域， 涉及一种药物原料盐酸溴己新细菌内毒素检测方 法， 也就是检测盐酸溴己新原料中细菌内毒素含量的方法。 背景技术 0002 盐酸溴己新是一种粘痰溶解剂， 可直接作用于支气管腺体， 促使粘液分泌细胞的 溶酶体释出， 使痰中的粘多糖纤维分化裂解， 使痰液稀释， 易于咳出。临床上主要用于急性 及慢性支气管炎、 哮喘、 支气管扩张、 肺气肿， 尤适用于白色粘痰咳出困难者及因痰液广泛 阻塞小支气管引起的危重急症等。而细菌内毒素是一种能引起人体发热、 白细胞减少等一 系列生理反应的物质。盐酸溴己新作为注射剂药物的原料时， 应进行细菌内毒素含量的检 查控制。目前国内外没有针对盐。
7、酸溴己新原料进行细菌内毒素检查的文献报道。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种灵敏、 可靠的方法， 能快速检测出盐酸溴己新原料中细 菌内毒素的含量。 0004 本发明的盐酸溴己新原料的细菌内毒素检查方法是 ： 取盐酸溴己新， 用 DMSO( 二 甲基亚砜 ) 溶解、 制备成浓度为 10mg ml 的盐酸溴己新溶液， 再用细菌内毒素检查用水分 别稀释至200、 400、 800、 1600和3200倍， 将此系列浓度溶液记为A。 同时在上述试验液中加 入细菌内毒素标准溶液， 使每一浓度的实验液中均含有 2( 为所用鲎试剂的标示灵敏 度 ) 浓度的细菌内毒素， 记此系列溶液为 B。取灵敏度。
8、为 0.25EU ml 的两个不同厂家的鲎 试剂， 分别与上述A和B进行反应， 每一浓度重复两管， 并设阳性和阴性对照， 进行预干扰试 验， 找出最大稀释倍数。再按找出的最大稀释倍数， 制备盐酸溴己新供试液。按 中华人民 共和国药典 二部附录中的 “细菌内毒素检查方法” ， 与两个不同厂家的灵敏度为 0.25EU ml 的鲎试剂进行干扰实验， 最终确认是否存在干扰因素的影响， 确认细菌内毒素的限度值 ； 将盐酸溴己新溶液用 DMSO( 二甲基亚砜 ) 稀释 1600 倍， 作为供试品溶液， 同时取上述供试 品溶液， 加入细菌内毒素标准溶液， 使其含有 2( 为所用鲎试剂的标示灵敏度 ) 浓度的。
9、 细菌内毒素， 作为阳性对照， 分别加入灵敏度为0.25EUml的鲎试剂， 按照 中华人民共和 国药典 二部附录细菌内毒素检查法规定， 进行盐酸溴己新原料细菌内毒素检查， 根据鲎试 剂的反应结果， 判断内毒素是否符合规定。 0005 本发明有如下优点 ： 0006 1、 可以快速、 准确地检测出盐酸溴己新原料中的细菌内毒素的含量。 0007 2、 通过预干扰试验确定最大稀释倍数， 再进行干扰试验可以降低检验成本。 具体实施方式 0008 (1)、 限值的确定 0009 公式 ： L=K M 说 明 书 CN 103837673 A 3 2/5 页 4 0010 根据盐酸溴己新说明书 ：“肌肉注。
10、射或静脉注射。一次 4mg， 一日 8 12mg。静 脉注射时用 0.9氯化钠注射液或 5葡萄糖注射液稀释后使用。 ” 确定人用最大剂量为 12mg h。K ： 为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量， 以 EU/kg hr 表示， 注射 剂 K=5EU kg hr。 0011 0012 考虑到在实际使用时， 盐酸溴己新会被溶解到大输液中， 而大输液本身也含有内 毒素， 为保证联合用药的安全， 将盐酸溴己新内毒素限值进一步严格， 定为 10EU mg。 0013 (2)、 试剂 0014 a、 盐酸溴己新原料药 0015 中国医学科学院药物研究所提供 0016 规格 ： 1g/ 瓶 批号 。
11、： 100401、 100402、 100403 0017 b、 鲎试剂 0018 湛江安度斯生物有限公司 0019 规格 ： 0.1ml 批号 ： 1005062 灵敏度 ： 0.25EU ml 0020 湛江安度斯生物有限公司 0021 规格 ： 0.1ml 批号 ： 0810222 灵敏度 ： 0.06EU ml 0022 湛江博康海洋生物有限公司 0023 规格 ： 0.1ml 批号 ： 1004131 灵敏度 ： 0.25EU ml 0024 c、 细菌内毒素国家标准品 0025 中国药品生物制品检定所 0026 规格 ： 1ml 批号 ： 150600-200707 效价 ： 10。
12、000EU 支 0027 d、 细菌内毒素检查用水 0028 中国药品生物制品检定所 0029 规格 ： 10ml 批号 ： 2010-1 0030 (3)、 鲎试剂灵敏度复核实验 0031 按照 中华人民共和国药典 二部附录细菌内毒素检查法规定， 进行鲎试剂的标示 灵敏度复核， 结果见下表所示。 0032 鲎试剂灵敏度复核 0033 0034 3 批鲎试剂经用细菌内毒素国家标准品检查 c与 一致， 结果均符合规定。 0035 (4)、 干扰实验预实验 0036 a、 盐酸溴己新有效稀释倍数 (MVD) 的计算 说 明 书 CN 103837673 A 4 3/5 页 5 0037 公式 MV。
13、D=LC 0038 其中 L 为盐酸溴己新的细菌内毒素限值 10EU mg， C 为盐酸溴己新配置成溶液的 浓度， 盐酸溴己新原料不溶于水， 使用DMSO溶解、 制备成10mg/m1， 为鲎试剂标示灵敏度， 目前市售鲎试剂灵敏度 通常在 0.5 0.03EU ml 0039 则盐酸溴己新对应最大有效稀释倍数为 ： 0040 MVD0.5=10EU mg10mg ml0.5EU ml=200 倍 0041 MVD0.25=10EU mg10mg ml0.25EU ml=400 倍 0042 MVD0.125=10EU mg10mg ml0.125EU ml=800 倍 0043 MVD0.06=。
14、10EU mg10mg ml0.06EU ml 1600 倍 0044 MVD0.03=10EU mg10mg ml0.03EU ml=3200 倍。 0045 b、 实验操作 0046 取盐酸溴己新， 用 DMSO 溶解、 制备成浓度为 10mg ml 的盐酸溴己新溶液， 再用细 菌内毒素检查用水分别稀释至200、 400、 800、 1600倍、 3200倍， 将此系列浓度溶液记为NPC。 同时在上述试验液中加入细菌内毒素标准溶液， 使每一浓度的实验液中均含有 2( 为 所用鲎试剂的标示灵敏度 ) 浓度的细菌内毒素， 记此系列溶液为 PPC。 0047 取灵敏度为 0.25EU ml 的两。
15、个不同厂家的鲎试剂， 分别与上述 PPC 和 NPC 进行 反应， 每一浓度重复两管， 并设阳性和阴性对照。结果见下表 ： 0048 盐酸溴己新干扰预试验 0049 ( 湛江安度斯生物有限公司 lotNo.1005062， =0.25EU ml) 0050 0051 盐酸溴己新干扰预试验 0052 ( 湛江博康海洋生物有限公司 lotNo.1004131， =0.25EU m1) 0053 说 明 书 CN 103837673 A 5 4/5 页 6 0054 由以上干扰实验预实验结果可以初步了解 ： 此 3 批样品对两个厂家的鲎试剂在稀 释至灵敏度为 0.06EU ml 鲎试剂对应的 MVD。
16、 ： 1600 倍 ( 浓度为 0.00625mg/ml) 时即无干 扰作用。 0055 (5)、 正式干扰试验 0056 为了最终确认是否存在干扰因素的影响， 进行以下正式干扰实验。 0057 取盐酸溴己新， 用DMSO溶解、 制备成浓度为10mg/ml的盐酸溴己新溶液， 用细菌内 毒素检查用水稀释至 1600 倍， 按 中华人民共和国药典 二部附录中的 “细菌内毒素检查供 试品干扰试验项” ， 使用灵敏度为 0.25EU ml 的鲎试剂进行实验， 测定结果见下表 ： 0058 盐酸溴己新干扰试验 0059 ( 湛江安度斯生物有限公司 lotNo.1005062， =0.25EU ml) 0。
17、060 0061 盐酸溴己新干扰试验 0062 ( 湛江博康海洋生物有限公司 lot No.1004131， =0.25EU ml) 0063 0064 正式干扰试验结果表明 ： 此批样品对两个厂家鲎试剂的 ES Et在 0.5 2.0 范 围之内， 确认在 1600 倍稀释 ( 浓度为 0.00625mg/ml) 下无干扰作用， 且内毒素含量小于 10EU mg， 符合拟定标准。 说 明 书 CN 103837673 A 6 5/5 页 7 0065 (6)、 检查结果 0066 按 中华人民共和国药典 细菌内毒素检查法， 使用灵敏度为 0.06EU ml 的鲎试 剂分别对稀释至1600倍后。
18、的6批样品进行细菌内毒素检查， 并同时设立样品的自身阳性对 照管， 结果见下表 ： 0067 盐酸溴己新细菌内毒素检查 0068 ( 湛江安度斯生物有限公司， lotNo.0810222， =0.06EU/ml) 0069 0070 试验结果表明 ： 此6批样品使用灵敏度为0.06EUml的鲎试剂进行检验， 内毒素 含量均小于 10EU mg， 符合规定标准。 0071 (7)、 盐酸溴己新原料药细菌内毒素限度 0072 取本品， 依法检验 (中华人民共和国药典 2010 年版二部， 附录 XI E)， 每 1mg 盐 酸溴己新中含内毒素的量应小于 10EU。 0073 显然， 本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例， 而并非是对 本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。 说 明 书 CN 103837673 A 7 。