应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103741467 A (43)申请公布日 2014.04.23 CN 103741467 A (21)申请号 201310732584.7 (22)申请日 2013.12.26 D06M 15/03(2006.01) D06M 13/328(2006.01) D06M 13/188(2006.01) D06M 13/123(2006.01) D01F 8/10(2006.01) D01F 8/16(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) D06M 101/24(2006.01) D06M 101/30(2006.01) (71)申请人 东华大学 地址。

2、 201620 上海市松江区松江新城人民北 路 2999 号 (72)发明人 史向阳 赵毅丽 范章余 王哲 (74)专利代理机构 上海泰能知识产权代理事务 所 31233 代理人 黄志达 (54) 发明名称 应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳 米纤维的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种应用于靶向捕获癌细胞的透 明质酸功能化纳米纤维的制备方法， 包括 ：（1） 以 水为溶剂配置 PVA/PEI 纺丝液， 然后进行静电纺 丝， 干燥后在含有戊二醛溶液的干燥器中真空交 联处理， 得到水稳定性良好的 PVA/PEI 纳米纤维 ； （2） 将活化好的透明质酸加入到水稳定性良好的 PVA/PEI。

3、 纳米纤维中， 摇床上反应得到透明质酸 功能化修饰的静电纺 PVA/PEI 纳米纤维 ； 再加入 三乙胺及乙酸酐将 PEI/PVA 纳米纤维膜表面剩余 的氨基全部进行乙酰化处理， 最后洗涤、 干燥， 即 可。本发明原料价格低廉、 制备工艺简单， 制备的 透明质酸功能化静电纺纳米纤维具有良好的形貌 及结构稳定性、 生物相容性和血液相容性， 应用前 景广阔。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 附图7页 (10)申请公布号 CN 103741467 A CN 1037414。

4、67 A 1/1 页 2 1. 一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法， 包括 ： （1） 以水为溶剂配置PVA/PEI纺丝液， 其中PVA与PEI的质量比为3:1 ； 采用所述的PVA/ PEI 纺丝液进行静电纺丝制备纳米纤维， 干燥后在含有戊二醛溶液的干燥器中真空交联处 理， 得到水稳定性良好的 PVA/PEI 纳米纤维 ； （2） 将透明质酸溶于水中， 采用 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐及 N- 羟 基琥珀酰亚胺活化， 然后将活化好的透明质酸加入到步骤 （1） 得到的水稳定性良好的 PVA/ PEI 纳米纤维中， 摇床上反应 3d， 得到透明。

5、质酸功能化修饰的静电纺 PVA/PEI 纳米纤维 ； 再 加入三乙胺及乙酸酐将 PEI/PVA 纳米纤维表面剩余的氨基全部进行乙酰化处理， 最后洗 涤、 干燥， 即得透明质酸功能化纳米纤维 HA-PVA/PEI-Ac。 2. 根据权利要求 1 所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的 制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （1） 中PVA的Mn为88000 ； PEI的Mn为25000， 且137.5935g PEI 中含有伯胺 1.08mol、 仲胺 1.49mol、 叔胺 1mol。 3. 根据权利要求 1 所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的 制备方法。

6、， 其特征在于 ： 所述步骤 （1） 中纺丝液 PVA/PEI 的总质量百分比浓度为 12wt%。 4. 根据权利要求 1 所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的 制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 中 HA 的 Mn为 37200。 5. 根据权利要求 1 所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的 制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 中 PVA/PEI 纳米纤维膜中含有的伯胺和仲胺的摩尔数 之和与 HA 的摩尔比为 1:1。 6. 根据权利要求 1 所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的 制备方法， 其特征在于 ： 所述。

7、步骤 （2） 中洗涤为用去离子水洗涤 3-5 次。 7. 根据权利要求 1 所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的 制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 中干燥为真空干燥， 干燥时间为 12-24h。 8. 根据权利要求 1 所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的 制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 中得到透明质酸功能化纳米纤维 HA-PVA/PEI-Ac 应用 于制备表面表达 CD44 的癌细胞的特异性捕获药物。 权 利 要 求 书 CN 103741467 A 2 1/9 页 3 应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备 方法。

8、 技术领域 0001 本发明属于靶向捕获癌细胞纳米材料的制备领域， 特别涉及一种应用于靶向捕获 癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法。 背景技术 0002 纳米纤维材料是一种新型材料， 是纳米科学领域中的前沿技术。 其中， 高分子纳米 纤维是一个重要的研究方向， 有着广泛的应用价值。 尤其通过一些表面修饰作用， 使高分子 纳米纤维材料具有双重性质， 这更是得到了科学工作者的广泛关注， 也将在未来有着广泛 的应用前景。 0003 静电纺丝技术在制备纳米纤维方法中， 有着明显的优势。运用静电纺丝技术可以 降低成本， 并且制造过程简单方便。且制备的纳米纤维的比表面积大、 孔隙率高。通过该方 法制。

9、备的纤维尺寸在十几纳米到几个微米之间。 受到细胞表面组分和细胞外基质支架的纳 米特征的启发， 人们对活细胞和纳米结构材料的相互作用进行了大量研究， 发现纳米材料 在实际应用中可以影响细胞的行为， 如粘附、 生存力、 迁移、 分化以及形态等。 目前静电纺纳 米纤维在药物缓释、 基因治疗、 组织工程、 创伤敷料、 纺织材料、 生物传感器和环境等方面都 有着广泛的应用。 0004 除了制备一些具有不同的溶解性和熔融性的聚合物之外， 还可以通过后续修饰得 到具有一定功能的纳米纤维材料。 Chan等人在静电纺胶原蛋白纳米纤维表面固定能特异性 识别CD29及CD49a的抗体， 结果证明在30min内可捕获。

10、55%的骨髓间充质干细胞。 Zhang等 人首先在 TiO2纳米纤维表面用硅烷偶联剂 - 巯丙基三甲氧基硅处理 30min， 然后经 N- 羟 基琥珀酰亚胺酸处理 1h， 抗生蛋白链菌素反应 30min， 最后将肿瘤细胞抗体接枝到其表面。 结果显示， 其可以大大提高癌细胞捕获的效果， 且细胞含有很多丝状伪足， 与纤维表面紧密 接触， 具有较大的粘附力。 0005 透明质酸是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的线性天然高分 子， 在细胞外基质及正常组织中均有存在。 除了具有良好的生物相容性及非免疫性外， 其表 面上的羧基很容易与其他物质共价结合。大量的研究报道了 HA 与表面表达 。

11、CD44 的癌细胞 之间的相互作用， 目前已广泛采用 HA 来靶向过度表达 CD44 的癌细胞。其中， CD44 在许多 种癌细胞如上皮癌、 淋巴癌、 乳腺癌及肺癌中均有表达。 0006 Ma 等人将 HA 接枝到介孔二氧化硅纳米粒子表面并用于药物载体， 细胞试验表明 MSNs-HA 能够选择性的靶向到过度表达 CD44 蛋白的癌细胞上， 且对该癌细胞具有较强的细 胞毒性。 El-Dakdouki等人制备了透明质酸/磁性氧化铁纳米颗粒用于MRI成像对比剂， 且 证明其能够有效地靶向到肿瘤组织中。 0007 聚乙烯醇 （PVA） 由于具有优异的生物可降解性、 生物相容性， 在外科用缝合线、 体内。

12、植入材料、 药物载体及组织工程支架方面有着广泛的应用。聚乙烯亚胺 （PEI） 表面 含有大量氨基， 表面易修饰， 且与 PVA 混纺可提高其水稳定性， 目前正受到越来越广泛 说 明 书 CN 103741467 A 3 2/9 页 4 的 关 注。Fang 等 Fang,H.,et al.,Facile immobilization of gold nanoparticles into electrospun polyethyleneimine/polyvinyl alcohol nanofibers for catalytic applications.Journal of Material。

13、s Chemistry,2011.21(12):p.4493-4501. 通过原位 还原法制备得到含有金纳米颗粒的PVA/PEI纳米纤维应用于4-硝基酚的催化性能研究。 结 果显示纤维膜的催化性能可以达到 97% 以上， 且在不添加任何助剂的情况下进行第二次， 第三次催化实验， 催化性能仍然可以达到和第一次催化实验相似的效果。但是， 目前关于 PVA/PEI 纳米纤维应用于生物领域， 尤其是靶向捕获癌细胞鲜有报道。 0008 纳米纤维可作为癌细胞的有效载体， 使得癌细胞的有效捕获及早期检测成为可 能。 因此， 将静电纺纳米纤维与细胞捕捉靶向基团进行连接， 有望制备一种短时间内即具有 增强的靶向。

14、特异性捕获癌细胞的材料， 实现血液中癌细胞的分离与癌症早期检测。 0009 检索国内外相关文献和专利结果表明 ： 应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化 纳米纤维的制备， 尚未见报道。 发明内容 0010 本发明所要解决的技术问题是提供一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能 化纳米纤维的制备方法， 该方法的原料价格低廉、 制备工艺简单， 制备的透明质酸功能化纳 米纤维具有良好的形貌及结构稳定性、 生物相容性和血液相容性， 短时间内即具有增强的 靶向特异性捕获癌细胞的效果， 具有潜在的血液中癌细胞分离与癌症早期检测的应用前 景。 0011 本发明的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的。

15、制备方法， 包 括 ： 0012 （1） 以水为溶剂配置 PVA/PEI 纺丝液， 其中 PVA 与 PEI 的质量比为 3:1 ； 采用所述 的 PVA/PEI 纺丝液进行静电纺丝制备纳米纤维， 干燥后在含有戊二醛溶液的干燥器中真空 交联处理， 得到水稳定性良好的 PVA/PEI 纳米纤维 ； 0013 （2） 将透明质酸溶于水中， 采用 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐及 N- 羟基琥珀酰亚胺活化， 然后将活化好的透明质酸加入到步骤 （1） 得到的水稳定性良好的 PVA/PEI 纳米纤维中， 摇床上反应 3d， 得到透明质酸功能化修饰的静电纺 PVA/PEI 纳米纤 。

16、维 ； 再加入三乙胺及乙酸酐将 PEI/PVA 纳米纤维表面剩余的氨基全部进行乙酰化处理， 最 后洗涤、 干燥， 即得透明质酸功能化纳米纤维 HA-PVA/PEI-Ac。 0014 所述步骤 （1） 中 PVA 的 Mn为 88,000 ； PEI 的 Mn为 25,000， 且 137.5935g PEI 中含 有伯胺 （R-NH2） 1.08mol、 仲胺 （R2-NH） 1.49mol、 叔胺 （R3-N） 1mol。 0015 所述步骤 （1） 中纺丝液 PVA/PEI 的总质量百分比浓度为 12wt%。 0016 所述步骤 （2） 中 HA 的 Mn为 37,200。 0017 所述。

17、步骤 （2） 中 PVA/PEI 纳米纤维膜中含有的伯胺和仲胺的摩尔数之和与 HA 的 摩尔比为 1:1。 0018 所述步骤 （2） 中洗涤为用去离子水洗涤 3-5 次。 0019 所述步骤 （2） 中干燥为真空干燥， 干燥时间为 12-24h。 0020 所述步骤 （2） 中得到透明质酸功能化纳米纤维 HA-PVA/PEI-Ac 应用于制备表面表 达 CD44 的癌细胞的特异性捕获药物。 说 明 书 CN 103741467 A 4 3/9 页 5 0021 本发明中 HA 与 PVA/PEI 纳米纤维反应过程 ： 0022 称取 PVA/PEI 纳米纤维的质量为 120.4mg， 按照质。

18、量比 PVA:PEI=3:1 计算得知 PEI 的质量为 30.1mg。根据每 137.5935g 的 PEI 中含有伯胺 （R-NH2） 1.08mol， 仲胺 （R2-NH） 1.49mol， 叔胺 （R3-N） 1mol， 其中能参与酰胺化反应的， 只有伯胺和仲胺。因此， 经过计算 120.4mg 的纤维膜中， 可以参与酰胺化反应的氨基为 0.563mol。以摩尔比羧基 ： 氨基 =1 ： 1 计算， 所需的HA为0.563mol， 质量为213.94mg。 以摩尔比HA:EDC:NHS=1:5:5计算， EDC的量 为 539.64mg， NHS 的量为 323.98mg， 分别溶于 。

19、10mL 水中， 缓慢逐滴加入到含有 213.94mgHA 的10mL水溶液中， 从而以总体积为30mL的反应体系进行活化反应3h， 将30mL的HA反应液 加到 PVA/PEI 纳米纤维膜的培养皿中， 摇床反应 3d。 0023 根据已经计算出的该纳米纤维含有 0.563mol 的氨基， 以 5 倍过量进行乙酰化处 理， 三乙胺的浓度为 0.727g/mL， 计算所需的体积为 391.82uL， 反应 30-60min， 乙酸酐的浓 度为 1.08g/mL， 计算所需的体积为 266.10uL， 继续反应 12-24h。 0024 本发明基于透明质酸功能化静电纺纳米纤维， 通过培养表面表达 。

20、CD44 受体的人 宫颈癌细胞 （Hela） 及表面不表达 CD44 受体的人恶性胶质母细胞瘤细胞 （U87MG） 在所制备 材料及对照材料 （不含有 HA） 上培养， 对产品靶向捕获癌细胞性能进行评价。 0025 通过扫描电镜 （SEM） 、 傅里叶变换 - 红外光谱 （FTIR） 等技术对制备的材料进行相 关结构性质的表征 ； 通过 MTT 细胞活力实验及溶血、 抗凝血实验对制备的材料进行生物相 容性及血液相容性的评价 ； 借助激光共聚焦显微镜及细胞计数器， 研究材料对癌细胞的特 异捕获性能。 0026 和对照的未经透明质酸功能化修饰的静电纺 PVA/PEI 纳米纤维捕获癌细胞的效 果相比。

21、， 本发明制备的材料捕获 Hela 细胞的数量明显超过未经透明质酸修饰的对照材料， 且 Hela 细胞在该材料上均伸出丝状伪足， 紧紧粘附在纳米纤维膜上， 而在对照材料上细胞 呈现球形， 粘附形态较差。因此本发明制备的透明质酸功能化纳米纤维能够作为新型材料 用于癌细胞的特异性捕获。 0027 纤维形貌及结构稳定性扫描电镜图 （SEM） 表征、 傅里叶变换 - 红外光谱 （FTIR） 、 MTT 生物相容性、 溶血及抗凝血性能研究、 Hela 细胞捕获的激光共聚焦显微镜 （CLSM） 定性 试验、 Hela 细胞在纳米纤维上粘附形态扫描电镜表征、 Hela 细胞捕获特异性定量试验以及 U87MG。

22、 细胞捕获特异性定量试验结果分别如下 ： 0028 （1） 扫描电镜图 （SEM） 结果 0029 SEM 图用于表征纳米纤维的形貌和直径大小。参见说明书附图 1， 所得到的 PVA/ PEI 纳米纤维外观呈现白色 （附图 1a） ， 形貌规整， 表面光滑， 平均直径为 459.736.1nm。 0030 经戊二醛交联处理后， 纤维外观呈现粉色 （附图 1b） ， 这主要由于 PEI 上的氨基和 戊二醛上的氨基形成的缩醛所致。 将戊二醛交联处理后水稳定性良好的纳米纤维浸润在水 溶液中 7d 后， 纤维形貌保持良好， 没有粘连现象， 纤维平均直径增加到 660.895.7nm， 可 能是因为纤维。

23、在水溶液中发生溶胀导致。 0031 参见说明书附图 2， 将 HA 修饰到 PVA/PEI 纳米纤维表面后 （附图 2a） ， 纤维仍然 保持良好形貌与多孔结构， 其平均直径与经戊二醛交联浸润在水溶液中 7d 后的纳米纤 维接近， 为 654.892.2nm， 对照材料未经 HA 修饰的 PVA/PEI 纳米纤维 （附图 2b）直径为 694.570.0nm。 说 明 书 CN 103741467 A 5 4/9 页 6 0032 （2） 傅里叶变换 - 红外光谱 （FTIR） 结果 0033 FTIR结果表明， HA成功修饰到PVA/PEI纳米纤维表面。 参见说明书附图3， 从图上 可以看出。

24、， 2940cm-1是 -CH2- 的特征峰。位于 1650cm-1处的氨基 N-H 键的特征峰则表明交联 后 PEI 纳米纤维上面仍保留有部分氨基， 有利于后续的纳米反应器进行表面功能化修饰的 应用研究。HA 在 1600cm-1处存在振动吸收峰， 同时， HA-PVA/PEI-Ac 纳米纤维表在 1600cm-1 处也存在振动吸收峰， 这说明 PVA/PEI 纳米纤维表面有 HA 的存在， 即 HA 成功修饰到纤维表 面。 0034 （3） MTT 生物相容性结果 0035 参见说明书附图 4， 在不同时间点， L929 细胞在 HA-PVA/PEI-Ac 与 PVA/PEI-Ac 纳 米。

25、纤维表面的增殖活性明显优于其在对照组 （盖玻片） 表面的增殖活力。经过对 MTT 数据 进行数学分析得知， 培养 3d 后， L929 细胞在 HA-PVA/PEI-Ac 纳米纤维表面与盖玻片表面 的活力存在显著的统计学差异， 且培养 7d 后， L929 细胞在 HA-PVA/PEI-Ac 纳米纤维表面、 PVA/PEI-Ac 纳米纤维表面均与盖玻片表面的活力存在显著的统计学差异。这说明 HA-PVA/ PEI-Ac 与 PVA/PEI-Ac 纳米纤维的生物活性明显优于盖玻片。 0036 （4） 溶血性能结果 0037 参见说明书附图 5， 当 HA-PVA/PEI-Ac 与 PVA/PEI。

26、-Ac 纳米纤维浓度分别为 2mg/ mL、 4mg/mL、 6mg/mL 时， 血红细胞均可以在离心作用下完整的分离出来， 亦即两种材料在不 同浓度下均未使血红细胞涨破。为从定量角度进一步衡量材料的溶血性能， 通过 UV-Vis 测 量不同浓度条件下， 两种材料处理后的 PBS 中血红蛋白的含量。由说明书附图 5 及附表 1 可知， 人血红细胞与各实验浓度下的材料共培养 2h 并经离心后， 上清液中血红蛋白的含量 明显低于对照组 （蒸馏水） ， 且计算得知在实验浓度分别为 2mg/mL、 4mg/mL、 6mg/mL 条件下， HA-PVA/PEI-Ac 的溶血率分别为 （0.190.03）。

27、 %、（1.130.22） %、（2.050.59） %， PVA/ PEI-Ac 的溶血率分别为 （0.440.03） %、（2.300.72） %、（3.680.81） %， 其值均低于 5%， 表明在实验浓度范围内， HA-PVA/PEI-Ac 与 PVA/PEI-Ac 纳米纤维均不能使人血细胞产生溶 血现象， 具有良好的血液相容性。 0038 （5） 抗凝血性能结果 0039 参见说明书附图 6， 在不同时间点， 上清液中血红蛋白的含量均高于对照组 （盖玻 片） ， 说明 HA-PVA/PEI-Ac 与 PVA/PEI-Ac 纳米纤维的抗凝血性能优与盖玻片组。随着培养 时间的增加， 血。

28、红蛋白的含量均有所降低， 这是因为在体外血红细胞会不可避免的发生凝 固。 经数据分析可以得知， 在不同时间段， 盖玻片组和纤维材料组血红蛋白的含量均存在明 显的差异， 这说明 HA-PVA/PEI-Ac 与 PVA/PEI-Ac 纳米纤维均具有较好的抗凝血作用。 0040 （6） Hela 细胞捕获的激光共聚焦显微镜 （CLSM） 定性试验结果 0041 以表面表达 CD44 受体的人宫颈癌细胞 （Hela）为模型细胞来检验两种材料 HA-PVA/PEI-Ac 与 PVA/PEI-Ac 纳米纤维捕获 Hela 细胞的效果。参见说明书附图 7， 试验结 果表明， 在不同的培养时间点 （5min、。

29、 20min、 40min、 60min、 120min、 240min） ， 含有靶向分子 HA 的纳米纤维可以捕获更多的癌细胞。尤其在 60min、 120min、 240min 时， 两种材料捕获癌 细胞的数量相差最为明显。这主要是因为含有靶向分子的材料具备更强的特异性， 但细胞 的粘附需要一定的时间。 0042 （7） Hela 细胞在纳米纤维上粘附形态扫描电镜表征 说 明 书 CN 103741467 A 6 5/9 页 7 0043 SEM 图用于表征细胞在纳米纤维上的微形貌， 参见说明书附图 8， Hela 细胞在 HA-PVA/PEI-Ac 与 PVA/PEI-Ac 纳米纤维两。

30、种材料上培养 60min、 120min、 240min 后， 细胞在 HA-PVA/PEI-Ac 纳米纤维表面均伸出丝状伪足， 紧紧粘附在纳米纤维膜上， 而在对照材料 PVA/PEI-Ac 纳米纤维上细胞呈现球形， 粘附形态较差。这表明透明质酸具有一定的靶向作 用， 可在短时间内促进表面表达 CD44 受体的细胞在其表面粘附生长。 0044 （8） Hela 细胞捕获特异性定量试验结果 0045 以表面表达 CD44 受体的人宫颈癌细胞 （Hela）为模型细胞来检验两种材料 HA-PVA/PEI-Ac 与 PVA/PEI-Ac 纳米纤维捕获 Hela 细胞的数量。参见说明书附图 9， 试验结。

31、 果表明， 经过 40min、 60min、 120min、 240min 培养后， HA-PVA/PEI-Ac 捕获癌细胞的数量远远 高于 PVA/PEI-Ac 纳米纤维， 且其捕获细胞的数量具有显著性差异。 0046 （9） U87MG 细胞捕获特异性定量试验结果 0047 以表面不表达 CD44 受体的人恶性胶质母细胞瘤细胞 （U87MG） 为模型细胞来检验 两种材料 HA-PVA/PEI-Ac 与 PVA/PEI-Ac 纳米纤维捕获 U87MG 细胞的数量。参见说明书 附图 10， 试验结果表明， 经过 10min、 20min、 40min、 60min、 120min、 240mi。

32、n 培养后， HA-PVA/ PEI-Ac 捕获癌细胞的数量与 PVA/PEI-Ac 纳米纤维几乎相同， 没有显著性差异。这说明， 这 种靶向分子修饰的功能化纳米纤维仅对特定的细胞具有高效捕获作用。 0048 本发明采用静电纺丝法制备 PVA/PEI 纳米纤维， 充分利用纳米纤维与细胞表面成 分 （如微绒毛及丝状伪足） 及细胞外基质具有相类似的结构， 可促进细胞在其表面的粘附及 增值 ； 同时， 纳米纤维比表面积大、 孔隙率高， 可提供足够的细胞接触位点 ； 并且纳米纤维 易于表面修饰的优势。结合靶向分子的与细胞间的特异结合能力， 可达到短时间内靶向特 异性捕获癌细胞的目的。 0049 有益效。

33、果 ： 0050 （1） 本发明原料价格低廉、 制备工艺简单， 具有扩大规模生产的可能性 ； 0051 （2） 本发明制备的透明质酸功能化纳米纤维具有良好的形貌及结构稳定性、 生物 相容性和血液相容性 ； 0052 （3） 本发明制备得到的透明质酸功能化纳米纤维短时间内即具有增强的靶向特异 性捕获癌细胞的效果， 为应用于血液中癌细胞分离与癌症早期检测的纳米材料的开发打下 了良好的实验基础。 附图说明 0053 图 1 为本发明制备的 PVA/PEI 纳米纤维戊二醛交联前 （a） 、 后 （b） 的扫描电镜图及 直径分布 ； 0054 图 2 为本发明制备的 HA-PVA/PEI-Ac（a） 与。

34、 PVA/PEI-Ac（b） 纳米纤维的扫描电 镜图及直径分布 ； 0055 图 3 为本发明制备 PVA/PEI 纳米纤维、 戊二醛交联 PVA/PEI、 HA 及 HA-PVA/PEI-Ac 纳米纤维的红外图谱 ； 0056 图 4 为本发明制备 HA-PVA/PEI-Ac 及 PVA/PEI-Ac 纳米纤维表面小鼠成纤维细胞 增殖的细胞活力测试结果 ； 0057 图 5 为本发明制备的 HA-PVA/PEI-Ac 及 PVA/PEI-Ac 纳米纤维处理 2h 后对人血细 说 明 书 CN 103741467 A 7 6/9 页 8 胞的溶血效应 （插图为反应其溶血现象的数码照片） ； 0。

35、058 图 6 为本发明制备的 HA-PVA/PEI-Ac 及 PVA/PEI-Ac 纳米纤维的抗凝血行为 ； 0059 图 7 为本发明制备的 HA-PVA/PEI-Ac 及 PVA/PEI-Ac 纳米纤维对 Hela 细胞捕获的 共聚焦显微镜图片 ； 0060 图 8 为 Hela 细胞在本发明制备的 HA-PVA/PEI-Ac 及 PVA/PEI-Ac 纳米纤维表面培 养 60min、 120min、 240min 后的细胞形态 ； 0061 图 9 为本发明制备的 HA-PVA/PEI-Ac 及 PVA/PEI-Ac 纳米纤维在不同时间内 （10min、 20min、 40min、 6。

36、0min、 120min、 240min） 捕获 Hela 细胞的数量 ； 0062 图 10 为本发明制备的 HA-PVA/PEI-Ac 及 PVA/PEI-Ac 纳米纤维在不同时间内 （10min、 20min、 40min、 60min、 120min、 240min） 捕获 U87MG 细胞的数量。 具体实施方式 0063 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 006。

37、4 实施例 1 0065 称取9.68732g PVA， 将其溶解在71.04g超纯水中， 用玻璃棒缓慢搅拌约30分钟直 至 PVA 粉末完全溶胀， 随后放置在磁力搅拌器上 80水浴加热搅拌 3h， 得到均匀的浓度为 12wt% 的 PVA 溶液。 0066 称取15g已配置好的12wt%的PVA纺丝液， 其中PVA的量为1.8g， 根据设定混合溶 液中 PVA 与 PEI 固体的质量比为 3:1， 从而得出所需 PEI 的质量为 0.6g， 称取 0.6gPEI 加入 到 15g12wt% 的 PVA 纺丝液中， 继续加入 4.4g 水， 涡旋混合仪混合后然后用超声 30min 使其 分散均。

38、匀， 磁力搅拌过夜， 得到纺丝液 PVA/PEI 的总质量百分比浓度为 12wt%。 0067 所采用纺丝工艺条件为 ： 纺丝的电压18.6kV， 其中正压为13.6kV， 负压为-5kV ； 流 速 0.3mL/h ； 接收距离为 25cm ； 环境湿度 40-50%。将纤维毡真空条件下干燥 12-24h。 0068 所得到的 PVA/PEI 纳米纤维外观呈现白色， SEM 结果显示其形貌规整， 表面光滑， 平均直径为 459.736.1nm（附图 1a） 。 0069 实施例 2 0070 将实施例 1 制备的 PVA/PEI 纳米纤维毡套在盛有 25% 的戊二醛溶液的培养皿上 方， 将两。

39、者一起放入干燥器中， 抽真空交联18h。 所得到的PVA/PEI纳米纤维外观呈现粉色， 将戊二醛交联处理后的纳米纤维浸润在水溶液中 7d 后， SEM 结果显示纤维形貌保持良好， 没有粘连现象， 纤维平均直径增加到 660.895.7nm（附图 1b） ， 表明纤维水稳定性良好。 0071 实施例 3 0072 称取 PVA/PEI 纳米纤维的质量为 120.4mg， 按照质量比 PVA:PEI=3:1 计算得知 PEI 的质量为 30.1mg。根据每 137.5935g 的 PEI 中含有伯胺 （R-NH2） 1.08mol， 仲胺 （R2-NH） 1.49mol， 叔胺 （R3-N） 1m。

40、ol， 其中能参与酰胺化反应的， 只有伯胺和仲胺。因此， 经过计算 120.4mg 的纤维膜中， 可以参与酰胺化反应的氨基为 0.563mol。以摩尔比羧基 ： 氨基 =1 ： 1 计算， 所需的HA为0.563mol， 质量为213.94mg。 以摩尔比HA:EDC:NHS=1:5:5计算， EDC的量 说 明 书 CN 103741467 A 8 7/9 页 9 为 539.64mg， NHS 的量为 323.98mg， 分别溶于 10mL 水中， 缓慢逐滴加入到含有 213.94mgHA 的10mL水溶液中， 从而以总体积为30mL的反应体系进行活化反应3h， 将30mL的HA反应液 加。

41、到 PVA/PEI 纳米纤维膜的培养皿中， 摇床反应 3d。 0073 根据已经计算出的该纳米纤维含有 0.563mol 的氨基， 以 5 倍过量进行乙酰化处 理， 三乙胺的浓度为 0.727g/mL， 计算所需的体积为 391.82uL， 反应 30-60min， 乙酸酐的浓 度为1.08g/mL， 计算所需的体积为266.10uL， 继续反应12-24h。 去离子水洗涤3-5次， 真空 干燥， 得到 HA-PVA/PEI-Ac 纳米纤维。 0074 SEM 结果显示将 HA 修饰到 PVA/PEI 纳米纤维表面后 （附图 2a） ， 纤维仍然保持良 好形貌与多孔结构， 其平均直径与经戊二醛。

42、交联浸润在水溶液中 7d 后的纳米纤维接近， 为 654.892.2nm。FTIR（附图 3） 表明 HA 已成功修饰到 PVA/PEI 纳米纤维表面。 0075 实施例 4 0076 将实施例 3 制备的 HA-PVA/PEI-Ac 纳米纤维与对比例 1 制备的 PVA/PEI-Ac 纳米 纤维从铝箔上揭下， 剪成圆形(=14mm)， 然后将样品放入24孔培养板， 用钢环固定。 另外， 将只放玻片的孔和空白孔 （TCP 培养板） 作为对照， 对照孔同样加钢环。不同时间点的样品 要放置在不同的培养板中， 每个样品 4 个平行样。放好样品后， 加入约 1mL 的 75% 酒精浸泡 2 小时， 同。

43、时， 开紫外灯杀菌。杀菌完毕后， 吸出酒精， 用 PBS 溶液浸泡漂洗 3 次， 每次 20 分 钟。最后用 400L 纯的 DMEM 培养基浸泡， 放入 CO2培养箱过夜。 0077 从培养箱取出 24 孔培养板， 吸出之前加入的纯的培养基， 按照 1.5104个 / 孔 的密度接种， 每孔体积 400L， 然后将培养板盖好，“8” 字形摇匀， 放置在培养箱中， 37、 5%CO2条件下培养 1d、 3d、 7d， 每 2d 更换一次培养基。 0078 将培养到一定时间的细胞从培养箱取出， 吸掉原来的培养基， 用 PBS 溶液冲洗 3 次， 然后每孔加细胞培养基360L， MTT40L， 放。

44、入培养箱培养4h， 使细胞与MTT充分反应。 4h后， 吸去培养基， 每孔加入400L DMSO， 摇床慢速摇20分钟， 使沉淀溶解， 然后从每个孔 移取 100L 溶液加入 96 孔培养板中， 用 Mk3 酶标仪 （Thermo） 测甲臜溶液在 570nm 处的吸 光值。 0079 MTT 测试结果显示， 培养 3d 后， L929 细胞在 HA-PVA/PEI-Ac 纳米纤维表面与盖玻 片表面的活力存在显著的统计学差异， 且培养 7d 后， L929 细胞在 HA-PVA/PEI-Ac 纳米纤 维表面、 PVA/PEI-Ac 纳米纤维表面均与盖玻片表面的活力存在显著的统计学差异。这说明 H。

45、A-PVA/PEI-Ac 与 PVA/PEI-Ac 纳米纤维的生物活性明显优于盖玻片 （附图 4） 。 0080 实施例 5 0081 取肝素锂稳定的健康成年人全血 5mL， 离心 3min （转速为 3000r/min） ， 用 PBS 洗涤 沉淀3次， 得血红细胞。 用PBS按照1 ： 35的比例配置成人血红细胞悬浊液， 于4冰箱中备 用。对照组将 0.2mL 人血红细胞悬浊液分别溶于 0.8mLPBS 中和 0.8mL 蒸馏水中。然后， 将 所配置的人血红细胞悬浊液再稀释5倍， 按照纤维毡质量 ： 稀释5倍后人血红细胞悬浊液体 积之比为 2mg:1mL、 4mg:1mL、 6mg:1mL。

46、 将实施例 3 制备的 HA-PVA/PEI-Ac 纳米纤维与对比例 1 制备的 PVA/PEI-Ac 纳米纤维浸入稀释 5 倍后人血红细胞悬浊液中， 同一浓度下 HA-PVA/ PEI-Ac 与 PVA/PEI-Ac 纳米纤维均取 4 个平行样， 在 37环境下孵育 2h。然后， 取出纤维 毡， 将两个对照组及浸泡过纤维毡的人血红细胞悬浊液离心 1min （1000rpm） ， 取上清液并用 Lamada25 型紫外分光光度计测试上清液在 540nm 处的吸光值。溶血试验结果表明， 在实验 说 明 书 CN 103741467 A 9 8/9 页 10 浓度范围内， HA-PVA/PEI-A。

47、c 与 PVA/PEI-Ac 纳米纤维均不能使人血细胞产生溶血现象， 具 有良好的血液相容性 （附图 5） 。 0082 表 1HA-PVA/PEI-Ac 及 PVA/PEI-Ac 纳米纤维处理 2h 后对人血细胞的溶血率 0083 0084 实施例 6 0085 将实施例 3 制备的 HA-PVA/PEI-Ac 纳米纤维与对比例 1 制备的 PVA/PEI-Ac 纳米 纤维从铝箔上揭下， 剪成圆形(=14mm)， 放入12孔培养板， 每个样品取4个平行样 （对照组 为 ： 直径 1.4cm 的盖玻片） 。然后， 向每孔中纤维毡以及对照组盖玻片上滴加 20L 肝素锂 稳定的健康成年人全血， 同。

48、时加 10L CaCl2溶液 （0.2mol/L） ， 置于 37环境下孵育 5min、 10min、 20min、 40min、 60min。 在每个培养时间结束后， 向每孔加5mL蒸馏水并37孵育5分 钟， 然后用 Lamada25 型紫外分光光度计测试溶液在 540nm 处的吸光值。抗凝血试验结果表 明， HA-PVA/PEI-Ac 与 PVA/PEI-Ac 纳米纤维的抗凝血性能均优于盖玻片组 （附图 6） 。 0086 实施例 7 0087 以表面表达 CD44 受体的人宫颈癌细胞 （Hela） 为模型细胞来检验将实施例 3 制备 的 HA-PVA/PEI-Ac 纳米纤维与对比例 1 。

49、制备的 PVA/PEI-Ac 纳米纤维特异性捕获 Hela 细胞 的效果。将纳米纤维从铝箔上揭下， 剪成圆形 (=14mm)， 然后将样品放入 24 孔培养板， 用 钢环固定。不同时间点的样品要放置在不同的培养板中， 每个样品 4 个平行样。放好样品 后， 加入约 1mL 的 75% 酒精浸泡 2h， 同时， 开紫外灯杀菌。杀菌完毕后， 吸出酒精， 用 PBS 溶 液浸泡漂洗 3 次， 每次 20 分钟。最后用 400L 纯的 DMEM 培养基浸泡， 放入 CO2培养箱过 夜。 0088 从培养箱取出 24 孔培养板， 吸出之前加入的纯的培养基， 按照 5104个 / 孔的密 度接种， 每孔体积 400L， 然后将培养板盖好，“8” 字形摇匀， 放置在培养箱中， 37、 5%CO2 条件下培养不同时间后 （5min、 20min、 40min、 60min、 1。