一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103940869 A (43)申请公布日 2014.07.23 CN 103940869 A (21)申请号 201410155338.4 (22)申请日 2014.04.17 G01N 27/26(2006.01) (71)申请人 佳木斯大学 地址 154007 黑龙江省佳木斯市学府路 148 号佳木斯大学理学院 (72)发明人 刘继光 武冬梅 朱建华 李锦莲 黄新艳 刘冰 朱杨 尹铁臣 (74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 牟永林 (54) 发明名称 一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法 (57) 摘要 一种哺乳动物细胞转化的。

2、电化学检测方法， 涉及一种细胞转化的检测方法。本发明是要解决 传统细胞转化实验存在的检测准确性低， 试验周 期长， 试验的模型细胞株种类受到限制的技术问 题。本发明的方法为 ： 一、 将细胞分为三组， A 组 为空白组， 记录正常细胞的电化学行为 ； B 组以 MNNG 为启动剂， 进行电化学检测 ； C 组用 DMSO 代 替 MNNG 做阴性对照， 进行同步电化学检测 ； 二、 将 步骤一中 B 组的细胞培养 8 天， 然后将细胞分二 组 ： 第一组加入促进剂 TPA ； 第二组仍为 MNNG 组 ； 以步骤一中的 C 组 DMSO 组为第三组 ； 对三组细胞 进行同步电化学检测， 当出现。

3、电化学信号 TPA 组 MNNG 组 DMSO 组时， 即完成。本发明应用于细胞 检测领域。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103940869 A CN 103940869 A 1/1 页 2 1. 一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法， 其特征在于哺乳动物细胞转化的电化学 检测方法是按以下步骤进行的 ： 一、 将细胞接种于 60mm 培养皿， 培养 24 48h 后分为三组， A 组为空白组， 记录正常 细胞的电化学行为 ； 。

4、B 组以浓度为 0.5 1.0mg/L 的 MNNG 为启动剂， 对细胞进行染毒， 培养 3 4h 后除去 MNNG， 每 40 48h 进行一次电化学检测 ； C 组用浓度为 3% 5% 的 DMSO 代 替 MNNG 做阴性对照， 与染毒组进行同步电化学检测 ； 二、 将步骤一中B组以MNNG为启动剂的细胞培养8天， 然后将细胞分两组 ： 第一组加入 浓度为 100 200g/L 的促进剂 TPA ； 第二组仍为 MNNG 组 ； 以步骤一中的 C 组 DMSO 组为 第三组 ； 对三组细胞每 40 48h 进行一次电化学检测， 当出现电化学信号 TPA 组 MNNG 组 DMSO 组时，。

5、 即完成哺乳动物细胞转化的电化学检测方法。 2. 根据权利要求 1 所述的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法， 其特征在于所述 细胞为 C3H10T1/2、 Balb/3T3 或 SHE 细胞。 3. 根据权利要求 1 所述的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法， 其特征在于所述 电化学检测方法为循环伏安法或差示脉冲法。 4. 根据权利要求 1 所述的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法， 其特征在于所述 电化学检测的工作电极为离子液体 / 多壁碳纳米管复合修饰电极。 5. 根据权利要求 1 所述的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法， 其特征在于所述 电化学检测以 0.7V 和 1.1V 。

6、的双信号为指标。 6. 根据权利要求 1 所述的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法， 其特征在于步骤 一中培养 24h 后分为三组。 7. 根据权利要求 1 所述的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法， 其特征在于步骤 一中培养 4h 后除去 MNNG。 8. 根据权利要求 1 所述的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法， 其特征在于步骤 一中每 48h 进行一次电化学检测。 9. 根据权利要求 1 所述的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法， 其特征在于步骤 二中每 48h 进行一次电化学检测。 权 利 要 求 书 CN 103940869 A 2 1/4 页 3 一种哺乳动物细胞转化的电。

7、化学检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种细胞转化的检测方法。 背景技术 0002 癌症是目前全世界共同面临的重大公共卫生问题， 已成为严重威胁人类生命与健 康的疾病之一。国际癌症研究中心 （IARC） 指出， 80-90% 的人类肿瘤是由环境致癌物引起 的， 其中化学致癌物是主要因素。 目前， 体外哺乳动物细胞转化试验是唯一成熟的能够评价 物质致癌活性的体外试验方法。此法已被国际癌症研究中心 （IARC） 、 欧洲替代方法研究中 心 （ECVAM） 、 全国危险化学品管理标准化技术委员会 （SAC/TC） 等众多机构评价为一种有效 的筛选致癌物的方法。 0003 体外哺乳动物细胞转化试。

8、验是将细胞暴露于致癌物， 高度模拟致癌物在体内致 癌作用的一种技术。转化过程可分为两阶段 ： 首先在细胞指数生长期给予短暂的肿瘤启 动剂处理 ； 然后在细胞融合后的生长静止期给以长时间促癌剂处理， 以细胞发生恶性转 化从而产生的形态改变为试验终点， 通过单盲法观察细胞转化灶， 计算克隆数， 确定致癌 物毒性。目前得到广泛认可和使用的细胞系为具有敏感接触抑制性的小鼠间充质干细胞 （C3H10T1/2） 、 小鼠胚胎成纤维细胞 （Balb/3T3） 和金黄地鼠胚胎细胞 （SHE） 等。 0004 传统细胞转化实验以细胞形态学变化为观察终点， 检测结果很大程度上受人为主 观因素影响， 导致检测准确性。

9、低 ； 而且试验周期长， 至少需要 4-5 周。另外， 受到敏感性、 自 发转化率和稳定性等因素的影响， 可用于试验的模型细胞株种类受到了极大的限制。 发明内容 0005 本发明是要解决传统细胞转化实验存在的检测准确性低， 试验周期长， 试验的模 型细胞株种类受到限制的技术问题， 从而提供了一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方 法。 0006 本发明的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法是按以下步骤进行的 ： 0007 一、 将细胞接种于 60mm 培养皿， 培养 24 48h 后分为三组， A 组为空白组， 记录正 常细胞的电化学行为 ； B组以浓度为0.51.0mg/L的甲基硝基亚硝基胍 （。

10、MNNG） 为启动剂， 对细胞进行染毒， 培养 3 4h 后除去 MNNG， 每 40 48h 进行一次电化学检测 ； C 组用浓度 为 3% 5% 的二甲基亚砜 （DMSO） 代替 MNNG 做阴性对照， 与染毒组进行同步电化学检测 ； 0008 二、 将步骤一中B组以MNNG为启动剂的细胞培养8天， 然后将细胞分两组 ： 第一组 加入浓度为 100 200g/L 的促进剂 TPA ； 第二组仍为 MNNG 组 ； 以步骤一中的 C 组 DMSO 组为第三组 ； 对三组细胞每4048h进行一次电化学检测， 当出现电化学信号TPA组MNNG 组 DMSO 组时， 即完成哺乳动物细胞转化的电化学。

11、检测方法。 0009 本发明包括以下有益效果 ： 0010 1、 本发明以电化学分析为手段， 以嘌呤碱基为生物标志物， 建立了简单、 快速、 灵 敏、 低成本评价环境致癌物毒性的体外哺乳动物细胞转化电化学试验方法， 实现分子水平 说 明 书 CN 103940869 A 3 2/4 页 4 的终点检测， 大幅度降低检测时间， 消除检测的主观因素， 提高检测准确性 ； 0011 2、 本发明通过数据处理， 分析比较正常细胞和转化细胞电化学数据的差异， 确定 判断细胞转化的电化学特征指标， 建立体外哺乳动物细胞转化的电化学检测方法。 0012 3、 本发明采用电化学法检测细胞转化， 加入启动剂 M。

12、NNG 后， 加药组在第 4 天由于 细胞内 DNA 损伤， 测得细胞电化学信号出现衰减， 双电化学信号强度均比空白组和 DMSO 阴 性对照组弱 ； 而在加入促进剂 TPA 后第八天， 由于促进剂促进了细胞的增值， 其电化学信号 激增， 达到最大。 说明细胞转化过程中嘌呤代谢发生显著改变， 电化学信号与细胞转化过程 具有明显相关性。 附图说明 0013 图 1 为试验一步骤一中三组细胞培养第 4 天的伏安图 ； 其中， a 为 A 组未加入启动 剂的细胞培养第 4 天的伏安图 ； b 为 C 组以 DMSO 为阴性对照的细胞培养第 4 天的伏安图 ； c 为 B 组以 MNNG 为启动剂的细。

13、胞培养第 4 天的伏安图 ； 0014 图 2 为试验一步骤二中三组细胞培养第 4 天的伏安图 ； 其中， a 为第三组 DMSO 组 的细胞培养第 4 天的伏安图 ； b 为第一组以 TPA 为促进剂的细胞培养第 4 天的伏安图 ； c 为 第二组 MNNG 组的细胞培养第 4 天的伏安图 ； 0015 图 3 为试验一步骤二中三组细胞培养第 8 天的伏安图 ； 其中， a 为第一组以 TPA 为 促进剂的细胞培养第8天的伏安图 ； b为第二组MNNG组的细胞培养第8天的伏安图 ； c为第 三组 DMSO 组的细胞培养第 8 天的伏安图。 具体实施方式 0016 具体实施方式一 ： 本实施方。

14、式的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法是按以 下步骤进行的 ： 0017 一、 将细胞接种于 60mm 培养皿， 培养 24 48h 后分为三组， A 组为空白组， 记录正 常细胞的电化学行为 ； B组以浓度为0.51.0mg/L的甲基硝基亚硝基胍 （MNNG） 为启动剂， 对细胞进行染毒， 培养 3 4h 后除去 MNNG， 每 40 48h 进行一次电化学检测 ； C 组用浓度 为 3% 5% 的二甲基亚砜 （DMSO） 代替 MNNG 做阴性对照， 与染毒组进行同步电化学检测 ； 0018 二、 将步骤一中B组以MNNG为启动剂的细胞培养8天， 然后将细胞分两组 ： 第一组 加入浓度为。

15、 100 200g/L 的促进剂 TPA ； 第二组仍为 MNNG 组 ； 以步骤一中的 C 组 DMSO 组为第三组 ； 对三组细胞每4048h进行一次电化学检测， 当出现电化学信号TPA组MNNG 组 DMSO 组时， 即完成哺乳动物细胞转化的电化学检测方法。 0019 本实施方式包括以下有益效果 ： 0020 1、 本实施方式以电化学分析为手段， 以嘌呤碱基为生物标志物， 建立了简单、 快 速、 灵敏、 低成本评价环境致癌物毒性的体外哺乳动物细胞转化电化学试验方法， 实现分子 水平的终点检测， 大幅度降低检测时间， 消除检测的主观因素， 提高检测准确性 ； 0021 2、 本实施方式通过。

16、数据处理， 分析比较正常细胞和转化细胞电化学数据的差异， 确定判断细胞转化的电化学特征指标， 建立体外哺乳动物细胞转化的电化学检测方法。 0022 3、 本实施方式采用电化学法检测细胞转化， 加入启动剂 MNNG 后， 加药组在第 4 天由于细胞内 DNA 损伤， 测得细胞电化学信号出现衰减， 双电化学信号强度均比空白组和 说 明 书 CN 103940869 A 4 3/4 页 5 DMSO 阴性对照组弱 ； 而在加入促进剂 TPA 后第八天， 由于促进剂促进了细胞的增值， 其电化 学信号激增， 达到最大。 说明细胞转化过程中嘌呤代谢发生显著改变， 电化学信号与细胞转 化过程具有明显相关性。。

17、 0023 具体实施方式二 ： 本实施方式与具体实施方式一不同的是 ： 所述细胞为 C3H10T1/2、 Balb/3T3 或 SHE 细胞。其它与具体实施方式一相同。 0024 具体实施方式三 ： 本实施方式与具体实施方式一或二不同的是 ： 所述电化学检测 方法为循环伏安法或差示脉冲法。其它与具体实施方式一或二相同。 0025 具体实施方式四 ： 本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是 ： 所述电化学 检测的工作电极为离子液体 / 多壁碳纳米管复合修饰电极。其它与具体实施方式一至三之 一相同。 0026 具体实施方式五 ： 本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是 ： 所述电化学 检测。

18、以 0.7V 和 1.1V 的双信号为指标。其它与具体实施方式一至四之一相同。 0027 具体实施方式六 ： 本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是 ： 步骤一中培 养 24h 后分为三组。其它与具体实施方式一至五之一相同。 0028 具体实施方式七 ： 本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是 ： 步骤一中培 养 4h 后除去 MNNG。其它与具体实施方式一至六之一相同。 0029 具体实施方式八 ： 本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是 ： 步骤一中每 48h 进行一次电化学检测。其它与具体实施方式一至七之一相同。 0030 具体实施方式九 ： 本实施方式与具体实施方式一至八之。

19、一不同的是 ： 步骤二中每 48h 进行一次电化学检测。其它与具体实施方式一至八之一相同。 0031 通过以下试验验证本发明的有益效果 ： 0032 试验一 ： 本试验的的一种哺乳动物细胞转化的电化学检测方法是按以下步骤进行 的 ： 0033 一、 将细胞接种于 60mm 培养皿， 培养 24h 后分为三组， A 组为空白组， 记录正常细 胞的电化学行为 ； B 组以浓度为 0.8mg/L 的甲基硝基亚硝基胍 （MNNG） 为启动剂， 对细胞进 行染毒， 培养 4h 后除去 MNNG， 每 48h 进行一次电化学检测 ； C 组用浓度为 5% 的二甲基亚砜 （DMSO） 代替 MNNG 做阴性。

20、对照， 与染毒组进行同步电化学检测 ； 0034 二、 将步骤一中B组以MNNG为启动剂的细胞培养8天， 然后将细胞分两组 ： 第一组 加入浓度为 100g/L 的促进剂 TPA ； 第二组仍为 MNNG 组 ； 以步骤一中的 C 组 DMSO 组为第 三组 ； 对三组细胞每 48h 进行一次电化学检测， 当出现电化学信号 TPA 组 MNNG 组 DMSO 组 时， 即完成哺乳动物细胞转化的电化学检测方法 ； 0035 其中， 所述细胞 Balb/3T3 ； 所述的工作电极为离子液体 / 多壁碳纳米管复合修饰 电极 ； 所述的电化学检测方法为循环伏安法 ； 所述的细胞前处理方法为原位裂解法 。

21、； 所述 的电化学检测以 0.7V 和 1.1V 的双信号为指标。 0036 本试验步骤一中三组细胞培养第 4 天的伏安图如图 1 所示， 其中， a 为 A 组未加入 启动剂的细胞培养第 4 天的伏安图 ； b 为 C 组以 DMSO 为阴性对照的细胞培养第 4 天的伏安 图 ； c 为 B 组以 MNNG 为启动剂的细胞培养第 4 天的伏安图 ； 从图 1 可以看出， Balb/3T3 细 胞的两个电化学信号峰 ： 空白组 DMSO 阴性对照组 MNNG 启动剂组， 说明加入启动剂后， 细 胞 DNA 受到损伤， 细胞处于修复阶段， 分裂减慢， 活性降低， 电化学信号减弱。 说 明 书 C。

22、N 103940869 A 5 4/4 页 6 0037 本试验步骤二中三组细胞培养第 4 天的伏安图如图 2 所示， 其中， a 为第三组 DMSO 组的细胞培养第 4 天的伏安图 ； b 为第一组以 TPA 为促进剂的细胞培养第 4 天的伏安图 ； c 为第二组 MNNG 组的细胞培养第 4 天的伏安图 ； 从图 2 可以看出， Balb/3T3 细胞的两个电化 学信号峰 ： DMSO 阴性对照组 TPA 促进剂组 MNNG 启动剂组， 说明加入促进剂后， 正常细胞 开始向肿瘤细胞转化， 核苷酸代谢增强， 分裂加速， TPA 促进剂组电化学信号强于 MNNG 启动 剂组。 0038 本试验。

23、步骤二中三组细胞培养第 8 天的伏安图如图 3 所示， 其中， a 为第一组以 TPA 为促进剂的细胞培养第 8 天的伏安图 ； b 为第二组 MNNG 组的细胞培养第 8 天的伏安图 ； c 为第三组 DMSO 组的细胞培养第 8 天的伏安图 ； 从图 3 可以看出， Balb/3T3 细胞的两个电 化学信号峰 ： TPA 促进剂组 MNNG 启动剂组 DMSO 阴性对照组， 说明促进剂加入一周后， 细 胞出现永生性， 电化学信号激增。 0039 综上所述， 采用电化学法检测细胞转化， 加入启动剂 MNNG 后， 由于 DNA 出现损 伤， 细胞进行 DNA 修复， 第 4 天测得细胞电化学。

24、信号出现衰减， 即双电化学信号强度 I空白 IDMSOIMNNG； 加入促进剂 TPA 后， 由于加速了细胞转化， 细胞双电化学信号均出现增强， 即加 入 TPA 第 4 天 IDMSOITPAIMNNG， 第 8 天 ITPAIMNNGIDMSO； 说明细胞转化过程中嘌呤代谢发生显著 改变， 电化学信号与细胞转化过程具有明显相关性， 在促进剂加入第八天， 从电化学信号强 度变化即可判断细胞的转化， 电化学法检测细胞转化仅需 16 天。 说 明 书 CN 103940869 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103940869 A 7 2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 103940869 A 8 。