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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910014771.9 (22)申请日 2019.01.08 (71)申请人 中国科学院烟台海岸带研究所 地址 264003 山东省烟台市莱山区春晖路 17号 (72)发明人 李文军 杨贵兰 秦松 刘正一 王明超 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 李颖 (51)Int.Cl. C12P 21/06(2006.01) C07K 1/34(2006.01) (54)发明名称 一种降压活性肽的制备方法 (57)摘要 本发明涉及活性肽制备领域。
2、， 具体地说是一 种降压活性肽的制备方法。 以阿拉斯加鳕鱼为原 料经酶进行酶解， 酶解液灭酶后、 离心、 过滤得 500-3000D的降压肽。 本发明制备得到的阿拉斯 加鳕鱼降血压肽具有较高的ACE抑制活性， 降血 压效果好， 无毒副作用且易被人体吸收利用。 同 时， 本发明将为鳕鱼资源的综合利用提供依据， 并为进一步开发天然降血压保健品提供依据。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 109355344 A 2019.02.19 CN 109355344 A 1.一种降压活性肽的制备方法， 其特征在于： 以阿拉斯加鳕鱼为原料经酶进行酶解， 酶 解液灭酶后、 离心、 过滤得500-300。
3、0D的降压肽。 2.按权利要求1所述的降压活性肽的制备方法， 其特征在于： 阿拉斯加鳕鱼低聚肽或其 蛋白肽经水溶解， 溶解后加入酶进行酶解， 酶解液加热至沸水中灭酶、 离心、 过滤得500- 3000D的降压肽； 所述酶的添加量为每毫升原料溶解液中加入0.15-4g， 其中， 酶为菠萝蛋白 酶、 木瓜蛋白酶、 复合蛋白酶、 胰蛋白酶、 碱性蛋白酶或酸性蛋白酶。 3.按权利要求2所述的降压活性肽的制备方法， 其特征在于： 所述溶解液中加入胰蛋白酶、 碱性蛋白酶或酸性蛋白酶， 在37下酶解； 其中， 胰蛋白 酶和碱性蛋白酶的酶解体系pH为8.0， 酸性蛋白酶的的酶解体系pH为3.0。 4.按权利要。
4、求2所述的降压活性肽的制备方法， 其特征在于： 所述溶解液中加入菠萝蛋 白酶、 木瓜蛋白酶或复合蛋白酶， 在55下酶解， 其中， 上述酶解体系pH均为7.0。 5.按权利要求1-4任意一项所述的降压活性肽的制备方法， 其特征在于： 所述酶解体系 恒温酶解2-5h， 酶解后将酶解液转移至沸水中， 灭酶10 -15min， 以3000-5000r/min的速度 离心10-20min， 收集清液经2500D超滤膜超滤， 得到滤过液， 对滤过液用250D反渗膜进行反 渗， 即得到500-3000D的降压肽。 6.按权利要求2所述的降压活性肽的制备方法， 其特征在于： 所述鳕鱼低聚肽分子量为 500-1。
5、000Da； 鳕鱼蛋白多肽分子量为1000-3000Da。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109355344 A 2 一种降压活性肽的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及活性肽制备领域， 具体地说是一种降压活性肽的制备方法。 背景技术 0002 高血压是目前流行最为广泛的心血管疾病， 是危害人体健康的主要慢性疾病之 一。 在血压调控系统中， 血管紧张素转化酶 （Angiotensin-converting enzyme,ACE） 可以将 血管紧张素I水解， 生成具有升高血压作用的血管紧张素II， 它还可以水解舒缓激肽， 使其 失去降低血压的作用。 食源性蛋白降血压肽， 即血管紧。
6、张素转化酶抑制肽 （ Angiotensin I-conberting enzyme inhibitorypeptides, ACEI） 具有安全性高、 副作用小等优点， 越来 越受到青睐。 目前， 人们已从植物蛋白、 动物蛋白 、 水产蛋白 、 乳蛋白的酶解物中获得具有 ACE 抑制活性的肽片段。 海洋产物如鳕鱼对心脑血管系统具有很好的保护作用， 有利于预 防高血液、 心肌梗死等心脑血管疾病。 王海英等以来自海洋微生物的低温碱性蛋白酶为降 解工具作用于深海鳕鱼皮， 制备具有血管紧张素转换酶抑制剂活性的降血压肽 （王海英,宋 永相,孙谧.酶解鳕鱼皮制备血管紧张素转换酶抑制剂ACEI的研究J.现。
7、代食品科技,2008 (10):987-991. ） 但上述大多食品来源的降压肽不抗消化， 在体内容易被消化酶分解， 失去 对 ACE的抑制作用。 因而， 应用受到一定的限制。 发明内容 0003 本发明目的在于提供一种降压活性肽的制备方法。 0004 为实现上述目的本发明采用技术方案为： 一种降压活性肽的制备方法， 以阿拉斯加鳕鱼为原料经酶进行酶解， 酶解液灭酶后、 离 心、 过滤得500-3000D的降压肽。 0005 进一步的说， 阿拉斯加鳕鱼低聚肽或其蛋白肽经水溶解， 溶解后加入酶进行酶解， 酶解液加热至沸水中灭酶、 离心、 过滤得500-3000D的降压肽； 所述酶的添加量为每100。
8、ml原 料溶解液中加入0.15-4g， 其中， 酶为菠萝蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 复合蛋白酶、 胰蛋白酶、 碱性 蛋白酶或酸性蛋白酶。 0006 所述溶解液中加入胰蛋白酶、 碱性蛋白酶或酸性蛋白酶， 在37下酶解； 其中， 胰 蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解体系pH为8.0， 酸性蛋白酶的的酶解体系pH为3.0。 0007 所述溶解液中加入菠萝蛋白酶、 木瓜蛋白酶或复合蛋白酶， 在55下酶解， 其中， 上述酶解体系pH均为7.0。 0008 所述酶解体系恒温酶解2-5h， 酶解后将酶解液转移至沸水中， 灭酶10 -15min， 以 3000-5000r/min的速度离心10-20min， 收集清液经2。
9、500D超滤膜超滤， 得到滤过液， 对滤过 液用250D反渗膜进行反渗， 即得到500-3000D的降压肽。 0009 所述鳕鱼低聚肽分子量为500-1000Da； 鳕鱼蛋白多肽分子量为1000-3000Da。 0010 所述阿拉斯加鳕鱼低聚肽或其蛋白肽经水溶解， 获得浓度为4% （w/v） 的溶液。 0011 本发明所具有的优点： 说 明 书 1/3 页 3 CN 109355344 A 3 本发明制备得到的阿拉斯加鳕鱼降血压肽具有较高的ACE抑制活性， 降血压效果好， 无 毒副作用且易被人体吸收利用。 同时， 本发明为鳕鱼资源的综合利用提供了依据， 并为进一 步开发天然降血压保健品提供依据。
10、。 具体表现在： 本发明获得的低聚肽和多肽具有较高的ACE抑制活性， 在消化道内很难被进一步酶解， 可被直接吸收利用， 具有较好的降压活性， 为降压药物的开发奠定基础。 附图说明 0012 图1为本发明实施例提供的不同酶对阿拉斯加鳕鱼低聚肽的酶解能力图。 0013 图2为本发明实施例提供的不同酶对阿拉斯加鳕鱼蛋白肽的酶解能力图。 具体实施方式 0014 以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明， 应当指出的是， 此处所描 述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明， 并不局限于本发明。 0015 实施例1 精密称取24g分子量为500-1000Da的鳕鱼低聚肽或分子量为1000-3000D。
11、a的鳕鱼蛋白 多肽， 分别溶于600 mL的去离子水中， 搅拌使其完全溶解获得浓度为4% （W/V） 的低聚肽/蛋 白肽溶解液。 取18支50 mL离心管标记酶的种类及浓度 （6种不同的蛋白酶， 每种酶3个用 量） 。 另取500 mL大烧杯， 加入300 mL上述已配置好的浓度为4%的低聚肽/蛋白肽溶解液， 使 用氢氧化钠或盐酸溶液利用pH计调节多肽液的pH值至7.0， 精密量取pH7.0的多肽液各30 mL转移至1-6号离心管与10-12号离心管中； 再取500 mL大烧杯， 加入200 mL上述已配置好 的低聚肽/蛋白肽溶液， 使用氢氧化钠或盐酸溶液利用pH计调节多肽液的pH值至8.0，。
12、 精密 量取pH8.0的低聚肽/蛋白肽溶液各30 mL转移至1-6号离心管7-9号离心管与13-15号离心 管中； 再取100 mL烧杯， 加入100 mL上述已配置好的低聚肽/蛋白肽溶液， 使用氢氧化钠或 盐酸溶液利用pH计调节多肽液的pH值至3.0， 精密量取pH3.0的低聚肽溶液各30 mL转移至 1-6号离心管16-18号离心管中。 0016 按照上述预先标记的酶的种类 （菠萝蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 复合蛋白酶、 胰蛋白酶、 碱性蛋白酶、 酸性蛋白酶） 及相对于液体体积酶的用量 （g/100mL） ， 精密称量不同的酶加入 到不同的离心管中。 然后在各自酶的最适温度恒温酶解 （菠萝蛋白。
13、酶、 木瓜蛋白酶、 复合蛋 白酶的最适温度均为55； 胰蛋白酶、 碱性蛋白酶、 酸性蛋白酶的最适温度为37） 。 待酶解 完成后， 将水解液加热至沸水中灭酶10 min， 然后将其离心 （3000-5000r/min） 15min， 得到 上清液。 根据食物蛋白质经酶解后产生的ACE抑制肽的相对分子质量一般在1500D以下， 用 2500D超滤膜超滤， 得到滤过液， 对滤过液进行反渗 （用250D反渗膜） ， 得到的截留液一部分 经过灌装、 高压灭菌， 得到不同PH酶解体系下的500-3000D的降压肽； 将上述不同PH酶解体系下的降压肽采用紫外分光光度法对阿拉斯加鳕鱼低聚肽酶解 液上清液进行。
14、ACE抑制活性检测， 测定228 nm下的吸光度值 （A228） ， 获得各蛋白酶最佳酶解 条件 （参见表1及图1和图2） 。 0017 按下式计算其抑制率： 说 明 书 2/3 页 4 CN 109355344 A 4 其中， I： ACE活性抑制率 A0： 对照组的吸光度值 A1： 供试品的吸光度值 表1 蛋白酶最佳酶解条件 由上述可获知不同蛋白酶在各自最佳水解条件下对阿拉斯加鳕鱼低聚肽或蛋白肽酶 解获得降压肽的活性各异， 其中， 对于阿拉斯加鳕鱼低聚肽， 6种不同的酶的酶解能力大小 为： 胰蛋白酶酸性蛋白酶碱性蛋白酶木瓜蛋白酶菠萝蛋白酶复合蛋白酶； 对于阿拉斯 加鳕鱼多肽， 6种不同的酶的酶解能力大小为： 酸性蛋白酶胰蛋白酶木瓜蛋白酶复合蛋 白酶碱性蛋白酶菠萝蛋白酶。 再进一步由图1和2可见， 胰蛋白酶对阿拉斯加鳕鱼低聚肽 的酶解活性最好， 抑制率最高可达93.7%； 酸性蛋白酶对阿拉斯加鳕鱼蛋白肽的酶解活性最 好， 抑制率最高可达94%， 胰蛋白酶对其的水解能力较好， 抑制率最高可达90%。 说 明 书 3/3 页 5 CN 109355344 A 5 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 6 CN 109355344 A 6 。