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一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法.pdf

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文档编号：6141454

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1、(10)申请公布号 CN 103983605 A (43)申请公布日 2014.08.13 CN 103983605 A (21)申请号 201410231065.7 (22)申请日 2014.05.28 G01N 21/359(2014.01) G01N 21/3563(2014.01) (71)申请人河北大学地址 071002 河北省保定市五四东路 180 号 (72)发明人夏立娅李超李小亭谢飞王宝军庞艳苹陈培云魏聪聪于少龙 (74)专利代理机构石家庄国域专利商标事务所有限公司 13112 代理人苏艳肃 (54) 发明名称一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的。

2、方法 (57) 摘要本发明提供了一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法。该方法包括如下步骤：采用近红外光谱仪采集待测样本的近红外光谱数据；对所述待测样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理；选取预处理后9411.6-5446.4cm-1和 4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为 10 的条件下，采用依据偏最小二乘回归法所建立的破壁率预测模型来检测所述待测样本的破壁率。本发明具有快速、准确、无损、成本低的优点，利于推广普及，可以有效解决破壁灵芝孢子粉破壁率质量监控的问题。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页说明书。

3、9 页附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书3页说明书9页附图3页 (10)申请公布号 CN 103983605 A CN 103983605 A 1/3 页 2 1. 一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，包括如下步骤： a、采用近红外光谱仪采集待测样本的近红外光谱数据； b、对所述待测样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理； c、选取预处理后 9411.6-5446.4 cm-1和 4613.2-4243 cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为 10 的条件下，采用依据偏最小二乘回归法所建立的破壁。

4、率预测模型来检测所述待测样本的破壁率。 2. 根据权利要求 1 所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤 c 中的所述破壁率预测模型为： Y=A0+A1X1+A2X2+ A3X3+ A4X4+ A5X5+ A6X6+ A7X7+ A8X8+ A9X9+ A10X10 式中： Y 为破壁率， A0、 A1、 A10均为常数， X1为光谱数据经主成分分析降维后第一因子得分， X2为光谱数据经主成分分析降维后第二因子得分， X3为光谱数据经主成分分析降维后第三因子得分， X4为光谱数据经主成分分析降维后第四因子得分， X5为光谱数据经主成分分析降维后第五因子。

5、得分， X6为光谱数据经主成分分析降维后第六因子得分， X7 为光谱数据经主成分分析降维后第七因子得分， X8为光谱数据经主成分分析降维后第八因子得分， X9为光谱数据经主成分分析降维后第九因子得分， X10为光谱数据经主成分分析降维后第十因子得分；所述光谱数据为近红外光谱数据经预处理后 9411.6-5446.4 cm-1和 4613.2-4243 cm-1两个光谱区间的数据。 3. 根据权利要求 2 所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤 c 中的所述破壁率预测模型为： Y=0.06866X1+0.046809X2+0.019892X3+0.125。

6、289X4+0.06593X5+0.019621 X6+0.053336X7+0.018258X8+0.094993X9+0.079206X10 式中： Y 为破壁率， X1为光谱数据经主成分分析降维后第一因子得分， X2为光谱数据经主成分分析降维后第二因子得分， X3为光谱数据经主成分分析降维后第三因子得分， X4为光谱数据经主成分分析降维后第四因子得分， X5为光谱数据经主成分分析降维后第五因子得分， X6为光谱数据经主成分分析降维后第六因子得分， X7为光谱数据经主成分分析降维后第七因子得分， X8为光谱数据经主成分分析降维后第八因子得分， X9为光谱数据经主成分分析降维后第。

7、九因子得分， X10为光谱数据经主成分分析降维后第十因子得分；所述光谱数据为近红外光谱数据经预处理后9411.6-5446.4 cm-1和4613.2-4243 cm-1两个光谱区间的数据。 4. 根据权利要求 1 所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤 a 具体包括如下步骤： a1、将所述待测样本在 30下烘干 48 小时，然后装入样品杯中； a2、采用傅里叶近红外光谱仪以漫反射模式扫描待测样本，获得待测样本在 12500-4000 cm-1范围内的光谱数据；所述傅里叶近红外光谱仪的扫描分辨率为 8 cm-1； a3、扫描待测样品 3。

8、2 次后取平均值。 5. 根据权利要求 1 所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤 c 中所述破壁率预测模型的具体构建方法如下： c1、选取若干具有不同破壁率的破壁灵芝孢子粉作为建立破壁率预测模型所需的训练样本；权利要求书 CN 103983605 A 2 2/3 页 3 c2、采用近红外光谱仪采集所述训练样本的近红外光谱数据； c3、采用血球计数板法检测所述训练样本的破壁率，以作为建立破壁率预测模型所需的训练样本破壁率参考值； c4、对所述训练样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理，选取预处理后 9411.6-5446.4。

9、 cm-1和 4613.2-4243 cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为 10 的条件下，结合所述训练样本破壁率参考值，采用偏最小二乘回归法建立破壁率预测模型。 6. 根据权利要求 5 所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤c4中9411.6-5446.4 cm-1和4613.2-4243 cm-1两个光谱区间的选取过程具体如下：根据所述近红外光谱数据主成分分析的前三个因子的载荷图，选择载荷值较大的若干个光谱区间，之后通过优化选择得出 9411.6-5446.4 cm-1和 4613.2-4243 cm-1两个光谱区间。 7. 根据权利要求。

10、 5 所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤 c2 具体包括如下步骤： c21、将所述训练样本在 30下烘干 48 小时，然后装入样品杯中； c22、采用傅里叶近红外光谱仪以漫反射模式扫描训练样本，获得各训练样本在 12500-4000 cm-1范围内的光谱数据；所述傅里叶近红外光谱仪的扫描分辨率为 8 cm-1； c23、对每个训练样品扫描 32 次后取平均值。 8. 根据权利要求 5 所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤 c3 具体包括如下步骤： c31、分别称取在 60下烘干 5h 后的未破壁灵芝孢子。

11、粉 0.01g、 0.02g、 0.03g、 0.04g 和 0.05g，然后分别装入 5 个比色管中； c32、分别称取5份经过研磨后再经100目筛筛选后的蔗糖粉末各1.25g，将5份蔗糖粉末分别加入所述步骤 c31 中的 5 个比色管中，使加入的蔗糖粉末与相应比色管中的灵芝孢子粉混合至色泽均一； c33、向各比色管中加入蒸馏水以溶解相应比色管内的蔗糖粉末与灵芝孢子粉，之后向各比色管中加入 0.2 mL 吐温 80，接着用蒸馏水将各比色管定容至 25 mL ； c34、在室温下使各比色管超声震荡 30min，期间每隔 10min 对各比色管进行若干次的手动摇晃，。

12、使各比色管内的灵芝孢子粉充分分散； c35、从每一比色管内分别吸取 8.0 L 灵芝孢子粉悬浮液于 5 个不同的盖玻片的边缘，利用吸虹现象使相应盖玻片下方的血球计数板网格中充满对应的灵芝孢子粉悬浮液； c36、静置 30s 后，采用 400 倍放大倍数的光学显微镜分别对各血球计数板上 4 个顶角及中央共 5 个中格中含完整灵芝孢子粉的个数进行统计，对每个血球计数板观察统计 5 次后取平均值； c37、以所述步骤 c1 中所称取的 5 份未破壁灵芝孢子粉的质量为横坐标，以所述步骤 c36 中所统计的各血球计数板上 5 个中格中含完整灵芝孢子粉的个数为纵坐标，制作未破。

13、壁灵芝孢子粉质量与个数的标准曲线； c38、分别称取每一在 60下烘干 5h 后的训练样本 0.04g，放入不同的比色管中；按照所述步骤c32c36分别统计每一训练样本对应的血球计数板上5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数；权利要求书 CN 103983605 A 3 3/3 页 4 c39、从所述步骤c37中所绘制的标准曲线中查找质量为0.04g未破壁灵芝孢子粉所对应的完整灵芝孢子粉的个数 NA，依据公式计算得出每一训练样本的破壁率；式中： X 为训练样本的破壁率， NB为所述步骤 c38 中所统计的训练样本对应的血球计数板上 5 个中格中含完整灵芝孢。

14、子粉的个数。权利要求书 CN 103983605 A 4 1/9 页 5 一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法技术领域 0001 本发明涉及一种真菌孢子破壁率的检测方法，具体地说是一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法。背景技术 0002 灵芝孢子粉是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞，即灵芝的种子。它凝聚了灵芝的精华，具有灵芝的全部遗传物质和保健作用。灵芝孢子粉的外壳包括两层由十分坚硬的几丁质纤维素构成的孢壁；孢壁质地坚硬，具有耐酸抗碱、耐压抗热、耐酶抗消化等性质，因此，孢壁的存在使得灵芝孢子粉内的有效物质很难。

15、被人体吸收。通过人为的机械、物理化学方法或者生物酶解法，将灵芝孢子粉的孢壁破碎或者消除之后，由孢壁所紧裹的有效成分才能最大程度地被人体肠胃直接吸收。有资料表明，破壁后的灵芝孢子粉有利于三萜、粗多糖、粗脂肪等成分的溶出，其中粗多糖含量比未破壁灵芝孢子粉高出 70。若直接食用未破壁的灵芝孢子粉，人体仅能利用 12左右的有效成分，而服用破壁后的灵芝孢子粉，有效成分利用率可达 95以上。因此，破壁灵芝孢子粉的破壁率的大小就是能否最大程度上利用灵芝孢子粉有效成分的关键所在。对于市场上众多的破壁灵芝孢子粉，破壁率常被作为衡量这种产品质量的重要指标。 0003 目前，。

16、破壁灵芝孢子粉的破壁率测定主要参考农业部标准 NY/T1677-2008 破壁灵芝孢子粉破壁率的测定以及国家标准 GB/T29344-2012 灵芝孢子粉采收及加工技术规范附录 A“破壁灵芝孢子粉破壁率的测定方法” 。在这两个标准中，破壁率测定原理都是通过血球计数板对未破壁的孢子进行计数，分别计算出单位质量未破壁灵芝孢子粉中完整孢子的数量和单位质量破壁灵芝孢子粉中完整孢子的数量，从而获得破壁灵芝孢子粉的破壁率。这种分析方法的操作过程复杂，测定时间较长，血球计数板的制样和计数过程容易产生误差，对于操作者的熟练程度要求较高。 0004 除血球计数板法外，目前公开报。

17、道的破壁率的测定方法还有水装片结合显微技术检测方法、悬浮法结合物理技术检测方法以及化学指纹检测方法等。其中，化学指纹检测方法突破了人为计数的限制，从成分上对破壁灵芝孢子粉破壁率的检测方式进行了重新定义。由于目前色谱技术的发展，用成分含量的分析方法测定破壁率已不成问题，并且其准确率能够得到充分保证；但成分分析方法的检测步骤复杂，所用仪器昂贵，样品遭到破坏，检测成本较高。发明内容 0005 本发明的目的就是提供一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，以解决现有的检测方法步骤复杂、成本高以及易使样品遭到破坏的问题。 0006 本发明是这样实现的：一种快。

18、速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，包括如下步骤： 0007 a、采用近红外光谱仪采集待测样本的近红外光谱数据；说明书 CN 103983605 A 5 2/9 页 6 0008 b、对所述待测样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理； 0009 c、选取预处理后 9411.6-5446.4cm-1和 4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为 10 的条件下，采用依据偏最小二乘回归法所建立的破壁率预测模型来检测所述待测样本的破壁率。 0010 所述步骤 c 中的所述破壁率预测模型为： 0011 Y A0+A1X1+A2X2+A3X3+A4。

19、X4+A5X5+A6X6+A7X7+A8X8+A9X9+A10X10 0012 式中： Y 为破壁率， A0、 A1、 A10均为常数， X1为光谱数据经主成分分析降维后第一因子得分， X2为光谱数据经主成分分析降维后第二因子得分， X3为光谱数据经主成分分析降维后第三因子得分， X4为光谱数据经主成分分析降维后第四因子得分， X5为光谱数据经主成分分析降维后第五因子得分， X6为光谱数据经主成分分析降维后第六因子得分， X7为光谱数据经主成分分析降维后第七因子得分， X8为光谱数据经主成分分析降维后第八因子得分， X9为光谱数据经主成分分析降维后第九因子得分， X10为光谱数据经主。

20、成分分析降维后第十因子得分；所述光谱数据为近红外光谱数据经预处理后 9411.6-5446.4cm-1和 4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据。 0013 所述步骤 c 中的所述破壁率预测模型为： 0014 Y0.06866X1+0.046809X2+0.019892X3+0.125289X4+0.06593X5+0.019 621X6+0.053336X7+0.018258X8+0.094993X9+0.079206X10 0015 式中： Y 为破壁率， X1为光谱数据经主成分分析降维后第一因子得分， X2为光谱数据经主成分分析降维后第二因子得分， X3为光谱数据经。

21、主成分分析降维后第三因子得分， X4 为光谱数据经主成分分析降维后第四因子得分， X5为光谱数据经主成分分析降维后第五因子得分， X6为光谱数据经主成分分析降维后第六因子得分， X7为光谱数据经主成分分析降维后第七因子得分， X8为光谱数据经主成分分析降维后第八因子得分， X9为光谱数据经主成分分析降维后第九因子得分， X10为光谱数据经主成分分析降维后第十因子得分；所述光谱数据为近红外光谱数据经预处理后9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据。 0016 所述步骤 a 具体包括如下步骤： 0017 a1、将所述待测样本在 30下烘。

22、干 48 小时，然后装入样品杯中； 0018 a2、采用傅里叶近红外光谱仪以漫反射模式扫描待测样本，获得待测样本在 12500-4000cm-1范围内的光谱数据；所述傅里叶近红外光谱仪的扫描分辨率为 8cm-1； 0019 a3、扫描待测样品 32 次后取平均值。 0020 所述步骤 c 中所述破壁率预测模型的具体构建方法如下： 0021 c1、选取若干具有不同破壁率的破壁灵芝孢子粉作为建立破壁率预测模型所需的训练样本； 0022 c2、采用近红外光谱仪采集所述训练样本的近红外光谱数据； 0023 c3、采用血球计数板法检测所述训练样本的破壁率，以作为建立破壁率预。

23、测模型所需的训练样本破壁率参考值； 0024 c4、对所述训练样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理，选取预处理后 9411.6-5446.4cm-1和 4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为 10 的条件下，结合所述训练样本破壁率参考值，采用偏最小二乘回归法建立破壁率预测模型。说明书 CN 103983605 A 6 3/9 页 7 0025 所述步骤 c4 中 9411.6-5446.4cm-1和 4613.2-4243cm-1两个光谱区间的选取过程具体如下： 0026 根据所述近红外光谱数据主成分分析的前三个因子的载荷图，选择载荷值较。

24、大的若干个光谱区间，之后通过优化选择得出 9411.6-5446.4cm-1和 4613.2-4243cm-1两个光谱区间。 0027 所述步骤 c2 具体包括如下步骤： 0028 c21、将所述训练样本在 30下烘干 48 小时，然后装入样品杯中； 0029 c22、采用傅里叶近红外光谱仪以漫反射模式扫描训练样本，获得各训练样本在 12500-4000cm-1范围内的光谱数据；所述傅里叶近红外光谱仪的扫描分辨率为 8cm-1； 0030 c23、对每个训练样品扫描 32 次后取平均值。 0031 所述步骤 c3 具体包括如下步骤： 0032 c31、分别称取在 6。

25、0下烘干 5h 后的未破壁灵芝孢子粉 0.01g、 0.02g、 0.03g、 0.04g 和 0.05g，然后分别装入 5 个比色管中； 0033 c32、分别称取5份经过研磨后再经100目筛筛选后的蔗糖粉末各1.25g，将5份蔗糖粉末分别加入所述步骤 c31 中的 5 个比色管中，使加入的蔗糖粉末与相应比色管中的灵芝孢子粉混合至色泽均一； 0034 c33、向各比色管中加入蒸馏水以溶解相应比色管内的蔗糖粉末与灵芝孢子粉，之后向各比色管中加入 0.2mL 吐温 80，接着用蒸馏水将各比色管定容至 25mL ； 0035 c34、在室温下使各比色管超声震荡 30min。

26、，期间每隔 10min 对各比色管进行若干次的手动摇晃，使各比色管内的灵芝孢子粉充分分散； 0036 c35、从每一比色管内分别吸取 8.0L 灵芝孢子粉悬浮液于 5 个不同的盖玻片的边缘，利用吸虹现象使相应盖玻片下方的血球计数板网格中充满对应的灵芝孢子粉悬浮液； 0037 c36、静置 30s 后，采用 400 倍放大倍数的光学显微镜分别对各血球计数板上 4 个顶角及中央共 5 个中格中含完整灵芝孢子粉的个数进行统计，对每个血球计数板观察统计 5 次后取平均值； 0038 c37、以所述步骤c1中所称取的5份未破壁灵芝孢子粉的质量为横坐标，以所述步骤 c36。

27、中所统计的各血球计数板上 5 个中格中含完整灵芝孢子粉的个数为纵坐标，制作未破壁灵芝孢子粉质量与个数的标准曲线； 0039 c38、分别称取每一在 60下烘干 5h 后的训练样本 0.04g，放入不同的比色管中；按照所述步骤 c32 c36 分别统计每一训练样本对应的血球计数板上 5 个中格中含完整灵芝孢子粉的个数； 0040 c39、从所述步骤c37中所绘制的标准曲线中查找质量为0.04g未破壁灵芝孢子粉所对应的完整灵芝孢子粉的个数 NA，依据公式 0041 0042 计算得出每一训练样本的破壁率；式中： X 为训练样本的破壁率， NB为所述步骤 c38 中所。

28、统计的训练样本对应的血球计数板上 5 个中格中含完整灵芝孢子粉的个数。 0043 采用本发明检测破壁灵芝孢子粉的破壁率时，由于近红外光谱仪采集光谱数据的说明书 CN 103983605 A 7 4/9 页 8 时间很短，对光谱数据进行预处理以及采用偏最小二乘回归法进行运算处理的时间也很短，因此可很方便、迅速地检测出待测样本的破壁率，且不会使待测样本遭到破坏，解决了目前破壁灵芝孢子粉破壁率检测过程中所存在的操作过程复杂、样品易被破坏、人为不稳定因素较多、重复性差等的问题。 0044 对利用本发明进行检测后的待测样本，再利用传统的血球计数板的方法进行破壁率的检测，。

29、将两者的检测结果进行比较，结果表明，两种方法测定的破壁率非常接近，相对偏差在 0.7-8.6之间，说明本发明所建立的无损检测方法准确可靠。 0045 灵芝孢子粉作为高端保健品，其价格一直居高不下。本发明应用近红外光谱技术和多元统计学方法对破壁灵芝孢子粉破壁率进行快速无损检测，可极大地降低检测成本，提高检测速度，利于产品的质量监控。附图说明 0046 图 1 是本发明训练样本的近红外光谱图。 0047 图 2 是本发明实施例中未破壁灵芝孢子粉的显微照片。 0048 图 3 是本发明中未破壁灵芝孢子粉质量与个数的标准曲线。 0049 图 4 是本发明实施例中训练样本的显微照。

30、片。 0050 图 5 是本发明实施例中训练样本的近红外光谱主成分的前三个因子的载荷图。 0051 图 6 是采用本发明检测训练样本得出的预测值与采用血球计数板法检测训练样本得出的参考值之间的相关性图。 0052 图 7 是本发明实施例中待测样本的近红外光谱数据经预处理后的光谱图。具体实施方式 0053 本发明对待测破壁灵芝孢子粉进行破壁率检测时，首先采用近红外光谱仪采集待测样本的近红外光谱数据；之后对所采集的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理；接着选取预处理后 9411.6-5446.4cm-1和 4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为 10 的条。

31、件下，采用依据偏最小二乘回归法所建立的破壁率预测模型来检测待测样本的破壁率。 0054 所建立的破壁率预测模型为： 0055 Y A0+A1X1+A2X2+A3X3+A4X4+A5X5+A6X6+A7X7+A8X8+A9X9+A10 X10(1) 0056 式 (1) 中： Y 为破壁率， A0、 A1、 A10均为常数， X1为光谱数据经主成分分析降维后第一因子得分， X2为光谱数据经主成分分析降维后第二因子得分， X3为光谱数据经主成分分析降维后第三因子得分， X4为光谱数据经主成分分析降维后第四因子得分， X5为光谱数据经主成分分析降维后第五因子得分， X6为光谱数据经主成分。

32、分析降维后第六因子得分， X7为光谱数据经主成分分析降维后第七因子得分， X8为光谱数据经主成分分析降维后第八因子得分， X9为光谱数据经主成分分析降维后第九因子得分， X10为光谱数据经主成分分析降维后第十因子得分；所述光谱数据为近红外光谱数据经预处理后 9411.6-5446.4cm-1和 4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据。 0057 下面对本发明中破壁率预测模型的建立、所建立的破壁率预测模型的具体形式及说明书 CN 103983605 A 8 5/9 页 9 近红外光谱数据的采集等内容进行详细描述。 0058 采用偏最小二乘回归法建立破壁率预测模型，具。

33、体包括如下步骤： 0059 a、选取若干具有不同破壁率的破壁灵芝孢子粉作为建立破壁率预测模型所需的训练样本。 0060 b、采用近红外光谱仪采集训练样本的近红外光谱数据。 0061 首先将步骤 a 中所选取的若干训练样本在 30下烘干 48 小时，然后将每一训练样本分别装入一个样品杯中。之后采用德国 BRUKER 公司 MPA 型傅里叶近红外光谱仪以漫反射模式分别扫描各样品杯内的训练样本，获得各训练样本在 12500-4000cm-1范围内的光谱数据。每次扫描前应对傅里叶近红外光谱仪的噪声、波长准确度和重现性进行诊断；傅里叶近红外光谱仪的扫描分辨率为 8cm-1，。

34、对每一训练样本扫描 32 次后取平均值。采用相关软件对所采集的各训练样本的近红外光谱数据 ( 平均值 ) 进行处理，可得出每一训练样本的近红外光谱图。参考图 1，图 1 示出了各训练样本的近红外光谱图。由图 1 可看出，不同破壁率的破壁灵芝孢子粉的近红外光谱图看起来相差不大，因此不能从谱图上直接进行分析，而是需要对所采集的近红外光谱数据进行预处理，之后才能依据预处理后的光谱数据采用偏最小二乘回归法建立破壁率预测模型来实现无损检测破壁灵芝孢子粉的破壁率。具体预处理方法以及采用偏最小二乘回归法建立破壁率预测模型可参见步骤 d。 0062 c、采用血球计数板法检测训练样本。

35、的破壁率，以作为建立破壁率预测模型所需的训练样本破壁率参考值。 0063 该步骤又可包括样品 ( 未破壁灵芝孢子粉 ) 稀释、制片、计数、绘制标准曲线及训练样本破壁率的计算几个步骤，具体如下： 0064 c1、采用梅特勒 - 托利多仪器 ( 上海 ) 有限公司的 AR1140 型电子天平 ( 精度为 0.1mg) 分别准确称取在 60 (1 ) 下烘干 5h 后的未破壁灵芝孢子粉 0.01g、 0.02g、 0.03g、 0.04g 和 0.05g，将所称取的 5 份未破壁灵芝孢子粉分别装入 5 个 25mL 的比色管中。烘干时所用仪器为北京鸿达天矩 DHG-9023A 。

36、型恒温鼓风干燥箱。 0065 c2、采用步骤 c1 中所用电子天平分别称取 5 份经过研磨后再经 100 目筛筛选后的蔗糖粉末各1.25g，将5份蔗糖粉末分别加入步骤c1中的5个比色管中，使加入的蔗糖粉末与相应比色管中的灵芝孢子粉混合至色泽均一。 0066 c3、向各比色管中加入蒸馏水以溶解相应比色管内的蔗糖粉末与灵芝孢子粉，之后向各比色管中加入 0.2mL 吐温 80，接着用蒸馏水将各比色管定容至 25mL。 0067 c4、采用上海易净超声波仪器有限公司的 YQ-220D 超声波清洗器，在室温下使各比色管超声震荡 30min，期间每隔 10min 对各比色管进行若。

37、干次的手动摇晃，使各比色管内的灵芝孢子粉充分分散。 0068 c5、从每一比色管内各吸取 8.0L 灵芝孢子粉悬浮液，分别将 5 份 8.0L 的灵芝孢子粉悬浮液滴在 5 个盖玻片的边缘，利用吸虹现象使相应盖玻片下方的血球计数板网格中充满对应的灵芝孢子粉悬浮液。 0069 在从每一比色管内吸取灵芝孢子粉悬浮液之前，可通过手摇比色管，使比色管内的灵芝孢子粉分散均匀，之后立刻吸取 8.0L 灵芝孢子粉悬浮液。将从 5 个比色管中所吸取的不同的灵芝孢子粉悬浮液分别滴于 5 个盖玻片的边缘，每一盖玻片的下方设置有一血球计数板，即：盖玻片盖在血球计数板上方；通过吸虹。

38、现象可使每一血球计数板网格中充说明书 CN 103983605 A 9 6/9 页 10 满相应的灵芝孢子粉悬浮液。血球计数板上的网格包括 25 个中格，每一中格又分成 16 个小格。 0070 c6、使每一灵芝孢子粉悬浮液在相应的血球计数板网格中静置 30s，之后采用 OLYMPUS 公司的 BX51 系统光学显微镜，在 400 倍放大倍数下对各血球计数板上 4 个顶角及中央共5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数进行观察计数。参考图2，图2示出了其中一个血球计数板上未破壁灵芝孢子粉 ( 对应 0.04g 未破壁灵芝孢子粉 ) 的显微照片，由图中可看出，每一灵芝孢子粉。

39、均呈椭圆形粒状，即未经破壁的灵芝孢子粉。 0071 在对血球计数板上 5 个中格中所含完整灵芝孢子粉的个数进行统计时，如果有部分灵芝孢子粉处于中格的边线上，计数时应统计位于中格四个边线的其中两个相邻边线上的灵芝孢子粉的个数。统计过程中应去掉离群较大的值，对每个血球计数板上 5 个中格中所含完整灵芝孢子粉的个数进行有效观察计数 5 次，然后算其平均值。 0072 c7、以步骤 c1 中所称取的 5 份未破壁灵芝孢子粉的质量为横坐标，以步骤 c6 中所统计的各血球计数板上 5 个中格中含完整灵芝孢子粉的个数为纵坐标，制作未破壁灵芝孢子粉质量与个数的标准曲线，具体见图 3。

40、，图 3 所示标准曲线的拟合方程为 y 1706.6x 2.0173，线性相关系数为 R2 0.999 ；由图 3 可看出，未破壁灵芝孢子粉的质量与个数是成正比的，质量越大，其所含完整灵芝孢子粉的个数越多。 0073 c8、使所有的训练样本均在 60下烘干 5h，之后分别称取每一烘干后的训练样本 0.04g，将所称取的不同的训练样本分别放入不同的比色管中；按照步骤 c2 c6 分别统计每一训练样本对应的血球计数板上5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数。参考图4，图中示出了其中一个训练样本在光学显微镜下的显微照片，由图可看出，训练样本中的灵芝孢子粉很多都已经破碎。

41、，从而形成大小不一的粉粒状结构，通过统计所残留的完整的灵芝孢子粉的个数，可计算训练样本的破壁率。 0074 c9、从步骤c7中所绘制的标准曲线中查找质量为0.04g未破壁灵芝孢子粉所对应的完整灵芝孢子粉的个数 NA，依据公式 0075 0076 计算得出每一训练样本的破壁率；式 (2) 中： X 为训练样本的破壁率， NB为步骤 c8 中所统计的训练样本对应的血球计数板上 5 个中格中含完整灵芝孢子粉的个数。 0077 所计算出来的所有训练样本的破壁率值作为建立破壁率预测模型所需的训练样本破壁率参考值。 0078 d、对训练样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理，。

42、选取预处理后 9411.6-5446.4cm-1和 4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为 10 的条件下，结合训练样本破壁率参考值，采用偏最小二乘回归法建立破壁率预测模型。 0079 常用的近红外光谱数据预处理方法有多元散射校正法、一阶导数法、矢量归一化法、二阶导数法、减去一条直线法、消除常熟偏移量法等多种。为了建立最佳的破壁率预测模型，应选择一种最优的预处理方法；该最优的预处理方法，应能最多的保留各训练样本的原始信息，还能减少光谱数据受训练样本不均匀、光散射和仪器的随机噪音等因素的影响，提高模型的预测精度和稳定性。 0080 除了。

43、选取最优的预处理方法之外，还应优化选择特征光谱区间和因子数。说明书 CN 103983605 A 10 7/9 页 11 0081 近红外光谱是12500-4000cm-1的光谱区间，其主要反映含氢集团(如C-H、 N-H、 O-H 等 ) 的倍频与合频吸收信息。选取与破壁灵芝孢子粉破壁率关系密切的特征光谱区间是提高预测模型准确度的有效方法。 0082 本发明特征光谱区间的选择摒弃了全波段内逐段代入的办法，依据主成分分析前三个因子的载荷图 ( 见图 5)，选择载荷值较大的几个光谱区间 (9411.6-5446.4cm-1、 4613.2-4243cm -1、 7513.9-6。

44、094.4cm-1、 5461.8-4243cm-1、 7436.7-5446.3cm-1、 7513.9-5446.4cm-1) 进行优化选择，从而极大地减少特征光谱区间选择的工作量。 0083 在偏最小二乘回归分析中，庞大的数据矩阵将会减少到仅仅几个因子。因子数目太少将丢掉较多的信息，而因子数目太大则会过度拟合，因此选取合适的因子数是非常必要的。 0084 通过正交试验，分别对不同近红外光谱数据预处理方法、特征光谱区间和因子数进行对比，对比结果见表 1，结果表明，对近红外光谱数据采用多元散射校正预处理方法，在 9411.6-5446.4cm-1和 4613.2-4。

45、243cm-1两个光谱区间内选取数据，因子数为 10 时，交互验证均方根误差 (RMSECV) 最小，即此时采用偏最小二乘回归法所建立的用来预测破壁灵芝孢子粉破壁率的模型性能最佳，该最佳模型的具体表达式为： 0085 A0 0 ； 0086 Y0.06866X1+0.046809X2+0.019892X3+0.125289X4+0.06593X5+0.019 621X6+0.053336X7+0.018258X8+0.094993X9+0.079206X10 (3) 0087 式 (3) 中： Y 为破壁率， X1为光谱数据经主成分分析降维后第一因子得分， X2为光谱数据经主。

46、成分分析降维后第二因子得分， X3为光谱数据经主成分分析降维后第三因子得分， X4为光谱数据经主成分分析降维后第四因子得分， X5为光谱数据经主成分分析降维后第五因子得分， X6为光谱数据经主成分分析降维后第六因子得分， X7为光谱数据经主成分分析降维后第七因子得分， X8为光谱数据经主成分分析降维后第八因子得分， X9为光谱数据经主成分分析降维后第九因子得分， X10为光谱数据经主成分分析降维后第十因子得分；所述光谱数据为近红外光谱数据经预处理后9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据。 0088 在该条件下，灵芝孢子粉的破壁率在。

47、20.0-99.0范围内时，破壁率预测值与参考值相关性为 R2 99.8， RMSECV 1.39( 见图 6)。 0089 表 1 偏最小二乘回归法检测破壁灵芝孢子粉破壁率的条件优化结果 0090 说明书 CN 103983605 A 11 8/9 页 12 0091 破壁率预测模型构建成功后，在需要对待测样本进行破壁率的检测时，只需采用近红外光谱仪采集待测样本的近红外光谱数据，对待测样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理，选取预处理后9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为 10 的条件下，采用上述所建立的。

48、破壁率预测模型检测待测样本的破壁率。 0092 本实施例中选取 14 个待测样本，将 14 个待测样本均在 30下烘干 48 小时，然后分别装入不同的样品杯中；采用傅里叶近红外光谱仪以漫反射模式扫描各样品杯内的待测样本，获得各待测样本在 12500-4000cm-1范围内的光谱数据，傅里叶近红外光谱仪的扫描分辨率为 8cm-1；对每一待测样品扫描 32 次后取平均值。 0093 将 14 个待测样本的近红外光谱数据 ( 平均值 ) 首先进行多元散射校正预处理，参考图 7，图 7 示出了样品编号为 P01 的待测样本的近红外光谱数据经多元散射校正预处理后的谱图；图中区间 A 即为 9411.6-5446.4cm-1的光谱区间，区间 B 即为 4613.2-4243cm-1 的光谱区间。对待测样本的近红外光谱数据进行预处理后，从预处理后的数据中选取位于 9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1光谱区间内的数据，选因子数为10，利用偏最小二乘回归法得出所选光谱数据经主成分分析降维后的前十个因子得分，即得出 X1、 X2、 X10，将 X1、 X2、 X10代入式 (3) 中，即可检测出待测样本的破壁率。 0094 为了验证本发明检测破壁率的准确度，在采用本发明对 14 个待测样本的破壁率。

摘要
申请专利号：	CN201410231065.7	申请日：	2014.05.28
公开号：	CN103983605A	公开日：	2014.08.13
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/359申请日:20140528\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N21/359(2014.01)I; G01N21/3563(2014.01)I	主分类号：	G01N21/359
申请人：	河北大学
发明人：	夏立娅; 李超; 李小亭; 谢飞; 王宝军; 庞艳苹; 陈培云; 魏聪聪; 于少龙
地址：	071002 河北省保定市五四东路180号
优先权：
专利代理机构：	石家庄国域专利商标事务所有限公司 13112	代理人：	苏艳肃
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内容摘要

本发明提供了一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法。该方法包括如下步骤：采用近红外光谱仪采集待测样本的近红外光谱数据；对所述待测样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理；选取预处理后9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为10的条件下，采用依据偏最小二乘回归法所建立的破壁率预测模型来检测所述待测样本的破壁率。本发明具有快速、准确、无损、成本低的优点，利于推广普及，可以有效解决破壁灵芝孢子粉破壁率质量监控的问题。

权利要求书

权利要求书
1.  一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，包括如下步骤：
a、采用近红外光谱仪采集待测样本的近红外光谱数据；
b、对所述待测样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理；
c、选取预处理后9411.6-5446.4 cm-1和4613.2-4243 cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为10的条件下，采用依据偏最小二乘回归法所建立的破壁率预测模型来检测所述待测样本的破壁率。

2.  根据权利要求1所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤c中的所述破壁率预测模型为：
Y=A0+A1×X1+A2×X2+ A3×X3+ A4×X4+ A5×X5+ A6×X6+ A7×X7+ A8×X8+ A9×X9+ A10×X10
式中：Y为破壁率，A0、A1、……、A10均为常数，X1为光谱数据经主成分分析降维后第一因子得分，X2为光谱数据经主成分分析降维后第二因子得分，X3为光谱数据经主成分分析降维后第三因子得分，X4为光谱数据经主成分分析降维后第四因子得分，X5为光谱数据经主成分分析降维后第五因子得分，X6为光谱数据经主成分分析降维后第六因子得分，X7为光谱数据经主成分分析降维后第七因子得分，X8为光谱数据经主成分分析降维后第八因子得分，X9为光谱数据经主成分分析降维后第九因子得分，X10为光谱数据经主成分分析降维后第十因子得分；所述光谱数据为近红外光谱数据经预处理后9411.6-5446.4 cm-1和4613.2-4243 cm-1两个光谱区间的数据。

3.  根据权利要求2所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤c中的所述破壁率预测模型为：
Y=0.06866×X1+0.046809×X2+0.019892×X3+0.125289×X4+0.06593×X5+0.019621×X6+0.053336×X7+0.018258×X8+0.094993×X9+0.079206×X10
式中：Y为破壁率，X1为光谱数据经主成分分析降维后第一因子得分，X2为光谱数据经主成分分析降维后第二因子得分，X3为光谱数据经主成分分析降维后第三因子得分，X4为光谱数据经主成分分析降维后第四因子得分，X5为光谱数据经主成分分析降维后第五因子得分，X6为光谱数据经主成分分析降维后第六因子得分，X7为光谱数据经主成分分析降维后第七因子得分，X8为光谱数据经主成分分析降维后第八因子得分，X9为光谱数据经主成分分析降维后第九因子得分，X10为光谱数据经主成分分析降维后第十因子得分；所述光谱数据为近红外光谱数据经预处理后9411.6-5446.4 cm-1和4613.2-4243 cm-1两个光谱区间的数据。

4.  根据权利要求1所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤a具体包括如下步骤：
a1、将所述待测样本在30℃下烘干48小时，然后装入样品杯中；
a2、采用傅里叶近红外光谱仪以漫反射模式扫描待测样本，获得待测样本在12500-4000 cm-1范围内的光谱数据；所述傅里叶近红外光谱仪的扫描分辨率为8 cm-1；
a3、扫描待测样品32次后取平均值。

5.  根据权利要求1所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤c中所述破壁率预测模型的具体构建方法如下：
c1、选取若干具有不同破壁率的破壁灵芝孢子粉作为建立破壁率预测模型所需的训练样本；
c2、采用近红外光谱仪采集所述训练样本的近红外光谱数据；
c3、采用血球计数板法检测所述训练样本的破壁率，以作为建立破壁率预测模型所需的训练样本破壁率参考值；
c4、对所述训练样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理，选取预处理后9411.6-5446.4 cm-1和4613.2-4243 cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为10的条件下，结合所述训练样本破壁率参考值，采用偏最小二乘回归法建立破壁率预测模型。

6.  根据权利要求5所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤c4中9411.6-5446.4 cm-1和4613.2-4243 cm-1两个光谱区间的选取过程具体如下：
根据所述近红外光谱数据主成分分析的前三个因子的载荷图，选择载荷值较大的若干个光谱区间，之后通过优化选择得出9411.6-5446.4 cm-1和4613.2-4243 cm-1两个光谱区间。

7.  根据权利要求5所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤c2具体包括如下步骤：
c21、将所述训练样本在30℃下烘干48小时，然后装入样品杯中；
c22、采用傅里叶近红外光谱仪以漫反射模式扫描训练样本，获得各训练样本在12500-4000 cm-1范围内的光谱数据；所述傅里叶近红外光谱仪的扫描分辨率为8 cm-1；
c23、对每个训练样品扫描32次后取平均值。

8.  根据权利要求5所述的快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，其特征是，所述步骤c3具体包括如下步骤：
c31、分别称取在60℃下烘干5h后的未破壁灵芝孢子粉0.01g、0.02g、0.03g、0.04g和0.05g，然后分别装入5个比色管中；
c32、分别称取5份经过研磨后再经100目筛筛选后的蔗糖粉末各1.25g，将5份蔗糖粉末分别加入所述步骤c31中的5个比色管中，使加入的蔗糖粉末与相应比色管中的灵芝孢子粉混合至色泽均一；
c33、向各比色管中加入蒸馏水以溶解相应比色管内的蔗糖粉末与灵芝孢子粉，之后向各比色管中加入0.2 mL吐温80，接着用蒸馏水将各比色管定容至25 mL；
c34、在室温下使各比色管超声震荡30min，期间每隔10min对各比色管进行若干次的手动摇晃，使各比色管内的灵芝孢子粉充分分散；
c35、从每一比色管内分别吸取8.0 μL灵芝孢子粉悬浮液于5个不同的盖玻片的边缘，利用吸虹现象使相应盖玻片下方的血球计数板网格中充满对应的灵芝孢子粉悬浮液；
c36、静置30s后，采用400倍放大倍数的光学显微镜分别对各血球计数板上4个顶角及中央共5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数进行统计，对每个血球计数板观察统计5次后取平均值；
c37、以所述步骤c1中所称取的5份未破壁灵芝孢子粉的质量为横坐标，以所述步骤c36中所统计的各血球计数板上5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数为纵坐标，制作未破壁灵芝孢子粉质量与个数的标准曲线；
c38、分别称取每一在60℃下烘干5h后的训练样本0.04g，放入不同的比色管中；按照所述步骤c32~c36分别统计每一训练样本对应的血球计数板上5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数；
c39、从所述步骤c37中所绘制的标准曲线中查找质量为0.04g未破壁灵芝孢子粉所对应的完整灵芝孢子粉的个数NA，依据公式

计算得出每一训练样本的破壁率；式中：X为训练样本的破壁率，NB为所述步骤c38中所统计的训练样本对应的血球计数板上5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数。

说明书

说明书一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法
技术领域
本发明涉及一种真菌孢子破壁率的检测方法，具体地说是一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法。
背景技术
灵芝孢子粉是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞，即灵芝的种子。它凝聚了灵芝的精华，具有灵芝的全部遗传物质和保健作用。灵芝孢子粉的外壳包括两层由十分坚硬的几丁质纤维素构成的孢壁；孢壁质地坚硬，具有耐酸抗碱、耐压抗热、耐酶抗消化等性质，因此，孢壁的存在使得灵芝孢子粉内的有效物质很难被人体吸收。通过人为的机械、物理化学方法或者生物酶解法，将灵芝孢子粉的孢壁破碎或者消除之后，由孢壁所紧裹的有效成分才能最大程度地被人体肠胃直接吸收。有资料表明，破壁后的灵芝孢子粉有利于三萜、粗多糖、粗脂肪等成分的溶出，其中粗多糖含量比未破壁灵芝孢子粉高出70％。若直接食用未破壁的灵芝孢子粉，人体仅能利用12％左右的有效成分，而服用破壁后的灵芝孢子粉，有效成分利用率可达95％以上。因此，破壁灵芝孢子粉的破壁率的大小就是能否最大程度上利用灵芝孢子粉有效成分的关键所在。对于市场上众多的破壁灵芝孢子粉，破壁率常被作为衡量这种产品质量的重要指标。
目前，破壁灵芝孢子粉的破壁率测定主要参考农业部标准《NY/T1677-2008破壁灵芝孢子粉破壁率的测定》以及国家标准《GB/T29344-2012灵芝孢子粉采收及加工技术规范》附录A“破壁灵芝孢子粉破壁率的测定方法”。在这两个标准中，破壁率测定原理都是通过血球计数板对未破壁的孢子进行计数，分别计算出单位质量未破壁灵芝孢子粉中完整孢子的数量和单位质量破壁灵芝孢子粉中完整孢子的数量，从而获得破壁灵芝孢子粉的破壁率。这种分析方法的操作过程复杂，测定时间较长，血球计数板的制样和计数过程容易产生误差，对于操作者的熟练程度要求较高。
除血球计数板法外，目前公开报道的破壁率的测定方法还有水装片结合显微技术检测方法、悬浮法结合物理技术检测方法以及化学指纹检测方法等。其中，化学指纹检测方法突破了人为计数的限制，从成分上对破壁灵芝孢子粉破壁率的检测方式进行了重新定义。由于目前色谱技术的发展，用成分含量的分析方法测定破壁率已不成问题，并且其准确率能够得到充分保证；但成分分析方法的检测步骤复杂，所用仪器昂贵，样品遭到破坏，检测成本较高。
发明内容
本发明的目的就是提供一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，以解决现有的检测方法步骤复杂、成本高以及易使样品遭到破坏的问题。
本发明是这样实现的：一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法，包括如下步骤：
a、采用近红外光谱仪采集待测样本的近红外光谱数据；
b、对所述待测样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理；
c、选取预处理后9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为10的条件下，采用依据偏最小二乘回归法所建立的破壁率预测模型来检测所述待测样本的破壁率。
所述步骤c中的所述破壁率预测模型为：
Y＝A0+A1×X1+A2×X2+A3×X3+A4×X4+A5×X5+A6×X6+A7×X7+A8×X8+A9×X9+A10×X10
式中：Y为破壁率，A0、A1、……、A10均为常数，X1为光谱数据经主成分分析降维后第一因子得分，X2为光谱数据经主成分分析降维后第二因子得分，X3为光谱数据经主成分分析降维后第三因子得分，X4为光谱数据经主成分分析降维后第四因子得分，X5为光谱数据经主成分分析降维后第五因子得分，X6为光谱数据经主成分分析降维后第六因子得分，X7为光谱数据经主成分分析降维后第七因子得分，X8为光谱数据经主成分分析降维后第八因子得分，X9为光谱数据经主成分分析降维后第九因子得分，X10为光谱数据经主成分分析降维后第十因子得分；所述光谱数据为近红外光谱数据经预处理后9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据。
所述步骤c中的所述破壁率预测模型为：
Y＝0.06866×X1+0.046809×X2+0.019892×X3+0.125289×X4+0.06593×X5+0.019621×X6+0.053336×X7+0.018258×X8+0.094993×X9+0.079206×X10
式中：Y为破壁率，X1为光谱数据经主成分分析降维后第一因子得分，X2为光谱数据经主成分分析降维后第二因子得分，X3为光谱数据经主成分分析降维后第三因子得分，X4为光谱数据经主成分分析降维后第四因子得分，X5为光谱数据经主成分分析降维后第五因子得分，X6为光谱数据经主成分分析降维后第六因子得分，X7为光谱数据经主成分分析降维后第七因子得分，X8为光谱数据经主成分分析降维后第八因子得分，X9为光谱数据经主成分分析降维后第九因子得分，X10为光谱数据经主成分分析降维后第十因子得分；所述光谱数据为近红外光谱数据经预处理后9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据。
所述步骤a具体包括如下步骤：
a1、将所述待测样本在30℃下烘干48小时，然后装入样品杯中；
a2、采用傅里叶近红外光谱仪以漫反射模式扫描待测样本，获得待测样本在12500-4000cm-1范围内的光谱数据；所述傅里叶近红外光谱仪的扫描分辨率为8cm-1；
a3、扫描待测样品32次后取平均值。
所述步骤c中所述破壁率预测模型的具体构建方法如下：
c1、选取若干具有不同破壁率的破壁灵芝孢子粉作为建立破壁率预测模型所需的训练样本；
c2、采用近红外光谱仪采集所述训练样本的近红外光谱数据；
c3、采用血球计数板法检测所述训练样本的破壁率，以作为建立破壁率预测模型所需的训练样本破壁率参考值；
c4、对所述训练样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理，选取预处理后9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为10的条件下，结合所述训练样本破壁率参考值，采用偏最小二乘回归法建立破壁率预测模型。
所述步骤c4中9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的选取过程具体如下：
根据所述近红外光谱数据主成分分析的前三个因子的载荷图，选择载荷值较大的若干个光谱区间，之后通过优化选择得出9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间。
所述步骤c2具体包括如下步骤：
c21、将所述训练样本在30℃下烘干48小时，然后装入样品杯中；
c22、采用傅里叶近红外光谱仪以漫反射模式扫描训练样本，获得各训练样本在12500-4000cm-1范围内的光谱数据；所述傅里叶近红外光谱仪的扫描分辨率为8cm-1；
c23、对每个训练样品扫描32次后取平均值。
所述步骤c3具体包括如下步骤：
c31、分别称取在60℃下烘干5h后的未破壁灵芝孢子粉0.01g、0.02g、0.03g、0.04g和0.05g，然后分别装入5个比色管中；
c32、分别称取5份经过研磨后再经100目筛筛选后的蔗糖粉末各1.25g，将5份蔗糖粉末分别加入所述步骤c31中的5个比色管中，使加入的蔗糖粉末与相应比色管中的灵芝孢子粉混合至色泽均一；
c33、向各比色管中加入蒸馏水以溶解相应比色管内的蔗糖粉末与灵芝孢子粉，之后向各比色管中加入0.2mL吐温80，接着用蒸馏水将各比色管定容至25mL；
c34、在室温下使各比色管超声震荡30min，期间每隔10min对各比色管进行若干次的手动摇晃，使各比色管内的灵芝孢子粉充分分散；
c35、从每一比色管内分别吸取8.0μL灵芝孢子粉悬浮液于5个不同的盖玻片的边缘，利用吸虹现象使相应盖玻片下方的血球计数板网格中充满对应的灵芝孢子粉悬浮液；
c36、静置30s后，采用400倍放大倍数的光学显微镜分别对各血球计数板上4个顶角及中央共5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数进行统计，对每个血球计数板观察统计5次后取平均值；
c37、以所述步骤c1中所称取的5份未破壁灵芝孢子粉的质量为横坐标，以所述步骤c36中所统计的各血球计数板上5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数为纵坐标，制作未破壁灵芝孢子粉质量与个数的标准曲线；
c38、分别称取每一在60℃下烘干5h后的训练样本0.04g，放入不同的比色管中；按照所述步骤c32～c36分别统计每一训练样本对应的血球计数板上5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数；
c39、从所述步骤c37中所绘制的标准曲线中查找质量为0.04g未破壁灵芝孢子粉所对应的完整灵芝孢子粉的个数NA，依据公式
X=(1-NBNA)×100%]]>
计算得出每一训练样本的破壁率；式中：X为训练样本的破壁率，NB为所述步骤c38中所统计的训练样本对应的血球计数板上5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数。
采用本发明检测破壁灵芝孢子粉的破壁率时，由于近红外光谱仪采集光谱数据的时间很短，对光谱数据进行预处理以及采用偏最小二乘回归法进行运算处理的时间也很短，因此可很方便、迅速地检测出待测样本的破壁率，且不会使待测样本遭到破坏，解决了目前破壁灵芝孢子粉破壁率检测过程中所存在的操作过程复杂、样品易被破坏、人为不稳定因素较多、重复性差等的问题。
对利用本发明进行检测后的待测样本，再利用传统的血球计数板的方法进行破壁率的检测，将两者的检测结果进行比较，结果表明，两种方法测定的破壁率非常接近，相对偏差在0.7-8.6％之间，说明本发明所建立的无损检测方法准确可靠。
灵芝孢子粉作为高端保健品，其价格一直居高不下。本发明应用近红外光谱技术和多元统计学方法对破壁灵芝孢子粉破壁率进行快速无损检测，可极大地降低检测成本，提高检测速度，利于产品的质量监控。
附图说明
图1是本发明训练样本的近红外光谱图。
图2是本发明实施例中未破壁灵芝孢子粉的显微照片。
图3是本发明中未破壁灵芝孢子粉质量与个数的标准曲线。
图4是本发明实施例中训练样本的显微照片。
图5是本发明实施例中训练样本的近红外光谱主成分的前三个因子的载荷图。
图6是采用本发明检测训练样本得出的预测值与采用血球计数板法检测训练样本得出的参考值之间的相关性图。
图7是本发明实施例中待测样本的近红外光谱数据经预处理后的光谱图。
具体实施方式
本发明对待测破壁灵芝孢子粉进行破壁率检测时，首先采用近红外光谱仪采集待测样本的近红外光谱数据；之后对所采集的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理；接着选取预处理后9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为10的条件下，采用依据偏最小二乘回归法所建立的破壁率预测模型来检测待测样本的破壁率。
所建立的破壁率预测模型为：
Y＝A0+A1×X1+A2×X2+A3×X3+A4×X4+A5×X5+A6×X6+A7×X7+A8×X8+A9×X9+A10×X10(1)
式(1)中：Y为破壁率，A0、A1、……、A10均为常数，X1为光谱数据经主成分分析降维后第一因子得分，X2为光谱数据经主成分分析降维后第二因子得分，X3为光谱数据经主成分分析降维后第三因子得分，X4为光谱数据经主成分分析降维后第四因子得分，X5为光谱数据经主成分分析降维后第五因子得分，X6为光谱数据经主成分分析降维后第六因子得分，X7为光谱数据经主成分分析降维后第七因子得分，X8为光谱数据经主成分分析降维后第八因子得分，X9为光谱数据经主成分分析降维后第九因子得分，X10为光谱数据经主成分分析降维后第十因子得分；所述光谱数据为近红外光谱数据经预处理后9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据。
下面对本发明中破壁率预测模型的建立、所建立的破壁率预测模型的具体形式及近红外光谱数据的采集等内容进行详细描述。
采用偏最小二乘回归法建立破壁率预测模型，具体包括如下步骤：
a、选取若干具有不同破壁率的破壁灵芝孢子粉作为建立破壁率预测模型所需的训练样本。
b、采用近红外光谱仪采集训练样本的近红外光谱数据。
首先将步骤a中所选取的若干训练样本在30℃下烘干48小时，然后将每一训练样本分别装入一个样品杯中。之后采用德国BRUKER公司MPA型傅里叶近红外光谱仪以漫反射模式分别扫描各样品杯内的训练样本，获得各训练样本在12500-4000cm-1范围内的光谱数据。每次扫描前应对傅里叶近红外光谱仪的噪声、波长准确度和重现性进行诊断；傅里叶近红外光谱仪的扫描分辨率为8cm-1，对每一训练样本扫描32次后取平均值。采用相关软件对所采集的各训练样本的近红外光谱数据(平均值)进行处理，可得出每一训练样本的近红外光谱图。参考图1，图1示出了各训练样本的近红外光谱图。由图1可看出，不同破壁率的破壁灵芝孢子粉的近红外光谱图看起来相差不大，因此不能从谱图上直接进行分析，而是需要对所采集的近红外光谱数据进行预处理，之后才能依据预处理后的光谱数据采用偏最小二乘回归法建立破壁率预测模型来实现无损检测破壁灵芝孢子粉的破壁率。具体预处理方法以及采用偏最小二乘回归法建立破壁率预测模型可参见步骤d。
c、采用血球计数板法检测训练样本的破壁率，以作为建立破壁率预测模型所需的训练样本破壁率参考值。
该步骤又可包括样品(未破壁灵芝孢子粉)稀释、制片、计数、绘制标准曲线及训练样本破壁率的计算几个步骤，具体如下：
c1、采用梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司的AR1140型电子天平(精度为0.1mg)分别准确称取在60℃(±1℃)下烘干5h后的未破壁灵芝孢子粉0.01g、0.02g、0.03g、0.04g和0.05g，将所称取的5份未破壁灵芝孢子粉分别装入5个25mL的比色管中。烘干时所用仪器为北京鸿达天矩DHG-9023A型恒温鼓风干燥箱。
c2、采用步骤c1中所用电子天平分别称取5份经过研磨后再经100目筛筛选后的蔗糖粉末各1.25g，将5份蔗糖粉末分别加入步骤c1中的5个比色管中，使加入的蔗糖粉末与相应比色管中的灵芝孢子粉混合至色泽均一。
c3、向各比色管中加入蒸馏水以溶解相应比色管内的蔗糖粉末与灵芝孢子粉，之后向各比色管中加入0.2mL吐温80，接着用蒸馏水将各比色管定容至25mL。
c4、采用上海易净超声波仪器有限公司的YQ-220D超声波清洗器，在室温下使各比色管超声震荡30min，期间每隔10min对各比色管进行若干次的手动摇晃，使各比色管内的灵芝孢子粉充分分散。
c5、从每一比色管内各吸取8.0μL灵芝孢子粉悬浮液，分别将5份8.0μL的灵芝孢子粉悬浮液滴在5个盖玻片的边缘，利用吸虹现象使相应盖玻片下方的血球计数板网格中充满对应的灵芝孢子粉悬浮液。
在从每一比色管内吸取灵芝孢子粉悬浮液之前，可通过手摇比色管，使比色管内的灵芝孢子粉分散均匀，之后立刻吸取8.0μL灵芝孢子粉悬浮液。将从5个比色管中所吸取的不同的灵芝孢子粉悬浮液分别滴于5个盖玻片的边缘，每一盖玻片的下方设置有一血球计数板，即：盖玻片盖在血球计数板上方；通过吸虹现象可使每一血球计数板网格中充满相应的灵芝孢子粉悬浮液。血球计数板上的网格包括25个中格，每一中格又分成16个小格。
c6、使每一灵芝孢子粉悬浮液在相应的血球计数板网格中静置30s，之后采用OLYMPUS公司的BX51系统光学显微镜，在400倍放大倍数下对各血球计数板上4个顶角及中央共5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数进行观察计数。参考图2，图2示出了其中一个血球计数板上未破壁灵芝孢子粉(对应0.04g未破壁灵芝孢子粉)的显微照片，由图中可看出，每一灵芝孢子粉均呈椭圆形粒状，即未经破壁的灵芝孢子粉。
在对血球计数板上5个中格中所含完整灵芝孢子粉的个数进行统计时，如果有部分灵芝孢子粉处于中格的边线上，计数时应统计位于中格四个边线的其中两个相邻边线上的灵芝孢子粉的个数。统计过程中应去掉离群较大的值，对每个血球计数板上5个中格中所含完整灵芝孢子粉的个数进行有效观察计数5次，然后算其平均值。
c7、以步骤c1中所称取的5份未破壁灵芝孢子粉的质量为横坐标，以步骤c6中所统计的各血球计数板上5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数为纵坐标，制作未破壁灵芝孢子粉质量与个数的标准曲线，具体见图3，图3所示标准曲线的拟合方程为y＝1706.6x－2.0173，线性相关系数为R2＝0.999；由图3可看出，未破壁灵芝孢子粉的质量与个数是成正比的，质量越大，其所含完整灵芝孢子粉的个数越多。
c8、使所有的训练样本均在60℃下烘干5h，之后分别称取每一烘干后的训练样本0.04g，将所称取的不同的训练样本分别放入不同的比色管中；按照步骤c2～c6分别统计每一训练样本对应的血球计数板上5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数。参考图4，图中示出了其中一个训练样本在光学显微镜下的显微照片，由图可看出，训练样本中的灵芝孢子粉很多都已经破碎，从而形成大小不一的粉粒状结构，通过统计所残留的完整的灵芝孢子粉的个数，可计算训练样本的破壁率。
c9、从步骤c7中所绘制的标准曲线中查找质量为0.04g未破壁灵芝孢子粉所对应的完整灵芝孢子粉的个数NA，依据公式
X=(1-NBNA)×100%---(2)]]>
计算得出每一训练样本的破壁率；式(2)中：X为训练样本的破壁率，NB为步骤c8中所统计的训练样本对应的血球计数板上5个中格中含完整灵芝孢子粉的个数。
所计算出来的所有训练样本的破壁率值作为建立破壁率预测模型所需的训练样本破壁率参考值。
d、对训练样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理，选取预处理后9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为10的条件下，结合训练样本破壁率参考值，采用偏最小二乘回归法建立破壁率预测模型。
常用的近红外光谱数据预处理方法有多元散射校正法、一阶导数法、矢量归一化法、二阶导数法、减去一条直线法、消除常熟偏移量法等多种。为了建立最佳的破壁率预测模型，应选择一种最优的预处理方法；该最优的预处理方法，应能最多的保留各训练样本的原始信息，还能减少光谱数据受训练样本不均匀、光散射和仪器的随机噪音等因素的影响，提高模型的预测精度和稳定性。
除了选取最优的预处理方法之外，还应优化选择特征光谱区间和因子数。
近红外光谱是12500-4000cm-1的光谱区间，其主要反映含氢集团(如C-H、N-H、O-H等)的倍频与合频吸收信息。选取与破壁灵芝孢子粉破壁率关系密切的特征光谱区间是提高预测模型准确度的有效方法。
本发明特征光谱区间的选择摒弃了全波段内逐段代入的办法，依据主成分分析前三个因子的载荷图(见图5)，选择载荷值较大的几个光谱区间(9411.6-5446.4cm-1、4613.2-4243cm-1、7513.9-6094.4cm-1、5461.8-4243cm-1、7436.7-5446.3cm-1、7513.9-5446.4cm-1)进行优化选择，从而极大地减少特征光谱区间选择的工作量。
在偏最小二乘回归分析中，庞大的数据矩阵将会减少到仅仅几个因子。因子数目太少将丢掉较多的信息，而因子数目太大则会过度拟合，因此选取合适的因子数是非常必要的。
通过正交试验，分别对不同近红外光谱数据预处理方法、特征光谱区间和因子数进行对比，对比结果见表1，结果表明，对近红外光谱数据采用多元散射校正预处理方法，在9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间内选取数据，因子数为10时，交互验证均方根误差(RMSECV)最小，即此时采用偏最小二乘回归法所建立的用来预测破壁灵芝孢子粉破壁率的模型性能最佳，该最佳模型的具体表达式为：
A0＝0；
Y＝0.06866×X1+0.046809×X2+0.019892×X3+0.125289×X4+0.06593×X5+0.019621×X6+0.053336×X7+0.018258×X8+0.094993×X9+0.079206×X10 (3)
式(3)中：Y为破壁率，X1为光谱数据经主成分分析降维后第一因子得分，X2为光谱数据经主成分分析降维后第二因子得分，X3为光谱数据经主成分分析降维后第三因子得分，X4为光谱数据经主成分分析降维后第四因子得分，X5为光谱数据经主成分分析降维后第五因子得分，X6为光谱数据经主成分分析降维后第六因子得分，X7为光谱数据经主成分分析降维后第七因子得分，X8为光谱数据经主成分分析降维后第八因子得分，X9为光谱数据经主成分分析降维后第九因子得分，X10为光谱数据经主成分分析降维后第十因子得分；所述光谱数据为近红外光谱数据经预处理后9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据。
在该条件下，灵芝孢子粉的破壁率在20.0-99.0％范围内时，破壁率预测值与参考值相关性为R2＝99.8，RMSECV＝1.39(见图6)。
表1偏最小二乘回归法检测破壁灵芝孢子粉破壁率的条件优化结果

破壁率预测模型构建成功后，在需要对待测样本进行破壁率的检测时，只需采用近红外光谱仪采集待测样本的近红外光谱数据，对待测样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理，选取预处理后9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1两个光谱区间的数据，在因子数为10的条件下，采用上述所建立的破壁率预测模型检测待测样本的破壁率。
本实施例中选取14个待测样本，将14个待测样本均在30℃下烘干48小时，然后分别装入不同的样品杯中；采用傅里叶近红外光谱仪以漫反射模式扫描各样品杯内的待测样本，获得各待测样本在12500-4000cm-1范围内的光谱数据，傅里叶近红外光谱仪的扫描分辨率为 8cm-1；对每一待测样品扫描32次后取平均值。
将14个待测样本的近红外光谱数据(平均值)首先进行多元散射校正预处理，参考图7，图7示出了样品编号为P01的待测样本的近红外光谱数据经多元散射校正预处理后的谱图；图中区间A即为9411.6-5446.4cm-1的光谱区间，区间B即为4613.2-4243cm-1的光谱区间。对待测样本的近红外光谱数据进行预处理后，从预处理后的数据中选取位于9411.6-5446.4cm-1和4613.2-4243cm-1光谱区间内的数据，选因子数为10，利用偏最小二乘回归法得出所选光谱数据经主成分分析降维后的前十个因子得分，即得出X1、X2、……、X10，将X1、X2、……、X10代入式(3)中，即可检测出待测样本的破壁率。
为了验证本发明检测破壁率的准确度，在采用本发明对14个待测样本的破壁率检测完毕后，再利用传统血球计数板法对14个待测样本进行破壁率的检测，检测结果即为破壁率参考值，两种方法的检测结果见表2。结果表明，两种方法测定的破壁率非常接近，相对偏差在0.7-8.6％之间，说明该发明所建立的无损检测方法准确可靠。
表2待测样本的破壁率分析结果