脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103913451 A (43)申请公布日 2014.07.09 CN 103913451 A (21)申请号 201410107993.2 (22)申请日 2014.03.21 G01N 21/78(2006.01) (71)申请人 中山市南方新元食品生物工程有限 公司 地址 528436 广东省中山市火炬开发区沿江 东二路 16 号 (72)发明人 刘高峰 (74)专利代理机构 北京市立方律师事务所 11330 代理人 刘延喜 王增鑫 (54) 发明名称 脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法 (57) 摘要 本发明公开一种脂肪氧化酶酶活性的快速定 性检测方法， 其中。

2、， 将包含二甲基胺硼烷缓冲剂和 亚油酸溶液的溶液 A、 包含酚试剂和高铁血红素 溶液的溶液 B 以及含脂肪氧化酶的酶产品溶液混 合， 静置显色 ； 根据是否显色判断所述酶产品溶 液是否具有脂肪氧化酶酶活性。本发明的脂肪氧 化酶酶活性的快速定性检测方法具有操作简便、 测样迅速的特点， 适合在生产实际中应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103913451 A CN 103913451 A 1/1 页 2 1. 一种脂肪氧化酶酶活。

3、性的快速定性检测方法， 其特征在于 ： 将包含二甲基胺硼烷缓 冲剂和亚油酸溶液的溶液 A、 包含酚试剂和高铁血红素溶液的溶液 B 以及含脂肪氧化酶的 酶产品溶液混合， 静置显色 ； 根据是否显色判断所述酶产品溶液是否具有脂肪氧化酶酶活 性。 2. 如权利要求 1 所述的脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法， 其特征在于 ： 所述溶 液 A 包含初始浓度为 20mM 的二甲基胺硼烷缓冲液、 初始浓度为 25mM 的亚油酸溶液和水， 三 者体积比为 25 ： 1 ： 24。 3. 如权利要求 2 所述的脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法， 其特征在于 ： 所述 20mM 的二甲基胺硼烷缓冲液包含二甲。

4、基胺硼烷固体， 所述二甲基胺硼烷固体用一定量盐酸 溶解后， 用水定容至所需浓度。 4. 如权利要求 2 所述的脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法， 其特征在于 ： 所述亚 油酸溶液为亚麻酸和水的乳化液。 5. 如权利要求 4 所述的脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法， 其特征在于 ： 所述乳 化液通过适量的亚麻酸与一定量的水充分搅拌成乳状液得到。 6. 如权利要求 1 所述的脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法， 其特征在于 ： 所述溶 液 B 包含初始浓度为 10mM 的酚试剂、 初始浓度为 0.1mg/ml 的高铁血红素溶液和水， 三者体 积比为 1 ： 1 ： 48。 7. 如权利要求 6。

5、 所述的脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法， 其特征在于 ： 所述酚 试剂为 3- 甲基 -2- 苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物的水溶液。 8. 如权利要求 6 所述的脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法， 其特征在于 ： 所述高 铁血红素溶液为高铁血红素的水溶液。 9. 如权利要求 1 所述的脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法， 其特征在于 ： 所述酶 产品溶液为溶解在酶样品缓冲液中的脂肪氧化酶提取物， 所述酶样品缓冲液包含 7.88g/l 的三羟甲基氨基甲烷、 8.766g/l 的氯化钠和 100g/l 的甘油。 10.如权利要求19任意一项所述的脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法， 其特征 在。

6、于， 所述混合步骤为 ： A. 在常温下， 将所述溶液 A、 溶液 B 和酶产品溶液按照 4.5 ： 4.5 ： 1 的体积比在 96 孔板 中混合， 静置显色。 11. 如权利要求 10 所述的脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法， 其特征在于， 还包 括步骤 （B） ： 若所述步骤 （A） 没有显色， 将所述酶产品溶液稀释一定倍数后重复步骤 （A） 。 12. 如权利要求 10 或 11 所述的脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法， 其特征在于， 还包括 ： 将所述步骤A中载有所述混合液的96孔板通过检测仪器在590nm波长下检测各混 合液的显色的相对值， 以比较各酶产品溶液的酶的相对活力大小。

7、。 权 利 要 求 书 CN 103913451 A 2 1/4 页 3 脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种酶学检测技术领域， 尤其涉及一种脂肪氧化酶酶活性的快速定性 检测方法。 背景技术 0002 在制备食品的小麦面粉中， 由于小麦产地和品种不同等因素， 造成小麦面粉的品 质差异很大， 通常需要加入面粉改良剂来增强面团的弹性和韧性， 并且改良面团的流变学 特性， 以使制得的面制食品纹理均匀、 规整、 平滑、 色泽洁白、 富于弹性且口感细腻。 0003 传统的面粉改良剂， 是以化学添加剂为主。 随着人们生活水平的日益提高， 食品安 全以及健康饮食越来越受到重。

8、视。 因此， 对食品原材料和添加剂的要求和监控越来越严格。 使用安全的生物酶制剂替代传统的化学制剂已经成为了食品行业的一大趋势。 为了迎合这 一行业趋势， 并和国际水平同步， 研发了脂肪氧化酶系列产品。 此系列产品可以良好地增大 面团体积， 并对面团有一定的漂白功能， 受到了用户的广泛期待。 0004 生物酶产品的重要质量指标之一， 是酶产品的酶活性。准确的定量测量酶产品活 性的大小， 对生物酶的生产和销售都用重要意义。 0005 无锡轻工大学学报 （2001.01-0077-04） 报道了三种测定脂肪氧化酶的方法， 分 别为量压法， 分光光度法和 KI2 淀粉法。 0006 1. 量压法 0。

9、007 由于脂肪氧化酶的作用， 底物亚油酸可以与氧结合， 形成过氧化物。 量压法正是利 用这一原理， 通过测定密闭体系内的氧气量减少， 间接测定脂肪氧化酶产品的活性。 0008 这种测定方法， 对脂肪氧化酶样品的粗拙程度没有要求， 适合较为初级的样品测 定， 但操作步骤较为复杂， 不能适应连续的样品测定的要求， 而且由于测量时需要不断震 动， 可能影响酶活力， 对微量的酶活性监测不够准确， 灵敏度差。 0009 2. 分光光度法 0010 脂肪氧化酶催化底物亚油酸的过程中， 会产生具有共轭二烯键的中间体。共轭二 烯键的一个特点是可以吸收 234nm 光波。因此通过测定 234nm 光波， 可以。

10、间接推算酶活力。 分光光度法就是根据这一原理， 测定共轭二烯键的浓度， 从而测定酶活性的大小。 0011 这种方法的优势是可以连续多样品测定， 但对仪器要求较高， 且由于是测定紫外 光波， 因此对样品中的杂质较为敏感， 因此只适合于较为纯净的酶样品测定， 不适合应用于 实际生产中较粗样品的测定。且由于是直接测定的中间体， 具有不稳定性， 因此随时间变 化， 分光光度值也在不断变化。因为灵敏度低， 不适合酶活性较低的样品。 0012 3.KI2 淀粉法 0013 脂肪氧化酶催化亚油酸形成过氧化物， 过氧化物可以将碘离子氧化还原为碘， 而 碘可以与淀粉结合并显色。根据这一原理， 可以间接测定脂肪氧。

11、化酶活性， 既为 KI2 法。 0014 与分光光度法相似， 这种方法受到杂质和时间影响较大。而且由于在酸性条件下 显色， 酶样品中的蛋白质和脂肪等杂质也可能在酸性条件下絮凝， 影响观测和结果的可靠 说 明 书 CN 103913451 A 3 2/4 页 4 性。因此这种方法也无法适应生产条件下复杂的酶样品条件。 0015 上述三种方法各有局限性， 不能满足实际生产中的快速准确的测定需要， 大大限 制了它们的应用。 发明内容 0016 本发明的目的是， 为克服现有技术的不足， 提供一种方法简便、 测样迅速的适合在 轻工食品工业生产过程中实现对面粉烘培酶脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法。 0。

12、017 根据国际通用标准， 1 单位脂肪氧化酶活力的定义为 ： 在 25温度下， pH9.0 环境 中， 酶每分钟氧化 0.12mole 亚油酸所需的活力。而这一活力， 等同于 25温度下， pH9.0 环境中， 在 3.0ml 所述 0.12mole 亚油酸溶液中 （1 厘米光照距离） ， 光度值在 234nm 光波 上每分钟改变 0.001 所需的酶活力。 0018 根据这一定义， 本发明设计了间接测量亚油酸浓度变化的方案。 亚油酸浓度变化， 其氧化中间体用染料对其进行染色， 从而判断酶产品是否有活性， 而从染料颜色变化的快 慢和深浅， 也粗略比较酶产品的活性大小。 0019 为达到以上技。

13、术目的， 本发明采用的技术方案如下 ： 0020 一种脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法， 其中， 将包含二甲基胺硼烷缓冲剂 和亚油酸溶液的溶液 A、 包含酚试剂和高铁血红素溶液的溶液 B 以及含脂肪氧化酶的酶产 品溶液混合， 静置显色， 根据是否显色判断所述酶产品溶液是否具有脂肪氧化酶酶活性。 0021 具体地， 所述溶液 A 包含初始浓度为 20mM 的二甲基胺硼烷缓冲液、 初始浓度为 25mM 的亚油酸溶液和水， 三者体积比为 25 ： 1 ： 24。 0022 配制方法 ： 所述 20mM 的二甲基胺硼烷缓冲液包含二甲基胺硼烷固体， 所述二甲基 胺硼烷固体用一定量盐酸溶解后， 用水定容。

14、至所需浓度。所述亚油酸溶液为亚麻酸和水的 乳化液。所述乳化液通过适量的亚麻酸与一定量的水充分搅拌成乳状液得到。 0023 所述溶液 B 包含初始浓度为 10mM 的酚试剂、 初始浓度为 0.1mg/ml 的高铁血红素 溶液和水， 三者体积比为 1 ： 1 ： 48。 0024 配制方法 ： 所述酚试剂为 3- 甲基 -2- 苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物的水溶液。所 述高铁血红素溶液为高铁血红素的水溶液。 0025 所述酶产品溶液为溶解在酶样品缓冲液中的脂肪氧化酶提取物， 所述酶样品缓冲 液包含 7.88g/l 的三羟甲基氨基甲烷、 8.766g/l 的氯化钠和 100g/l 的甘油。 0026 。

15、所述的脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法， 所述混合步骤为 ： 0027 A. 在常温下， 将所述溶液 A、 溶液 B 和酶产品溶液按照 4.5 ： 4.5 ： 1 的比例在 96 孔 板中混合， 静置显色。 0028 可选择地， 还包括步骤 （B） ： 若所述步骤 （A） 没有显色， 将所述酶产品溶液稀释一定 倍数后重复步骤 （A） 。 0029 可选择地， 还包括 ： 将所述步骤 A 中载有所述混合液的 96 孔板通过检测仪器在 590nm 波长下检测各混合液的显色的相对值， 以比较各酶产品溶液的酶的相对活力大小。 0030 与现有技术相比较， 本发明具有如下优势 ： 0031 （a） 使。

16、用酚试剂和二甲基胺硼烷作为显色剂， 并采用高铁血红素作为酚试剂和二 甲基胺硼烷氧化作用的触媒， 使最终的显色结果为易于肉眼观察的蓝色或深紫色， 因此省 说 明 书 CN 103913451 A 4 3/4 页 5 去了繁琐的步骤和对检测仪器的依赖， 更加适合于生产环境下对酶活性的定性测定。 0032 （b） 使用 96 孔板及其相应的检测仪器对脂肪氧化酶酶活性进行检测， 一方面可以 一次性对多个样品进行测量， 大大提高检测效率 ； 另一方面， 通过仪器可以粗略比较多个样 品的酶活性大小， 也极大提高检测效率。 附图说明 0033 图 1 为采用本发明的脂肪氧化酶酶活性快速定性检测方法的脂肪氧化。

17、酶定性检 测结果。 具体实施方式 0034 以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。 0035 检测大豆脂肪氧化酶的提取液中是否具有脂肪氧化酶酶活性， 步骤如下 ： 0036 （1） 配制溶液 A 0037 所述溶液 A 包含 5ml20mM 二甲基胺硼烷 （DMAB） 缓冲液、 0.2ml25mM 亚油酸溶液和 4.8ml 水， 现配现用。 0038 所述 20mM DMAB 缓冲液的配制 ： 将 165mg DMAB 溶解在 2.5ml1N 盐酸溶液中， 然后 用 50ml 的容量瓶加水定容至 50ml。 0039 所述 25mM 亚油酸溶液的配制 ： 将 155l（140mg。

18、） 亚麻酸溶解到 5ml 水溶液中， 充 分搅拌使得溶液完全乳化成乳状液， 用 20ml 的容量瓶加水定容至 20ml ； 将配好的所述溶液 分成 1ml 小份， 在 -20保存。 0040 （2） 配制溶液 B 0041 所述溶液 B 包含 0.2ml10mM 酚试剂、 0.2ml0.1mg/ml 高铁血红素溶液和 9.6ml 水， 现配现用。 0042 所述 10mM 酚试剂的配制 ： 将 0.233g3- 甲基 -2- 苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物 （MBTH） 溶解于 10ml 水中， 在 4保存。 0043 所述 0.1mg/ml 高铁血红素溶液的配制 ： 将 2mg 的高铁血红素在水。

19、中溶解后用 10ml 的容量瓶加水定容至 10ml。 0044 （3） 配制酶产品溶液 0045 a）酶样品缓冲液的配制 ： 将 7.88g 三羟甲基氨基甲烷 （Tris） 、 8.766g 氯化钠 （NaCl） 和 100g 甘油 （glycerol） 溶解在水中， 然后用 1L 的容量瓶加水定容至 1L。 0046 b） 脂肪氧化酶标准品溶液 （标记为 +， 表示正对照） 的配制 ： 将适量的购买的脂肪 氧化酶粉末 （Cayman Chemical60700） 溶解在适量的所述酶样品缓冲液中。 0047 c） 大豆脂肪氧化酶提取液的制备 ： 0048 - 将大豆浸泡过夜。 0049 - 将。

20、泡过的大豆用手持破碎机 （KitchenAid 双速手持破碎机） 打碎， 并使用 8 英尺 不锈钢滤网 （Good Cook 滤网） 进行过滤， 滤液补充所述酶样品缓冲液至大豆干重的 5 倍， 得 粗提液。 0050 - 将所述粗提液用离心机 （Heckman J2-HS） 在 10,500g 离心力下离心 20min， 取上 清液， 得到大豆脂肪氧化酶提取液 （标记为 S.E.） 。 说 明 书 CN 103913451 A 5 4/4 页 6 0051 （4） 显色反应 0052 在常温下， 在96孔板每个样品孔中加入90l所述溶液A和90l所述溶液B， 混 合后， 在相应的样品孔内分别加。

21、入 20l 所述大豆脂肪氧化酶提取液 （SE.） 、 脂肪氧化酶 标准品溶液 （+） 或水 （标记为 -， 表示负对照） ， 静置 5min。在可见光范围内显示蓝色或深紫 色， 则证明该样品有脂肪氧化酶活性。 0053 如图 1 所示， 载有反应混合液的其中三个 96 孔板的样品孔中，“+” 孔显示出了蓝 色，“-” 孔为无色透明， 以此分别作为正对照和负对照， 即其他样品孔若显示出蓝色， 表明 该样品存在脂肪氧化酶酶活性， 若仍旧为无色透明， 表明该样品不存在脂肪氧化酶酶活性。 “S.E.” 孔显示为蓝色， 表明所述大豆脂肪氧化酶提取液存在脂肪氧化酶酶活性。 0054 进一步地， 在已知所述。

22、脂肪氧化酶标准品溶液的浓度的情况下， 可通过比较显色 的深浅来粗略比较不同样品间酶活性的高低。继续参考图 1，“S.E.” 的显色比 “+” 深， 表明 大豆脂肪氧化酶提取液的酶活性比脂肪氧化酶标准品的酶活性高。 0055 （5） 稀释 0056 如果所述步骤 （4） 没有显色， 可将所述脂肪氧化酶标准品溶液或大豆脂肪氧化酶 提取液稀释一定倍数， 如 4 倍、 8 倍或 10 倍， 再重复步骤 （4） ， 以进一步验证该样品是否有脂 肪氧化酶活性。 0057 （6） 比色 0058 在常温下， 将载有上述反应混合液的 96 孔板放入孔板检测仪中， 在 590nm 波长的 光谱下比色， 可比较各样品的相对活力大小 （未显示结果） 。 0059 综上所述， 本发明的脂肪氧化酶酶活性的快速定性检测方法具有操作简便、 测样 迅速的特点， 适合在生产实际中应用。 0060 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但并不仅仅受上述实施例的限制， 其他的 任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的 置换方式， 均包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103913451 A 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 103913451 A 7 。