一株能稳定分泌抗黄绿青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103911352 A (43)申请公布日 2014.07.09 CN 103911352 A (21)申请号 201410137850.6 (22)申请日 2014.04.08 CCTCC NO ： C201442 2014.03.19 C12N 5/20(2006.01) C07K 16/14(2006.01) G01N 33/577(2006.01) (71)申请人 福建农林大学 地址 350002 福建省福州市仓山区建新镇金 山学区 (72)发明人 汪世华 金妮 凌素美 庄振宏 王荣智 袁军 张峰 贾坤志 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 。

2、35100 代理人 蔡学俊 (54) 发明名称 一株能稳定分泌抗黄绿青霉素单克隆抗体的 杂交瘤细胞株 (57) 摘要 本发明属于细胞工程领域， 具体涉及一株能 稳定分泌抗黄绿青霉素 CIT 的单克隆抗体杂交瘤 细胞株。该杂交瘤细胞株 8D8, 已于 2014 年 3 月 19 日在中国典型培养物保藏中心， 保藏编号是 ： CCTCCNO ： C201442。本发明以人工合成完全抗原 CIT-KLH 为免疫原 ,CIT-BSA 为检测原包被酶标 板， 通过间接 ELISA 法筛选到一株阳性杂交瘤细 胞， 该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为建立检 测黄绿青霉素免疫检测方法奠定了基础。 (83)生物保。

3、藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103911352 A CN 103911352 A 1/1 页 2 1.一株杂交瘤细胞株8D8,已于2014年3月19日在中国典型培养物保藏中心， 保藏编 号是 ： CCTCC NO ： C201442。 2. 一种由权利要求 1 所述杂交瘤细胞株 8D8 产生的单克隆抗体。 3. 根据权利要求 2 所述的单克隆抗体的制备方法， 其特征在于将杂交瘤细胞株 8D8, 通过制备腹水和纯化， 获。

4、得单克隆抗体。 4. 如权利要求 1 所述杂交瘤细胞株 8D8 的应用， 其特征在于， 将杂交瘤细胞株 8D8 产 生的单克隆抗体用于检测黄绿青霉素 CIT。 5. 根据权利要求 4 所述杂交瘤细胞株 8D8 的应用， 其特征在于 , 将所述的单克隆抗体 配置在检测黄绿青霉素 CIT 的免疫试剂盒中。 6.根据权利要求4 所述杂交瘤细胞株8D8的应用， 其特征在于将所述的单克隆抗体制 成用于检测黄绿青霉素 CIT 的胶体金免疫试纸条。 权 利 要 求 书 CN 103911352 A 2 1/5 页 3 一株能稳定分泌抗黄绿青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株 技术领域 0001 本发明属于细胞工程。

5、领域， 具体涉及一株能稳定分泌抗黄绿青霉素单克隆抗体的 杂交瘤细胞株。 背景技术 0002 黄 绿 青 霉 毒 素 （Citreoviridin,CIT） 是 由 黄 绿 青 霉 菌 （Penicillum citreoviridin, PCV） 产生的次级毒性代谢产物。 CIT是一种具有心脏血管毒性、 神经毒性、 遗传毒性和致畸性的真菌毒素， 其急性中毒症状主要有瘫痪、 麻痹、 呕吐和呼吸衰竭。黄绿 青霉菌是污染粮食常见的真菌之一 能在较低温度和较高湿度下生长， 该菌在粮食、 饲料等 含水量增大时易生长并且产生 CIT， 严重危害人类健康。在克山病病因研究过程中， 我国学 者依据大量的流行病。

6、学事实和实验室研究的证据， 首次提出 CIT 是克山病的可疑病因。动 物实验表明， CIT 可造成大鼠心脏和肝脏的损伤， 其中大鼠心脏线粒体的病理改变类似克山 病患者的心肌病变。 0003 目前可以用来检测毒素的检测方法有很多种， 主要有薄层色谱法 (thin-layer chomatography techniques, TLC)、高 效 液 相 色 谱 法 (high performance liquid chromatography, HPLC)、紫 外 光 谱 技 术 (UV spectrum, UV)、红 外 光 谱 技 术 (IR spectrum, IR)、荧 光 检 测 技 术。

7、 (fluorescence detection, FD)、液 相 - 质 谱 联 用 (1iquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)、气 相 - 质 谱 联 用 (gas chromatography-mass spectrometry, GCMS) 等方法， 但这些方法都不利于实际生产检 验中的应用。而免疫学检测方法则是一种具有特异性好， 灵敏度高， 操作技术简单， 费用低 廉等特点的实用方法， 对样品的纯度要求不高等优点， 特别适合于大批量样本的检测， 近年 来被广泛普及应用于各种毒素的检测。 0004 由于 CIT 是于小分子化合物， 。

8、属于半抗原， 只有反应原性而无免疫原性， 不能刺激 机体产生免疫应答反应， 必须和蛋白质如牛血清白蛋白 （bovine serum albumin, BSA） 、 卵 清蛋白 （ovalbumin, OVA） 、 钥孔血蓝蛋白 （keyhole limpe themocyanin, KLH） 等或者其他 高聚物载体偶联后制成人工抗原才能激发有效的免疫反应， 获得相应抗体。 因此， 很少有人 用免疫学方法检测黄绿青霉素， 而且目前国内外针对该毒素的单克隆抗体制备及检测方法 的研究还未见报道， 制备出能稳定分泌抗黄绿青霉素的单克隆抗体杂交瘤细胞株， 为商品 化开发生产高质量的酶联检测试剂盒 , 胶。

9、体金试纸条的研制奠定坚实的基础。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一株能稳定分泌抗黄绿青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 0006 本发明首先保护一株杂交瘤细胞株 8D8, 已于 2014 年 3 月 19 日在中国典型培养 物保藏中心， 保藏编号是 ： CCTCC NO ： C201442。 0007 其次保护一种由所述杂交瘤细胞株 8D8 产生的单克隆抗体。 0008 所述的单克隆抗体的制备方法， 是将杂交瘤细胞株 8D8, 通过制备腹水和纯化， 获 说 明 书 CN 103911352 A 3 2/5 页 4 得单克隆抗体。 0009 本发明还保护了所述杂交瘤细胞株 8D8 的应用，。

10、 是将杂交瘤细胞株 8D8 产生的单 克隆抗体用于检测黄绿青霉素 CIT。 0010 所述杂交瘤细胞株 8D8 的应用， 一是将所述的单克隆抗体配置在检测黄绿青霉素 CIT 的免疫试剂盒中。 0011 二是将所述的单克隆抗体制成用于检测黄绿青霉素 CIT 的胶体金免疫试纸条。 0012 所述的杂交瘤细胞株 8D8 的制备方法是 ： 以人工抗原 CIT-KLH 为免疫原， 以人工 抗原 CIT-BSA 为检测原。人工抗原采用琥珀酸酐 - 碳二亚胺法制备。首先将血清效价达 到 1:106的 Balb/c 小鼠的脾细胞与 SP2/0 细胞用 50%PEG1450 按常规方法进行融合 ； 用含 20%。

11、 胎牛血清的 HAT RPMI-1640 培养基筛选融合细胞， 用融合表达的抗原包被酶标板进行 ELISA 检测 ； 经多次有限稀释法克隆化后获得可稳定分泌抗 CIT 单克隆抗体的杂交瘤细胞 株 8D8。将此细胞株以 1106/ 只的量注射到用液体石蜡预致敏过的 Balb/c 小鼠腹腔中， 一周后观察小鼠， 待小鼠腹部明显膨大且腹部皮肤具有紧张感时抽取腹水 （腹水中含有大 量的杂交瘤细胞株8D8分泌的单克隆抗体） 。 12000r/min， 30min离心后取上清， -20保存。 0013 本发明以人工抗原 CIT-KLH 为免疫原 , CIT-BSA 为检测原包被酶标板， 通过间接 ELIS。

12、A 法筛选到一株阳性杂交瘤细胞 8D8， 该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为建立检测 黄绿青霉素免疫检测方法奠定了基础。 附图说明 0014 图 1 是本发明杂交瘤细胞株在 100 倒置显微镜下的图片。 0015 图 2 是本发明单克隆抗体的纯化检测结果。 0016 图 3 是本发明杂交瘤细胞株的染色体分析图片。 0017 图 4 是本发明单克隆抗体的效价检测结果。 0018 图 5 是本发明单克隆抗体亲和力检测结果。 0019 图 6 是本发明单克隆抗体的特异性检测结果。 0020 图 7 是本发明单克隆抗体的交叉反应检测结果。 具体实施方式 0021 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制。

13、本发明的范围。本发明的杂交瘤细胞 株 8D8， 已于 2014 年 3 月 19 日在中国典型培养物保藏中心， 地址 : 武汉 武汉大学， 保藏编 号是 ： CCTCC NO ： C201442。 0022 实施例 1 本发明单克隆抗体的制备与鉴定 1、 黄绿青霉素人工完全抗原的制备 本实验将黄绿青霉素 （CIT） 与载体蛋白 （BSA 和 KLH） 进行交联形成具备免疫原性的人 工完全抗原 （CIT-BSA 和 CIT-KLH） 。整个交联过程分两步进行， 第一步， 用琥珀酸酐法将黄 绿青霉素分子 2 位上的羟基改造成羧基 ； 第二步， 用碳二亚胺法将改造后生成的羧基与载 体蛋白的氨基脱水缩。

14、合连接在一起。具体步骤如下 ： （1） 往棕色反应瓶中加少量的氢氧化钾固体粉末到瓶底， 盖上瓶子， 摇一摇， 然后静置 30min, 再用注射器吸取液体， 65烘箱中预热 30min。 说 明 书 CN 103911352 A 4 3/5 页 5 0023 （2） 称取琥珀酸酐粉末 60mg 溶于 500ul 无水吡啶中， 同时加等物质的量的 1mol/L DMAP,65烘箱中预热 30 60min， 活化琥珀酸酐。 0024 （3） 将琥珀酸酐溶液直接加入 1mg 的 CIT 固体中， 使其充分溶解， 然后用封口膜封 口， 放在 65条件下， 反应 7h。 0025 （4） 反应终止后， 直。

15、接将反应产物放到 4冰柜放置过夜。 0026 （5） 次日， 将其反应物取出在室温平衡3060min后， 对产物进行旋转蒸发干燥处 理， 主要是去除无水吡啶， 防止其对后续反应的影响。 0027 （6） 用 EDC 法进行第二步反应 ： 第一步的反应中间产物理论值是 1.25mg， 将其溶解 在 600ul（DMF: 水 =6:9） 的溶液中， 加入 12.5mg EDC, 避光混匀 30min。 0028 （7） 再加入 0.5%KLH （碳酸盐缓冲液 （0.05M pH9.6） 1ml， KLH 蛋白标准品 5mg, 先 将其在漩涡仪上振荡混匀， 在 12000r/min, 离心 5min。

16、） , 在低温摇床上 25避光反应 2h， 100r/min ； 然后再补加 EDC 12.5 mg， 继续低温摇床上 25避光反应 4h， 结束反应。 0029 （8） 用 1xPBS, pH 7.4 在 4冰柜透析 3 天， 每天换液两次， 将未反应完全的 CIT 透析掉。三天后吸出透析液， 分装 -20保存。 0030 用 0.013M 的 NaHCO3 溶液去活化 BSA 标准品， CIT-BSA 交联方法与上面类似。 0031 2、 单抗的制备 1） 小鼠免疫 以人工制备完全抗原 CIT-KLH 免疫 6-8 周龄雌性 Balb/c 小鼠。 0032 第一次免疫 ： 取完全抗原 CI。

17、T-KLH 与等体积弗氏完全佐剂混匀， 用漩涡振荡器与 注射器抽吸结合乳化完全后以每只 70g/100L 的量皮下多点注射 Balb/c 小鼠 ； 第二次免疫 ： 两周后取相同批次的完全抗原 CIT-KLH 与等体积弗氏不完全佐剂混匀， 乳化完全后以每只 70g/100L 的量皮下多点注射 Balb/c 小鼠 ； 第三次免疫 ： 两周后取完全抗原 CIT-KLH 与等体积弗氏不完全佐剂混匀， 乳化后以每 只 70g/100L 的量皮下多点注射与腹腔注射相结合的方式免疫 Balb/c 小鼠 ； 免疫一周 后尾部取血， 以CIT-BSA完全抗原包被酶标板， 间接ELISA检测血清效价。 若效价达到。

18、1:106 的小鼠脾细胞可用于细胞融合实验 ； 若未达到效价的小鼠可继续按常规方法免疫， 直到达 到效价达到为止。 0033 加强免疫 ： 取血清效价达到 1:106的小鼠， 融合前 3 天取完全免疫抗原 CIT-KLH 用 PBS 稀释混匀后以每只 50g/100L 的量腹腔注射 Balb/c 小鼠 ； 2） 免疫血清效价测定 采用间接ELISA检测方法测定血清效价 ： 取检测抗原CIT-BSA用0.05M pH 9.6的碳酸 盐缓冲液稀释， 以 2g/mL 的浓度包被酶标板， 100L/ 孔， 4过夜 ( 大于 12h) ； PBS 洗板 3 次拍干后用 5%PBSM 封闭， 200L/ 。

19、孔， 37， 2 h ； PBS 洗板 3 次拍干后， 用 PBST 按 1:500 开 始倍比稀释血清， 加入酶标板， 100L/ 孔， 37， 1 h ； 用 PBST 洗 3 遍， PBS 洗 3 遍将板拍干， 加入 1:4000 倍稀释的辣根过氧化物标记的山羊抗小鼠 IgG， 100L/ 孔， 37， 1 h ； 用 PBST 洗 3 遍， PBS 洗 3 遍将板拍干后加 TMB 显色， 100L/ 孔， 37， 10 min ； 用 2 M H2SO4终止反 应， 50L/孔 ； 测450nm吸光值， 以未免疫小鼠血清作为阴性对照， 以检测值大于阴性值2.1 倍为阳性来判断血清的效价。

20、。 0034 3） 细胞融合 说 明 书 CN 103911352 A 5 4/5 页 6 取血清效价大于 1:106的小鼠， 加强免疫后 3-4 天无菌解剖小鼠取其脾脏细胞， 将 1108个脾脏细胞与 2107个 SP2/0 细胞混合， 1500 rpm， 5min 离心后弃上清， 将离心 管底部的沉淀弹松散后将离心管置于 37水浴中， 1min 内缓慢加入 1 mL 37预热的 50%PEG1450 促进细胞融合 （注意尽量不要有气泡出现） ， 静置 1min 后缓慢加入 20 mL 37 预热的1640不完全培养液来终止PEG的作用， 先慢后快4-5min加完 ； 1000 rpm离心1。

21、0min， 弃上清， 加入2ml胎牛血清轻轻重悬细胞， 然后将细胞悬液转入预备铺板的HAT培养液中混 匀， 200L/ 孔铺板， 一次细胞融合可以铺 6-10 块 96 孔板 ； 融合后第二天观察有无污染情 况， 融合后第 3-4 天观察细胞融合情况， 融合 7-8 天后更换 HT 培养液培养。 0035 4） 阳性杂交瘤细胞的筛选 用间接ELISA法筛选细胞培养上清， 选择OD值较高的阳性孔用有限稀释法进行克隆化 2-3 次， 直至阳性率为 100% 为止。最后获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 8D8， 如图 1 所示。从图中可以看出， 在倒置显微镜下观察到该杂交瘤细胞株的细胞状态良好，。

22、 细胞增 殖速度快、 折光性好， 细胞孔中背景很干净。然后将该细胞株扩大培养后冻存。 0036 5） 腹水的制备与纯化 将杂交瘤细胞株 8D8 以 1106/ 只的量注射到用液体石蜡致敏过的 Balb/c 雌性小鼠 腹腔中， 一周后观察小鼠， 待小鼠腹部膨大且有紧张感时抽取腹水， 离心后分为三层 （由下 向上依次为细胞沉淀， 含有大量单克隆抗体的澄清透亮层， 脂质层） ， 然后取其澄清透亮的 中间层。该细胞分泌的抗体属于 IgG1型抗体， 利用传统的辛酸 - 饱和硫酸铵法从腹水中纯 化单克隆抗体， 接着用 10%SDS-PAGE 凝胶电泳检测验证抗体的纯度， 如图 2 所示。从图中可 以看出，。

23、 纯化后的抗体在 45KD 和 25KD 处有明显的条带， 分别对应 IgG 抗体的重链和轻链， 而且几乎没有杂带出现。由此表明辛酸 - 饱和硫酸铵法纯化 IgG 抗体效果很好。然后将纯 化的单克隆抗体于 -20保存。 0037 2. 单克隆抗体的特性鉴定 1） 染色体分析 ： 用0.1%秋水仙素 （0.25mol/L） 处理对数生长期细胞， 培养46 h后 悬起细胞， 1 000 rpm 离心 10 min， 弃上清， 加入 37预热的 0.075 mol/L KCl 10 mL 重悬 细胞， 37温箱静置1520 min ； 在细胞悬液中加入1 mL 新配制的甲醇-冰醋酸 （3:1） 固 。

24、定液， 混匀后室温静置5min， 1000 r/min离心10 min， 弃上清 ； 向细胞沉淀中再加入5 mL固 定液， 缓慢地重悬混匀细胞， 室温固定 20 30 min,1000 r/min 离心 10 min， 弃上清 ； 再加 入5ml的固定液对细胞固定过夜。 次日早上， 1000 r/min离心10 min， 弃上清。 再加200 300ul的固定液， 将细胞轻轻地吹起来， 混匀。 在冰冻载玻片上滴加12滴细胞悬液， 立即 吹散， 自然干燥， 用新配制 1:10 Giemsa 磷酸缓冲液染色 10 15 min， 蒸馏水冲洗， 晾干后 镜检， 显微照相与核型分析。如图 3 所示， 。

25、用 0.1% 秋水仙素对阳性杂交瘤细胞 8D8 进行处 理后， 染色并显微镜下观测， 计算处于分裂中期的杂交瘤细胞的染色体数目为 1066 条， 杂交瘤细胞的染色体数目接近于两个亲本的染色体数目之和， 证明该阳性杂交瘤细胞为骨 髓瘤细胞与脾细胞融合而成的。 0038 2）效价测定 ： 用间接 ELISA 法测定腹水抗体纯化前后的效价。将 CIT-BSA 以 0.5g/mL 的浓度包被酶标板， 腹水和纯化后的抗体分别从 1:500 开始倍比稀释， 二抗稀释 倍数为1:4000， TMB显色液显色10 min后终止， 测OD450nm。 结果腹水和纯化后的抗体效价 分别为 1:256000、 1:。

26、128000， 如图 4 所示， 带方格的曲线表示腹水的效价， 带三角形的曲线 说 明 书 CN 103911352 A 6 5/5 页 7 表示纯化后抗体的效价， 腹水的效价高于纯化后抗体的效价。纯化后抗体效价降低的原因 可能是在纯化过程中 PH 值和一些离子浓度对抗体活性造成影响， 最终导致抗体滴度降低。 0039 3） 浓度测定 ： 使用碧云天生物技术研究所的 BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测抗体浓 度， 腹水浓度为 43.3mg/mL， 纯化的单克隆抗体浓度为 6.6mg/mL。 0040 4） 抗体亚类鉴定 ： 使用 Sigma 公司的鼠单抗亚类鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的 亚类， 结。

27、果显示 8D8 杂交瘤细胞株分泌的抗体为 IgG1亚型。 0041 5） 抗体亲和力测定 ： 根据 Beatty 的方法测定抗体亲和力常数 Kaff。将 CIT-BSA 包被抗原倍比稀释 （1:200、 1:400、 1:800、 1:1600） 包被酶标板 4过夜。洗板后， 每个抗原 浓度分别加入倍比稀释的抗体。接下来步骤按照间接 ELISA 法检测。计算出每一个抗原浓 度在 IC50对应的抗体浓度， 按照下面公式可以计算出抗体亲和力 Kaff。 0042 抗体的亲和常数 Kaff 计算公式 ：， 式中 ： Ab 表示抗原浓度为 Ag 时 IC50对应的抗体浓度 ； Abt 表示抗原浓度为 。

28、Agt 时 IC50对应的抗体浓度 ； n=Ag/Agt。 0043 测定结果如图 5 所示， 利用 Origin8.1 软件对 ELISA 数据绘制拟合曲线 （得到各曲 线的 IC50， 最后根据公式计算出该抗体的亲和力为 4.57108L/mol， 为高亲和力抗体。 0044 6） 单抗特异性测定 采用 iELISA 法检测抗体的特异性。将 CIT-BSA、 T2-BSA、 AFB1-BSA、 DA-BSA、 Trx-CTX、 BSA、 KLH、 OVA 分别用包被液稀释至 1ug/ml, 包被酶标板， 4过夜。一抗按 1:250000 稀 释， 酶标羊抗鼠 IgG 二抗 1:8000 倍。

29、稀释， 酶标仪测定 OD450nm。结果如图 6 所示， 只有包被 CIT-BSA 的孔 OD450nm 的值很高， 包被其他抗原的孔 OD450nm 值很低， 接近于空白对照。由 此表明该单克隆抗体特异性很好， 与 T2-BSA、 AFB1-KLH、 DA-BSA、 Trx-CTX、 KLH、 OVA 没有交叉 反应， 与 BSA 有一点交叉反应。 0045 采用 ic-ELISA 法检测抗体的特异性。具体操作方法如下 ： 将 CIT、 AFB1、 DON、 FB1 和 T-2 五种真菌毒素分别作为竞争原， 用 1xPBS 分别将其稀释至不同浓度 （0, 0.001, 0.005, 0.01。

30、, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10ug/ml） , 然后每种毒素所对应的每一个浓度的 竞争原取50ul与等体积的适当浓度的抗体混匀板外37孵育30min,再将其混合液加入包 被有 CIT-BSA 检测原的酶标孔中 37竞争 30min。随后加入 1:8000 倍稀释的酶标羊抗鼠 IgG 二抗， 显色终止后， 酶标仪测定 OD450nm。绘制各种毒素的抑制曲线， 并求出各自在 IC50 时的浓度， 再按下列公式计算交叉反应率。 0046 S%= CCIT/Cother x100% 其中， S 表示交叉反应率， CCIT 表示 IC50时 CIT 标准品浓度， Cother表示 IC50时其他毒素 标准品浓度。结果如图 7 所示， 该单克隆抗体特异性很好， 只与 CIT 反应， 而与其他真菌毒 素 （T2、 AFB1、 FB1 和 DON） 没有交叉反应。 说 明 书 CN 103911352 A 7 1/3 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103911352 A 8 2/3 页 9 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103911352 A 9 3/3 页 10 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103911352 A 10 。