一种高效液相色谱-串联质谱检测血浆甲基丙二酸的方法及试剂盒技术领域
本发明属于生物标记物体外检测领域，具体涉及一种甲基丙二酸的高效液相色
谱-串联质谱技术检测方法及试剂盒，特别为一种用于检测血浆标本甲基丙二酸的专用检
测方法和试剂盒。
背景技术
甲基丙二酸血症(methylmalonic acidemia，MMA)是一种常见的有机酸血症，属于
常染色体隐性遗传病，主要是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-CoA mutase，
MCM)或其辅酶钴胺素(VitB12)代谢缺陷所致。甲基丙二酸血症可于出生后不久或任何年龄
段起病并迅速恶化，易反复发生代谢性酮症酸中毒，可出现拒食、嗜睡、昏迷、反复呕吐、脱
水、呼吸困难、肌张力低下及生长发育迟缓等症状，导致早期死亡或各种神经功能障碍。
基于质谱技术的遗传代谢病生化诊断是目前应用广泛且较为成熟的方法。由于生
物样本中存在浓度相当的甲基丙二酸同分异构的丁二酸(butanedioic acid)，它与甲基丙
二酸的色谱性质及质谱碎片性质十分相近，使得其特异性检测难度加大。我国目前多采用
气相色谱质谱联用(GC-MS)分析法检测分析血浆和尿液中的MMA浓度，但其灵敏度不足，通
常需采用衍生化的方法，前处理复杂、分析时间长。国外虽有少量使用高效液相色谱-串联
质谱技术(HPLC-MS/MS)检测血浆中MMA的报道，但仍需要进行衍生化、固相萃取等前处理步
骤才能将甲基丙二酸和丁二酸实现分离。目前缺乏相应的检测试剂盒应用于临床检测，限
制了其在临床上的应用。因此，开发稳定的基于HPLC-MS/MS技术的检测MMA的方法，并研制
相应的检测试剂盒能够为临床提供更加准确可靠的检测方法，对提高国内甲基丙二酸血症
的诊断治疗水平具有重要意义。
本发明所述HPLC-MS/MS检测方法，前处理更加简单、方便，仅仅需要一步溶剂处理
过程，达到蛋白沉淀和样本萃取双重效果，时间大大缩短，不需要衍生化和/或固相萃取步
骤，通过色谱条件优化，能将甲基丙二酸与丁二酸实现基线分离，提高了定量的准确性。通
过开发的新的HPLC-MS/MS检测方法研制相应的检测试剂盒，能够为临床提供更加准确可靠
的检测方法，进而提高国内甲基丙二酸血症的检测诊断水平。
发明内容
本发明的目的是解决现有血浆中甲基丙二酸检测方法技术中存在的部分问题，提
供一种高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中甲基丙二酸的方法及试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中甲基丙二酸的方法，包括如下步骤：
采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆样本中检测甲基丙二酸，
利用高效液相色谱将甲基丙二酸与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标
物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算甲基丙二酸的含
量；
质谱条件为：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；喷雾电
压为5000V；碰撞气为3；气帘气为10；离子源气流GS1为50，GS2为30；离子源温度为300℃；目
标物甲基丙二酸：m/z 117→73、同位素内标甲基丙二酸-d3：m/z 120.2→76；甲基丙二酸及
内标的去簇电压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表1。
表1甲基丙二酸及内标的质谱参数
色谱条件为：
流动相A：2.0mmol/L乙酸铵水溶液，pH 4.5；
流动相B：乙腈，纯度为质谱纯；
色谱柱型号：PEEK -HILIC zwitterionic column，100mm×2.1mm，3.5μm；
采用80％B等度洗脱的方式，洗脱3min；
流速为0.4mL/min，柱温为30℃，进样体积为20μL；
优选地，所述经预处理的实际样本按照如下方法制备得到：取200μL血浆于2mL离
心管中，加入尿素酶，置于37℃温箱温育30分钟去除尿素，加入20μL内标及800μL无水乙醇，
10000rpm离心5分钟去除蛋白后，取上清液，50℃高纯氮气吹干，以500μL 80％乙腈水复溶，
涡旋3min；13000r/min，离心3min，进样检测。
优选地，所述内标溶液配制：称取甲基丙二酸-d3，用超纯水用水溶解后配制成
196mmol/L的储备液。将储备液用水稀释至甲基丙二酸-d3 0.25μmol/L)即得实验用内标溶
液。
优选地，所述蛋白沉淀剂为无水乙醇。
优选地，所述氮气吹干温度为40～50℃。
本发明的另一方面包括一种高效液相色谱串联质谱技术检测血浆样本中甲基丙
二酸的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：2.0mmol/L乙酸铵水溶液，pH 4.5；
洗脱液B：乙腈，纯度为质谱纯；
(2)校准品：
所述校准品的配制主要包括标准品母液的配制：
标准品母液：甲基丙二酸的水溶液；
配制：精确称取12.5mg甲基丙二酸标准品，用纯水溶解定容至50mL，得0.25mg/mL
(2.1mmol/L)的储备液，用纯水依次稀释得标准品母液I：21μmol/L和标准品母液II：100μ
mol/L。
优选的，将标准品母液用稀释液稀释成6个不同浓度的校准品：0.05，0.10，0.25，
0.50，1.0，2.0μmol/L甲基丙二酸。
所述不同浓度的校准品各1mL，保存于-20℃条件下。
(3)内标液：甲基丙二酸-d3水溶液；
称取甲基丙二酸-d3，用超纯水用水溶解后配制成196mmol/L的储备液。将储备液
用水稀释至甲基丙二酸-d3 0.25μmol/L)即得实验用内标溶液。
(4)稀释液：所述稀释液为空白血清基质溶液，该空白血清基质溶液为活性炭吸附
人血清。
(5)蛋白沉淀剂：无水乙醇。
(6)质控品：甲基丙二酸空白血清基质溶液。分低中高浓度的QC1、QC2、QC3，甲基丙
二酸浓度分别为：0.1μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L。
具体而言，本发明提供一种高效液相色谱串联质谱法检测血浆样本中甲基丙二酸
的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样本预处理：将血浆样本用尿素酶处理，加入无水乙醇沉淀，取上清，氮气吹
干，乙腈水溶液复溶；
(2)HPLC色谱分离：将步骤(1)预处理后的样本10-50μL上样至PEEK-HILIC
柱，以A∶B＝20∶80等度洗脱3min；其中洗脱液A为乙腈，洗脱液B为pH3.0-6.5的缓冲液；
(3)质谱检测：选择ESI负离子模式，质谱参数如下：碰撞气(CAD)为4Psi、气帘气
(CUR)为7Psi、离子喷雾电流(NC)为3μA、温度为500℃。
本发明所述的方法，其特征在于，步骤(1)在将血浆样品用尿素酶处理后还包括加
入甲基丙二酸-D3的操作。
本发明所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体操作如下：取200μL血浆于2mL
离心管中，加入尿素酶，置于37℃温箱温育30min去尿素，加入20μL 0.25μmol/L的甲基丙二
酸-D3及800μL无水乙醇，1000rpm离心5min，取上清，氮气吹干，以500μL 80％乙腈水溶液复
溶。
本发明所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)取预处理的样本20μL上样，以流速
0.2-0.4mL/min洗脱，所述洗脱液B为pH4.5，2.0mmol/L的乙酸铵缓冲液。
本发明所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中多反应检测器(MRM)对甲基丙二
酸的参数如下：去簇电压(DP)为60V、碰撞电压(CE)为32V、碰撞池入口电压(EP)为10V、碰撞
池出口电压为2V。
本发明所述的方法，其特征在于，还包括利用系列浓度的甲基丙二酸标准品制备
标准曲线的步骤，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立
校准曲线，计算血浆样本中甲基丙二酸的含量。
本发明还提供一种用于高效液相色谱串联质谱法检测甲基丙二酸方法的试剂盒，
其包括：洗脱液、稀释液、蛋白沉淀剂、质控品、复溶液、色谱柱。
本发明所述的试剂盒，其特征在于：
所述洗脱液包括洗脱液A：2.0mmol/L乙酸铵水溶液，pH4.5；和洗脱液B：质谱纯乙
腈；
所述稀释液为空白血清基质；
所述蛋白沉淀剂为无水乙醇；
所述质控品为以稀释液配制的，浓度分别为0.1μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L的
甲基丙二酸空白血清基质溶液；
所述复溶液为80％乙腈水溶液；
所述色谱柱为PEEK-HILIC，100mm×2.1mm，3.5μm，柱。
本发明所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有标准品和内标液；所述标
准品是浓度分别为0.05，0.10，0.25，0.50，1.0，2.0μmol/L的甲基丙二酸水溶液；所述内标
液是超纯水配制的0.25μmol/L的甲基丙二酸-d3水溶液。
本发明还提供所述试剂盒在高效液相色谱串联质谱法检测甲基丙二酸方法中的
应用。
本发明所述方法和试剂盒用于非诊断目的的体外检测、样本分析等。
本发明取得的以下有益的技术效果：
(1)对前处理方法的改良，不需要衍生化和/或固相提取过程，前处理更加简单、快
捷，可实现批量处理；利用PEEK-HILIC zwitterionic column，100mm×2.1mm，3.5μm
色谱柱，通过条件优化实现了甲基丙二酸和丁二酸的有效分离。
(2)利用ESI离子化模式，优化了质谱条件大大提高了检测信号的灵敏度；方法学
考察结果显示，该方法精密度、准确度、稳定性均满足定量分析要求；本发明方法具有准确
度高、重现性好，稳定、可靠的特点，可用于血浆中甲基丙二酸的检测。
(3)与GC-MS/MS方法相比提高灵敏度，操作简单，节约分析成本，所需分析时间较
短，利于开展大批量样本检测，适于进行人群中相关疾病的筛查；为我国甲基丙二酸血症的
诊断治疗提供可靠的检测方法和检测试剂盒。
附图说明
图1：血浆中甲基丙二酸、丁二酸、内标分子的HPLC-MS/MS图谱。
具体实施方式：
表1甲基丙二酸和甲基丙二酸-d3的质谱参数
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用
于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按
照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟
练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于
本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：仪器、材料与试剂
串联质谱仪(AB Sciex API 5500)，高效液相(Shimadzu LC-20AD XR system)。甲
基丙二酸、丁二酸、乙酸铵和乙酸均是从Sigma公司的产品。甲基丙二酸-d3购自Cambridge
Isotope Laboratories。活性炭吸附血清从Equitech-Bio，Inc.(美国)购买。HPLC级乙醇购
自J.T.Baker公司，质谱级乙腈购自Merck公司，15-mL离心管购自Kirgen公司，容量瓶购自
BRAND GMBH+CO KG(德国)。纯水是通过Millipore Simplicity UA纯水仪纯化得到。
实施例2：校准品和内标液的配制方法，包括下列步骤：
(1)标准品母液制备
精确称取12.5mg甲基丙二酸标准品，用纯水溶解定容至50mL，得0.25mg/mL
(2.1mmol/L)的储备液，用纯水依次稀释得标准品母液I：21μmol/L和标准品母液II：100μ
mol/L。
(2)标准品配制
优选的，将标准品母液用稀释液稀释成6个不同浓度的校准品：0.05，0.10，0.25，
0.50，1.0，2.0μmol/L甲基丙二酸。所述不同浓度的校准品各1mL，保存于-20℃条件下。
(3)内标液甲基丙二酸-d3水溶液制备
称取甲基丙二酸-d3，用超纯水用水溶解后配制成196mmol/L的储备液。将储备液
用水稀释至甲基丙二酸-d3 0.25μmol/L)即得实验用内标溶液。
实施例3：血浆样本前处理流程的确定，包括下列步骤：
取200μL血浆于2mL离心管中，加入尿素酶，置于37℃温箱温育30分钟去除尿素，加
入20μL内标及800μL无水乙醇，10000rpm离心5分钟去除蛋白后，取上清液，50℃高纯氮气吹
干，以500μL 80％乙腈水复溶，涡旋3min；13000r/min，离心3min，进样检测。
实施例4：色谱条件的优化
色谱柱选择：
所述色谱柱选择，预实验中使用PEEK-HILIC zwitterionic column，100mm
×2.1mm，3.5μm，柱；Phenomenex Kinetex-C18，100×2.1mm，2.6μm；赛默飞世尔
Hypersil gold，50×2.1mm，5μm；岛津Shim-park XR-ODS II，7.5×2.0mm，2.2μm等4款不同
色谱柱进行样本分析。结果表明PEEK-HILIC zwitterionic column，100mm×2.1mm，
3.5μm，柱对甲基丙二酸和丁二酸的分离效果最佳。其他四种HPLC柱对二者分离效果
欠佳，分析其原因可能是由于二种化合物极性导致，在C18柱中甲基丙二酸保留太弱，而且
不能与丁二酸分离。在HILIC柱中甲基丙二酸有良好的保留，PEEK-HILIC
zwitterionic column，100mm×2.1mm，3.5μm对目标化合物甲基丙二酸有较好的保留和较
高的柱效，而且能够将甲基丙二酸与丁二酸分离，有助于提高检测的特异性和灵敏度，故选
其作为该方法的色谱柱。
进样量选择：
对比10、20、30、40和50μL进样量，结果表明，高进样量会导致样品峰过载，使得峰
形变差，甚至出现开叉峰。进样量太低会导致检测灵敏度降低。20μL进样时，峰形好，少量进
样量可以节约样品，灵敏度也能满足检测需求。因此，选择进样量为20μL进行实验。
缓冲盐的种类和浓度：
通过比较甲酸铵(1.0mmol/L)、乙酸铵(1.0mmol/L)和氟化铵(1.0mmol/L)。分析物
峰宽都差不多，以峰高比较。结果表明适当浓度乙酸铵可提高其离子化效率。故选择乙酸铵
作为分析的缓冲盐。
分别配制不同浓度的乙酸铵缓冲液：0.2、0.5、1.0、2.0和5.0mmol/L，以1.0nmol/L
浓度标准品进样，比较在不同乙酸铵浓度下，出峰的响应值和S/N。结果表明，当乙酸铵的浓
度为2.0mmol/L时，其响应值和S/N均最大。因此，选择此浓度进行为缓冲盐浓度。
调节乙酸铵缓冲液pH：3.0、4.0、4.5、5.5、6.5以1.0nmol/L浓度标准品进样，比较
色谱峰的响应值和S/N。结果表明，当pH＝4.5时，其响应值和S/N均最大。说明在pH＝4.5时，
化合物更易离子化，因此，选择此pH作为缓冲液pH。
流动相两相比例：
所述流动相两相比例的确定是在满足适当的样本保留和良好的色谱峰峰形的情
况下得到，在流速为0.2mL/min条件下，采用80％B等度洗脱的方式，洗脱3min，目标物峰型
良好，且出峰时间较快，因此选择该条件进行洗脱。
实施例5：质谱条件的优化：
所述质谱条件的确定是按照以下步骤得到：比较相同浓度分析物在大气压化学电
离(APCI)和电喷雾电离(ESI)两种电离模式下的离子响应，发现ESI模式下响应高，选择ESI
模式。然后对比ESI模式下的正负离子强度，发现负离子模式响应高，选择负离子模式。
所述离子模式确定后，再优化多反应监测器(MRM)条件，具体包括以下步骤：根据
分析物分子量，确定分析物母离子，通过在ESI负离子模式下，采用7μL/min的针泵注射标准
溶液，进行母离子扫描，扫描范围：10-150Da，扫描速度：200Da/s。在图谱中寻找分析物母离
子，然后选择特点的母离子进行子离子的选择。
所述子离子的选择按照以下步骤得到：选择特定的母离子后进行子离子扫描，扫
描范围：10-150Da，扫描速度：200Da/s。调节DP，来寻找响应最高的子离子。确定好母离子和
子离子后，进行质谱参数和MRM条件的优化。
所述质谱参数的优化需要优化以下参数：碰撞气(CAD)、气帘气(CUR)、雾化气、喷
雾电压、温度。
所述MRM条件的优化需要优化以下参数：去簇电压(DP)，碰撞电压(CE)，碰撞池入
口电压(EP)，碰撞池出口电压(CXP)，驻留时间(Dwell time)。
优选地，所述质谱条件为在电喷雾电离(ESI)负离子检测模式下，采用多反应监测
(MRM)的质谱扫描模式；气帘气(CUR)为7，碰撞气(CAD)为4，离子喷雾电流(NC)为3，温度为
500℃，离子源气流(GS1)为10。所述离子对：甲基丙二酸：m/z 117→73、同位素内标甲基丙
二酸-d3：m/z 120.2→76。甲基丙二酸和甲基丙二酸-d3：的质谱参数见表1。
表1甲基丙二酸及内标的质谱参数
实施例6：方法验证
所述甲基丙二酸的高效液相色谱串联质谱技术检测方法MRM监测色谱图：甲基丙
二酸及内标甲基丙二酸-d3的标准品及血浆样品中的峰形对称，基本没有杂质干扰，其异构
体丁二酸在该条件下能够与甲基丙二酸分离，表明该条件能够用于血浆中甲基丙二酸的定
量分析。
校准曲线：采用同位素内标定量法，利用Analyst软件以标准品与内标的浓度比为
X轴，标准品与内标峰面积比为Y轴，建立曲线，计算血浆中甲基丙二酸的浓度。甲基丙二酸
在0.05～2.0μmol/L范围内线性较好，相关系数在0.99以上，满足定量要求。
检测灵敏度：本方法检测甲基丙二酸的检测限(LOD)分别为：0.02μmol/L，定量限
(LOQ)则为0.04μmol/L，重复4次检测CVs分别为11％。所述LOD满足信噪比(S/N)＞3，LOQ满
足信噪比(S/N)＞10，且重复4次检测CVs＜20％。
精密度试验：取500μL血浆基质，分别加入低、中、高三个浓度的甲基丙二酸标准品
溶液，血浆基质中甲基丙二酸浓度为0.18μmol/L，分别加入浓度为0.1、0.5、1.0μmol/L甲基
丙二酸。批内精密度是每个样本重复测定20次。批间精密度每天做3批，每批测定3次，每批
均作标准曲线，连续测定5天，共15次测量。结果批内精密度：CV：1.6％-5.0％；批间精密度
(n＝15)，CV：3.1％-6.3％。
回收率试验：取500μL血浆基质，分别加入0、低、中、高浓度的标准品溶液，使其理
论浓度0.18、0.28、0.68、1.18ng/ml，每个浓度平行做6个样本，重复操作3次。结果显示，血
浆基质中甲基丙二酸的加标回收率在93％～98％之间，3次重复试验的RSD在2.5％～6.6％
范围内。
实施例7：高效液相色谱串联质谱技术检测血浆样本中甲基丙二酸的试剂盒。
表2高效液相色谱串联质谱技术检测甲基丙二酸的试剂盒组分
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，
任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，
都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护
范围为准。