海绵提取物的生物活性SRB测定方法技术领域
本发明属于海洋生物医药技术领域，具体涉及一种海绵提取物的生物活性SRB测定方法。
背景技术
海洋生物碱作为海洋生物的一种特征次级代谢产物，以其结构的新颖性、多样性和显著的生物活性成为海洋天然产物的重要研究对象。到目前为止，海洋来源的天然产物已经超过20000个，其中约三分之一的化合物含有氮原子，在46个海洋药物中，33个属于生物碱。海绵一直是海洋生物碱的主要来源，研究报道Calcarea纲中富含咪唑生物碱，在过去的30年中，共分离得到60多个咪唑生物碱。这类生物碱具有显著的抗菌、抗炎和细胞毒活性。
海绵是生物碱的主要来源，这些生物碱具有结构类型新颖，生物活性好的特征。Calcarea纲的海绵分布与全球各个海域，其中Leucetta和Clathrina属海绵被报道其特征性化学成分为咪唑类生物碱，在过去30年中，从这两个属中分离到的咪唑类生物碱已超过60个。咪唑类生物碱的结构以2-氨基咪唑环为基本母核，2位氨基通常连有取代基乙内酰脲，N1，C-4，C-5位常连有苯环取代基，C-4，C-5位连有苯环的称为naamines或naamidines，N1，C-4位连有苯环的结构类型称作isonaamines或isonaamidines。
发明内容
本发明旨在为海绵的提取物提供一种方便可靠的生物活性测定方法。
一种海绵提取物的生物活性SRB测定方法，步骤如下：
(1)取对数期的肿瘤细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基调整细胞悬液的浓度为2×105个/ml，每孔200μL加入96孔板中，每孔加入不同浓度的样品溶液2μL；
(2)37ºC培养17h；
(3)离心3min(4ºC、3000prm)，吸去上清；
(4)每孔加入50μL预冷的80%TCA溶液，移入4ºC冰箱中固定1.5h，再用去离子水冲洗5次，室温晾干；
(5)每孔加入0.5%SRB染液(1%的TCA溶液)50μL，室温静置30min后，用预冷的1%TCA水溶液冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干；
(6)每孔加入150μL非缓冲Tris溶液溶解(10mM，pH=10.5)与蛋白结合的染料，用酶标仪在520nm下测定每孔吸光度OD值。在96孔板中每个样品浓度设3孔，另设空白对照3孔，取3孔平均值，按公式IR(%)=(OD空白-OD样品)/OD空白×100%计算细胞增殖抑制率(IR%)，再利用Bliss方法由各种浓度的IR求出半数抑制浓度(IC50)的标准差和平均值。
本发明的测定原理：磺酰罗丹明B(SulforhodamineB，SRB)比色法，主要用来检测细胞增殖情况。SRB是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合；在520nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。
本发明的测定方法相对于现有技术简单快速、而且检测结果可靠，适于推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
选择HeLa和A549肿瘤细胞株用SRB法对从海绵分离得到的咪唑生物碱类化合物(PH-1 ~ PH-5)进行了体外抗肿瘤活性筛选，对初筛结果见表1-2，分析表中数据可以看出在浓度为50 μM浓度水平，化合物PH-4对肿瘤细胞株HeLa、A549表现出强的抑制活性，抑制率在90%左右，化合物PH-5对两种肿瘤细胞株均表现出强的抑制活性，抑制率都在90%以上，化合物(PH-1 ~ PH-3)对两种细胞株的抑制活性均较弱。
表1 化合物 PH-1 ~ PH-5 对 HeLa 肿瘤细胞株的抑制率(%)
表2 化合物 PH-1 ~ PH-5 对 A-549 肿瘤细胞株的抑制率(%)
对初筛活性较好的化合物(抑制率大于 30%)进行了 IC50测试。IC50结果显示化合物 PH-4 对 HeLa 和 A549 细胞株显示出中等强度的抑制活性,IC50值分别为 21.4 和 22.1uM。由此可以看出化合物 PH-4，PH-5 对肿瘤细胞株具有高度的选择性，且对 K562 细胞株具有较强的细胞毒活性。