蛹虫草多糖多维指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱技术领域
本发明涉及中药和功能食品原料及其制品的指纹图谱技术领域，具体涉及一种利
用多维指纹图谱来控制蛹虫草多糖质量的方法。
背景技术
蛹虫草(Cordycepsmilitaris)又名北冬虫夏草、北虫草、蛹草等。蛹虫草作为我国
传统珍贵中药材，人民对其药用价值早有研究和认识，1518年李时珍在《本草纲目》中记载，
蝉花能主治“小儿天吊惊痫，夜啼，心悸”。据敬一兵等考证，当时的“蝉花”包括了蝉虫草
(C. sobolifera) 和蛹虫草(C. militaris)等多种寄生于蛹体或虫体上的虫草。蛹虫草传
统民间用于肺炎、肾虚、腰痛等疾病的治疗。除了其作为滋补良药受到社会各阶层的广泛认
可，蛹虫草的化学成分，已广泛用于现代医药和食品行业。
蛹虫草多糖作为蛹虫草中最重要的活性成分之一，也是蛹虫草中含量最多的药理
活性成分，已经报道的蛹虫草多糖药理活性包括：调节免疫、抗肿瘤、抗氧化延缓衰老、保肝
护肝、抗炎和降血糖等作用。蛹虫草多糖经过检测分析，主要是由葡萄糖、甘露糖、阿拉伯
糖、半乳糖、鼠李糖和木糖等组成的杂多糖，另外还含有蛋白及核酸等复合物的结合，已经
报道的蛹虫草纯化后多糖的分子量从几千到几十万道尔顿不等，因此，蛹虫草多糖为一种
复杂的大分子的化合物，具有多种特殊的且在大多数情况下相当复杂的化学结构，主要表
现在：组成多糖的单糖种类、分子量及分布、多糖复合物组成（蛋白和核酸）、糖链结构以及
高级结构等均非常复杂，而单一的化学分析法、仪器分析法难以识别一般多糖的多方面的
结构特征，这些因素均会影响多糖的质量，从而影响多糖的活性以及蛹虫草药材的药效，因
此，如何用简便、快捷、准确的方法来控制蛹虫草多糖的质量，是亟待解决的一个难题。
现有单一指纹图谱的方法具有难以克服的缺点，即难于判定未知样品是否符合标
准样品的指纹图谱，时而出现假阳性结果。因此，本发明目的是为了克服现有蛹虫草多糖质
量控制技术的缺点与不足，通过对蛹虫草多糖的多维指纹图谱构建方法的研究和标准多糖
指纹图谱的构建，提供一种利用多维指纹图谱来有效控制蛹虫草及蛹虫草多糖质量的方
法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种蛹虫草多糖多维指纹图谱的构建方法及其
标准指纹图谱，该方法具有操作简单、稳定、灵敏、精密度高、重现性好等优点，能从色谱的
整体特征面貌上把握蛹虫草多糖质量情况，为蛹虫草质量控制和真伪鉴别提供了新的科学
方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种蛹虫草多糖多维指纹图谱的构建方法，包括从蛹虫草中提取蛹虫草多糖，将提取
的蛹虫草多糖，经紫外吸收光谱指纹分析、傅里叶变换红外光谱指纹分析和高效凝胶渗透
色谱法指纹分析，获得蛹虫草多糖的UV光谱标准指纹图谱、IR光谱标准指纹图谱和HPGPC色
谱标准指纹图谱的多维指纹图谱构建方法。
优选的，蛹虫草多糖多维指纹图谱的构建方法，包括如下步骤 ：
（1）蛹虫草多糖的制备
取干燥的蛹虫草药材，粉碎，除去含有的脂溶性化合物；药材残渣蒸馏水提取，浓缩，加
入无水乙醇沉淀，干燥后得蛹虫草多糖；
（2）蛹虫草多糖的紫外吸收光谱指纹分析及标准指纹图谱的确定
称取烘干至恒重的蛹虫草多糖，以蒸馏水溶解，得蛹虫草多糖溶液；采用紫外-可见分
光光度计对蛹虫草多糖溶液于250～400 nm区间进行扫描，得蛹虫草多糖UV吸收光谱图，再
使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件处理图谱，并进行数据处理与分析，得到蛹虫草多
糖的UV光谱标准指纹图谱；
（3）蛹虫草多糖的傅里叶变换红外光谱指纹分析及标准指纹图谱的确定
称取烘干至恒重的蛹虫草多糖，在红外灯下，经压片法压片，以干燥的KBr为空白样品
扣除背景吸收后，将样品与KBr混合研磨压片，在4000-500cm-1的区间范围内进行红外光谱
扫描，保存蛹虫草多糖的红外吸收图谱以及其数据，运用中药色谱指纹图谱相似度评价软
件处理图谱，并进行数据处理与分析，得到蛹虫草多糖的IR光谱标准指纹图谱；
（4）蛹虫草多糖的高效凝胶渗透色谱法指纹分析及标准指纹图谱的确定
称取烘干至恒重的蛹虫草多糖，以蒸馏水溶解，离心，取上清液，用微孔滤膜过滤，得蛹
虫草多糖HPGPC分析供试液，上样于Sephacryl S-300 HR column凝胶渗透色谱柱，以蒸馏
水作为洗脱液，经高效凝胶渗透色谱仪分离检测，得蛹虫草多糖的HPGPC色谱图，运用中药
色谱指纹图谱相似度评价软件处理图谱和数据，得到蛹虫草多糖的HPGPC色谱标准指纹图
谱。
进一步优选的，步骤（4）中，恒流泵调节凝胶渗透色谱柱的流速为0.3 mL/min，柱
温：30℃，检测器：紫外检测器系统，收集器收集到的每管样品溶液经苯酚-硫酸法显色，测
定其吸光度，从而检测出蛹虫草多糖样品的出峰液分布，得蛹虫草多糖的HPGPC色谱图。
优选的，蛹虫草多糖各组分的分子量测定为：
标准曲线的绘制：分别称取标准葡聚糖T4，分子量4000 Da；标准葡聚糖T7 ，分子量
7000 Da；标准葡聚糖T10，分子量10000 Da；标准葡聚糖T40，分子量40000 Da；标准葡聚糖
T70，分子量70000 Da；标准葡聚糖T200，分子量200000 Da；蓝葡聚糖，分子量2000000 Da；
以及无水葡萄糖，分子量180 Da；分别溶解于蒸馏水中，分别上凝胶渗透色谱柱Sephacryl
S-300 HR column，以蒸馏水为洗脱液，调节凝胶渗透色谱柱流速为0.3 mL/min，柱温：30
℃，检测器：紫外检测器系统，用苯酚-硫酸法显色后测定样品出峰液分布；
计算各标准葡聚糖T4-T200出峰的洗脱体积Ve，利用已知分子量为200万Da的蓝葡聚糖
确定凝胶渗透色谱柱的空体积Vo，利用无水葡萄糖确定凝胶渗透色谱柱的总体积Vt；以有
效分配系数Kav为纵坐标，以分子量的对数lgMw为横坐标作标准曲线；分配系数Kav由以下
公式求得：Kav = (Ve-Vo) /(Vt-Vo)；其中，Ve是待测样品的洗脱体积，Vo是凝胶渗透色谱
柱的空体积，Vt是凝胶渗透色谱柱的总体积；
各标准葡聚糖T4-T200、蓝葡聚糖以及无水葡萄糖经凝胶渗透色柱Sephacryl S-300
HR column检测后，以有效分配系数Kav为纵坐标，以分子量的对数lgMw为横坐标作标准曲
线；计算得标准曲线方程为y = -0.36x + 2.1722，其R2 = 0.998，表明构建的标准曲线模型
精确，回归效果和回归拟合效果显著；根据所得的多糖样品的出峰液分布数据，代入所求得
的标准曲线方程，从而计算出蛹虫草多糖中各组分的分子量及其分布。
蛹虫草多糖多维指纹图谱的构建方法得到的标准指纹图谱：蛹虫草多糖的UV光谱
标准指纹图谱中，在270 nm～280 nm处有吸收。
蛹虫草多糖的IR光谱标准指纹图谱共有特征峰为11个，11个共有特征峰的波长λ
的相对标准偏差RSD均小于2％，即：
1号峰，平均吸收波长λ为3395.2 cm-1，RSD值为0.95%；
2号峰，平均吸收波长λ为2923.8 cm-1，RSD值为0.43%；
3号峰，平均吸收波长λ为1642.1 cm-1，RSD值为0.52%；
4号峰，平均吸收波长λ为1417.3 cm-1，RSD值为0.61%；
5号峰，平均吸收波长λ为1248.6 cm-1，RSD值为0.36%；
6号峰，平均吸收波长λ为1025.4 cm-1，RSD值为0.78%；
7号峰，平均吸收波长λ为895.2 cm-1，RSD值为0.73%；
8号峰，平均吸收波长λ为826.5cm-1，RSD值为0.82%；
9号峰，平均吸收波长λ为765.1 cm-1，RSD值为0.51%；
10号峰，平均吸收波长λ为610.9 cm-1，RSD值为0.34%；
11号峰，平均吸收波长λ为532.6 cm-1，RSD值为0.63%。
优选的，蛹虫草多糖的IR光谱标准指纹图谱中，在波长3395.2 cm-1处为O-H的伸缩
振动吸收峰，表明有氢键存在；2923.8 cm-1处为C-H的伸缩振动吸收峰；1642.1 cm-1处为C=
O伸缩振动吸收峰；1417.3 cm- 1处为C-O伸缩振动吸收峰，表明有糖醛酸；1248.6 cm-1处为
环上C-C键的骨架振动吸收峰；1025.4 cm-1处为醇羟基的C-O伸缩振动吸收峰；895.2 cm-1
处为β-端基差向异构的C-H变角振动吸收峰，表明有β-型糖苷键；826.5 cm-1处为α-端基差
向异构的C-H变角振动吸收峰，表明有α-型糖苷键；765.1 cm-1处为C-H的摇摆振动吸收峰；
532.6 cm-1处为CCO的变形振动吸收峰。
蛹虫草多糖的HPGPC色谱标准指纹图谱共有特征峰为4个，4个共有特征峰的相对
保留体积的相对标准偏差RSD均小于2％，即：
1号峰，平均相对保留体积V为93.5 mL，RSD值为0.58%；
2号峰，平均相对保留体积V为135.8 mL，RSD值为1.25%；
3号峰，平均相对保留体积V为235.2 mL，RSD值为0.96%；
4号峰，平均相对保留体积V为305.4 mL，RSD值为0.83%。
蛹虫草多糖的HPGPC色谱标准指纹图谱中，
1号峰，相对平均分子量为1.18×106 Da；
2号峰，相对平均分子量为4.32×105 Da；
3号峰，相对平均分子量为3.38×104 Da；
4号峰，相对平均分子量为6.54×103 Da。
其中，Da全称道尔顿（Dalton），是分子量常用单位。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
（1）本发明以蛹虫草为原料，构建蛹虫草多糖多维指纹图谱，包括构建蛹虫草多糖紫外
吸收光谱（UV）指纹图谱、傅里叶变换红外光谱（IR）指纹图谱以及高效凝胶渗透色谱
（HPGPC）指纹图谱，通过多维指纹图谱共同组成了完整的蛹虫草多糖的指纹图谱特征；
（2）本发明方法具有操作简单、稳定、灵敏、精密度高、重现性好等优点，能从色谱的整
体特征面貌上把握蛹虫草多糖质量情况，为蛹虫草质量控制和真伪鉴别提供了新的科学方
法；
（3）本发明可为蛹虫草和蛹虫草多糖的质量检测方法和质量标准的提升及完善提供科
学依据与参考，从而促进我国蛹虫草类产品的质量提高和稳定，更好地规范蛹虫草市场，维
护消费者权益，造福于国人的身体健康。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明；
图1是本发明实施例1中10组蛹虫草多糖紫外吸收光谱图；
图2是本发明实施例1中蛹虫草多糖的UV光谱标准指纹图谱；
图3是本发明实施例1中10组蛹虫草多糖红外吸收光谱图；
图4是本发明实施例1中蛹虫草多糖的IR光谱标准指纹图谱；
图5是本发明实施例1中10组蛹虫草多糖HPGPC色谱图；
图6是本发明实施例1中蛹虫草多糖的HPGPC色谱标准指纹图谱；
图7是本发明实施例1中HPGPC法测定分子量的标准曲线图；
图8是本发明实施例2中蛹虫草多糖CM-11的UV吸收光谱图；
图9是本发明实施例2中蛹虫草多糖CM-11的IR吸收光谱图
图10是本发明实施例2中蛹虫草多糖CM-11的HPGPC色谱图；
图11是本发明实施例3中蛹虫草多糖CM-12的UV吸收光谱图；
图12是本发明实施例3中蛹虫草多糖CM-12的IR吸收光谱图；
图13是本发明实施例3中蛹虫草多糖CM-12的HPGPC色谱图；
图中，CM-1、CM-2、CM-3、CM-4、CM-5、CM-6、CM-7、CM-8、CM-9、CM-10、CM-11和CM-12代表
12个不同产地蛹虫草多糖提取物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而非对本
发明的限制。
实施例1
蛹虫草多糖多维指纹图谱的构建方法，包括从蛹虫草中提取蛹虫草多糖，将提取的蛹
虫草多糖，经紫外吸收光谱指纹分析、傅里叶变换红外光谱指纹分析和高效凝胶渗透色谱
法指纹分析，获得蛹虫草多糖的UV光谱标准指纹图谱、IR光谱标准指纹图谱和HPGPC色谱标
准指纹图谱的多维指纹图谱构建方法，包括如下步骤 ：
蛹虫草原料：10组不同产地的蛹虫草原料分别来自广东、吉林、福建、河北等地。
（1）蛹虫草多糖的制备
取干燥的蛹虫草药材50 g，粉碎，按料液比1g∶10 mL加入无水乙醇，80℃条件下提取2
h，过滤后重复提取2次，除去含有的脂溶性化合物。挥干乙醇，药材残渣按料液比1g∶20 mL
加入蒸馏水，使用260 W的超声波提取仪80℃条件下提取15 min，然后在80℃恒温下水浴提
取2 h，过滤后重复提取2次，合并水提液，使用旋转蒸发仪减压浓缩至水提液体积的八分之
一。在搅拌条件下加入无水乙醇使最终乙醇体积含量为80%，在4℃条件下，静置24 h，离心
机5000 rpm条件下离心10 min，收集沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤后真空干燥，得
蛹虫草多糖提取物CM-1、CM-2、CM-3、CM-4、CM-5、CM-6、CM-7、CM-8、CM-9和CM-10。
（2）蛹虫草多糖的紫外吸收光谱（UV）指纹分析及标准指纹图谱的确定
精密称取烘干至恒重的蛹虫草多糖CM-1、CM-2、CM-3、CM-4、CM-5、CM-6、CM-7、CM-8、CM-
9和CM-10样品各10.0 mg，以蒸馏水溶解并定容至10 mL容量瓶中，分别得到1 mg/mL的蛹虫
草多糖溶液，于250～400 nm区间进行扫描，得蛹虫草多糖UV吸收光谱图。
10个不同产地蛹虫草多糖的紫外吸收光谱图，如图1所示。
对10个不同产地蛹虫草多糖的紫外吸收光谱图使用中药色谱指纹图谱相似度评
价软件（2004A）处理，得到蛹虫草多糖的UV光谱标准指纹图谱，如图2所示，在270 nm～280
nm，且在280 nm左右吸收值最大。
（3）蛹虫草多糖的傅里叶变换红外光谱（IR）指纹分析及标准指纹图谱的确定
精密称取烘干至恒重的蛹虫草多糖CM-1、CM-2、CM-3、CM-4、CM-5、CM-6、CM-7、CM-8、CM-
9和CM-10样品各1.0 mg，在红外灯下，经压片法压片，以干燥的KBr为空白样品扣除背景吸
收后，将样品与KBr以质量比1：100混合研磨压片，在4000-500 cm-1的区间范围内进行红外
光谱扫描，得到蛹虫草多糖的红外吸收光谱图。
10个不同产地蛹虫草多糖红外吸收光谱图，如图3所示。
比较10个不同产地的蛹虫草多糖样品红外吸收光谱图，确定其共有特征峰为11
个，11个共有特征峰的波数λ（cm-1）的相对标准偏差RSD均小于2％，即：
1号峰，平均吸收波长λ为3395.2 cm-1，RSD值为0.95%；
2号峰，平均吸收波长λ为2923.8 cm-1，RSD值为0.43%；
3号峰，平均吸收波长λ为1642.1 cm-1，RSD值为0.52%；
4号峰，平均吸收波长λ为1417.3 cm-1，RSD值为0.61%；
5号峰，平均吸收波长λ为1248.6 cm-1，RSD值为0.36%；
6号峰，平均吸收波长λ为1025.4 cm-1，RSD值为0.78%；
7号峰，平均吸收波长λ为895.2 cm-1，RSD值为0.73%；
8号峰，平均吸收波长λ为826.5cm-1，RSD值为0.82%；
9号峰，平均吸收波长λ为765.1 cm-1，RSD值为0.51%；
10号峰，平均吸收波长λ为610.9 cm-1，RSD值为0.34%；
11号峰，平均吸收波长λ为532.6 cm-1，RSD值为0.63%；
运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件处理图谱和数据，得到蛹虫草多糖的IR光谱标
准指纹图谱，如图4所示。再计算标准指纹图谱和10组不同产地蛹虫草多糖相互之间的相似
度，相似度评价结果表明：不同产地蛹虫草多糖的相似度均大于0.9，符合《中药注射剂指纹
图谱研究的技术要求(暂行)》的有关规定。说明10个不同产地蛹虫草多糖的相似度较高。
蛹虫草多糖的IR光谱标准指纹图谱中，在波长3395.2 cm-1处为O-H的伸缩振动吸
收峰，表明有氢键存在；2923.8 cm-1处为C-H的伸缩振动吸收峰；1642.1 cm-1处为C=O伸缩
振动吸收峰；1417.3 cm- 1处为C-O伸缩振动吸收峰，表明有糖醛酸；1248.6 cm-1处为环上C-
C键的骨架振动吸收峰；1025.4 cm-1处为醇羟基的C-O伸缩振动吸收峰；895.2 cm-1处为β-
端基差向异构的C-H变角振动吸收峰，表明有β-型糖苷键；826.5 cm-1处为α-端基差向异构
的C-H变角振动吸收峰，表明有α-型糖苷键；765.1 cm-1处为C-H的摇摆振动吸收峰；532.6
cm-1处为CCO的变形振动吸收峰。
（4）蛹虫草多糖的高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）指纹分析及标准指纹图谱的确定
精密称取烘干至恒重的蛹虫草多糖CM-1、CM-2、CM-3、CM-4、CM-5、CM-6、CM-7、CM-8、CM-
9和CM-10样品各5.0 mg，加入5.0 mL蒸馏水溶解。将溶解后的蛹虫草多糖溶液放入离心机
中，8000 rpm条件下离心10 min，取离心后所得的上清液3.0 mL，用0.45 μm 微孔滤膜滤
过，取多糖溶液上样于Sephacryl S-300 HR column (1.6 × 70 cm)凝胶渗透色谱柱，以
蒸馏水作为洗脱液，恒流泵调节凝胶渗透色谱柱的流速为0.3 mL/min，柱温：30℃，检测器：
紫外检测器系统，设置自动部分收集器，使其每管收集3.0 mL，之后将收集到的每管样品溶
液经苯酚-硫酸法显色，测定其吸光度，从而检测出蛹虫草多糖样品的出峰液分布，得到蛹
虫草多糖的HPGPC色谱图。
10个不同产地蛹虫草多糖的HPGPC色谱图，如图5所示。
比较10个不同产地的蛹虫草多糖样品HPGPC色谱图，确定其共有特征峰为4个， 4
个共有特征峰的相对保留体积的相对标准偏差RSD均小于2％，即：
1号峰，平均相对保留体积V为93.5 mL，RSD值为0.58%；
2号峰，平均相对保留体积V为135.8 mL，RSD值为1.25%；
3号峰，平均相对保留体积V为235.2 mL，RSD值为0.96%；
4号峰，平均相对保留体积V为305.4 mL，RSD值为0.83%；
运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件处理图谱和数据，得到蛹虫草多糖HPGPC色谱
标准指纹图谱，如图6所示。再计算标准指纹图谱和10组不同产地蛹虫草多糖相互之间的相
似度，相似度评价结果表明：不同产地蛹虫草多糖的相似度均大于0.9，符合《中药注射剂指
纹图谱研究的技术要求(暂行)》的有关规定。说明10个不同产地蛹虫草多糖的相似度较高。
（5）蛹虫草多糖各组分的分子量测定
标准曲线的绘制：分别称取5.0 mg标准葡聚糖T4 (分子量4000 Da)、T7 (分子量7000
Da)、T10 (分子量10000 Da)、T40 (分子量40000 Da)、T70 (分子量70000 Da)、T200 (分子
量200000 Da)、蓝葡聚糖 (分子量2000000 Da)以及无水葡萄糖 (分子量180 Da),分别溶
解于5.0 mL的蒸馏水中，分别上凝胶渗透色谱柱Sephacryl S-300 HR column (1.6×70
cm)，以蒸馏水为洗脱液，调节凝胶渗透色谱柱流速为0.3 mL/min，设置自动部分收集器收
集每管3.0 mL，用苯酚-硫酸法测定样品出峰液分布。HPGPC分析条件为：仪器：上海沪西中
压制备色谱系统；色谱柱：Sephacryl S-300 HR column (1.6×70 cm)；流动相：蒸馏水；柱
温：30℃；检测器：紫外检测器系统（苯酚-硫酸法显色后检测）；流速：0.3 mL/min；进样体
积：3.0 mL。
计算各标准葡聚糖(T4-T200)出峰的洗脱体积Ve，利用已知分子量为200万Da的蓝
葡聚糖确定凝胶渗透色谱柱的空体积Vo，利用无水葡萄糖确定凝胶渗透色谱柱的总体积
Vt。以有效分配系数（Kav）为纵坐标，以分子量的对数lgMw为横坐标作标准曲线。分配系数
Kav由以下公式求得：Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)。其中，Ve是待测样品的洗脱体积，Vo是凝胶渗
透色谱柱的空体积，Vt是凝胶渗透色谱柱的总体积。
各标准葡聚糖(T4-T200)、蓝葡聚糖以及无水葡萄糖经凝胶渗透色柱Sephacryl
S-300 HR column (1.6×70 cm)检测后，以有效分配系数（Kav）为纵坐标，以分子量的对数
lgMw为横坐标作标准曲线，如图7所示。计算得标准曲线方程为y=-0.36x+2.1722，其R2=
0.998，表明构建的标准曲线模型精确，回归效果和回归拟合效果显著。
将蛹虫草多糖的HPGPC色谱标准指纹图谱中各组分的洗脱体积代入求得的标准曲
线方程，可求得多糖样品中的多糖分子量分布及其大小。如表1所示，即蛹虫草多糖的HPGPC
色谱标准指纹图谱中1-4号峰多糖的相对分子量。
表1. 蛹虫草多糖HPGPC标准指纹图谱中各组分的相对分子量
实施例2、广东某产地蛹虫草多糖样品的多维指纹图谱分析
1. 广东某产地蛹虫草多糖的制备
取干燥的广东某产地蛹虫草50 g，粉碎，按料液比1g∶10 mL加入无水乙醇，80℃条件下
提取2 h，过滤后重复提取2次，除去含有的脂溶性化合物。挥干乙醇，药材残渣按料液比1g∶
20 mL加入蒸馏水，使用260 W的超声波提取仪80℃条件下提取15 min，然后在80℃恒温下
水浴提取2 h，过滤后重复提取2次，合并水提液，使用旋转蒸发仪减压浓缩至水提液体积的
八分之一。在搅拌条件下加入无水乙醇使最终乙醇体积含量为80%，在4℃条件下，静置24
h，离心机5000 rpm条件下离心10 min，收集沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤后真空干
燥，得蛹虫草多糖提取物CM-11。
2. 蛹虫草多糖CM-11的UV指纹分析及与标准指纹图谱的比较
精密称取烘干至恒重的蛹虫草多糖CM-11样品10.0 mg，以蒸馏水溶解并定容至10 mL
容量瓶中，得到1 mg/mL的多糖溶液，于250～400 nm区间进行扫描得蛹虫草多糖UV吸收光
谱图。蛹虫草多糖CM-11紫外扫描在270-280 nm处有吸收，且在280 nm处吸收值最大，该样
品的UV吸收光谱图与蛹虫草多糖的UV标准指纹图谱相似，具有UV标准指纹图谱特征。
蛹虫草多糖CM-11的UV吸收光谱图如图8所示。
3. 蛹虫草多糖CM-11的IR指纹分析及与标准指纹图谱的比较
精密称取烘干至恒重的蛹虫草多糖CM-11样品1.0 mg。在红外灯下，经压片法压片，以
干燥的KBr为空白样品扣除背景吸收后，将样品与KBr以质量比1：100混合研磨压片，在
4000-500 cm-1的区间范围内分别进行红外光谱扫描，得到蛹虫草多糖CM-11的IR吸收光谱
图。对照蛹虫草多糖的IR光谱标准指纹图谱，该指纹图谱中含有11个共有特征峰：1-11号特
征峰的波数分别为3396.1 cm-1，2924.6 cm-1，1640.8 cm-1，1418.0 cm- 1，1247.5 cm-1，
1024.8 cm-1，896.9 cm-1，825.7 cm-1，766.6 cm-1，609.5 cm-1，531.1 cm-1。在蛹虫草多糖IR
光谱标准指纹图谱特征吸收峰范围内，该样品CM-11的IR吸收光谱图与蛹虫草多糖IR光谱
标准指纹图谱相似，具有蛹虫草多糖IR光谱标准指纹图谱特征。
蛹虫草多糖CM-11的IR吸收光谱图如图9所示。
4. 蛹虫草多糖CM-11的HPGPC指纹分析及与标准指纹图谱的比较
精密称取烘干至恒重的蛹虫草多糖CM-11样品5.0 mg，加入5.0 mL蒸馏水溶解。将溶解
后的蛹虫草多糖溶液放入离心机中，8000 rpm条件下离心10 min，取离心后所得的上清液
3.0 mL，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取多糖溶液上样于Sephacryl S-300 HR column (1.6
× 70 cm)凝胶渗透色谱柱，以蒸馏水作为洗脱液，恒流泵调节凝胶渗透色谱柱的流速为
0.3 mL/min，设置自动部分收集器，使其每管收集3.0 mL，之后将收集到的每管样品溶液经
苯酚-硫酸法显色，测定其吸光度，从而检测出蛹虫草多糖样品的出峰液分布，得到蛹虫草
多糖CM-11的HPGPC色谱图，如图10所示。相对保留体积带入分子量计算公式中得到蛹虫草
多糖CM-11中各组分的相对分子量，分别为：1号峰为1.14×106 Da，2号峰为4.35×105 Da，3
号峰为3.33×104 Da，4号峰为6.50×103 Da。
对照蛹虫草多糖的HPGPC色谱的标准指纹图谱，该图谱中含有4个色谱峰，相对保
留体积和相对分子量分别为：1号峰的相对保留体积为93.9 mL，相对分子量为1.14×106
Da；2号峰的相对保留体积为135.1 mL，相对分子量为4.35×105 Da；3号峰的相对保留体积
为235.8 mL，相对分子量为3.33×104 Da；4号峰的相对保留体积为305.8 mL，相对分子量
为6.50×103 Da。蛹虫草多糖CM-11的HPGPC色谱图与蛹虫草多糖的HPGPC色谱标准指纹图
谱相似，具有蛹虫草多糖的HPGPC色谱标准指纹图谱特征。
实施例3、河南某产地蛹虫草多糖样品的多维指纹图谱分析
1. 河南某产地蛹虫草多糖的制备
取干燥的河南某产地蛹虫草50 g，粉碎，按料液比1g∶10 mL加入无水乙醇，80℃条件下
提取2 h，过滤后重复提取2次，除去含有的脂溶性化合物。挥干乙醇，药材残渣按料液比1g∶
20 mL加入蒸馏水，使用260 W的超声波提取仪80℃条件下提取15 min，然后在80℃恒温下
水浴提取2 h，过滤后重复提取2次，合并水提液，使用旋转蒸发仪减压浓缩至水提液体积的
八分之一。在搅拌条件下加入无水乙醇使最终乙醇体积含量为80%，在4℃条件下，静置24
h，离心机5000 rpm条件下离心10 min，收集沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤后真空干
燥，得蛹虫草多糖提取物CM-12。
2. 蛹虫草多糖CM-12的UV指纹分析及与标准指纹图谱的比较
精密称取烘干至恒重的蛹虫草多糖CM-12样品10.0 mg，以蒸馏水溶解并定容至10 mL
容量瓶中，得到1 mg/mL的多糖溶液，于250～400 nm区间进行扫描得蛹虫草多糖UV吸收光
谱图。蛹虫草多糖CM-12紫外扫描在270-280 nm处无明显吸收，该样品的UV吸收光谱图与蛹
虫草多糖的UV光谱标准指纹图谱不相同，不具有蛹虫草多糖的UV光谱标准指纹图谱特征。
蛹虫草多糖CM-12的UV吸收光谱图如图11所示。
3. 蛹虫草多糖CM-12的IR指纹分析及与标准指纹图谱的比较
精密称取烘干至恒重的蛹虫草多糖CM-12样品1.0 mg。在红外灯下，经压片法压片，以
干燥的KBr为空白样品扣除背景吸收后，将样品与KBr以质量比1：100混合研磨压片，在
4000-500 cm-1的区间范围内分别进行红外光谱扫描，得到蛹虫草多糖CM-12的IR吸收光谱
图。对照蛹虫草多糖的IR光谱标准指纹图谱，该IR吸收光谱图中只含有10个特征峰：1-10号
特征峰的波数分别为3398.5 cm-1，2925.4 cm-1，1640.8 cm-1，1420.6 cm- 1，1245.1 cm-1，
1026.1 cm-1，830.5 cm-1，764.0 cm-1，609.5 cm-1，552.3 cm-1。在蛹虫草多糖的IR光谱标准
指纹图谱特征吸收峰范围内，与蛹虫草多糖的IR光谱标准指纹图谱(实施例1 )有明显差
异，具有地域特征，为质量未达标的蛹虫草多糖样品。
蛹虫草多糖CM-12的IR吸收光谱图如图12所示。
4. 蛹虫草多糖CM-12的HPGPC指纹分析及与标准指纹图谱的比较
精密称取烘干至恒重的蛹虫草多糖CM-12样品5.0 mg，加入5.0 mL蒸馏水溶解。将溶解
后的蛹虫草多糖溶液放入离心机中，8000 rpm条件下离心10 min，取离心后所得的上清液
3.0 mL，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取多糖溶液上样于Sephacryl S-300 HR column (1.6
× 70 cm)凝胶渗透色谱柱，以蒸馏水作为洗脱液，恒流泵调节凝胶渗透色谱柱的流速为
0.3 mL/min，设置自动部分收集器，使其每管收集3.0 mL，之后将收集到的每管样品溶液经
苯酚-硫酸法显色，测定其吸光度，从而检测出蛹虫草多糖样品的出峰液分布，得到蛹虫草
多糖CM-12的HPGPC色谱图，如图13所示。相对保留体积带入分子量计算公式中得到蛹虫草
多糖CM-12中各组分的相对分子量，分别为：1号峰为8.26×105 Da，2号峰为2.81×105 Da，3
号峰为3.09×104 Da。
对照蛹虫草多糖的HPGPC色谱标准指纹图谱，该图谱中只含有3个色谱峰，相对保
留体积和相对分子量分别为：1号峰的相对保留体积为112.7 mL，相对分子量为8.26×105
Da；2号峰的相对保留体积为153.6 mL，相对分子量为2.81×105 Da；3号峰的相对保留体积
为239.1 mL，相对分子量为3.09×104 Da。蛹虫草多糖CM-12的HPGPC色谱图与蛹虫草多糖
的HPGPC色谱标准指纹图谱(实施例1)有明显差异，具有地域特征，为质量未达标的蛹虫草
多糖样品。
综合蛹虫草多糖的多维指纹图谱结果分析，可知广东产的蛹虫草多糖CM-11为质
量达标的样品，河南某地生产的蛹虫草CM-12为未达标的样品。