一种检测力竭运动小鼠心肌连接蛋白43含量的方法技术领域
本发明属于化学发光传感器领域，具体涉及一种检测力竭运动小鼠心肌连接蛋白
43含量的方法。
背景技术
心肌连接蛋白43(connexin 43，Cx43)是组成缝隙连接的连接蛋白家族成员中的
一种，是心肌细胞间隙连接的主要蛋白成分[李梁,常芸.力竭运动后不同时相大鼠心肌连
接蛋白43的变化[J].中国运动医学杂志,2007(4):397-401.]。心肌连接蛋白43是心肌细胞
间电耦联及化学信息交换的重要结构基础[潘国聘,孙丽华,张勇,等.缝隙连接蛋白43在急
性局灶性脑缺血大鼠心室肌中的表达[J].哈尔滨医科大学学报,2008,42(4):330-333.Shi
H,Shi D,Wu Y,et al.Qigesan inhibits migration and invasion of esophageal
cancer cells via inducing connexin expression and enhancing gap junction
function[J].Cancer Letters,2016,380(1):184–190.]。心肌连接蛋白43的正常表达与分
布是间隙连接通道电偶联功能正常、心脏正常电活动和协调舒缩的重要保证。现有的研究
心肌连接蛋白43表达的方法有荧光免疫法[林吉进,李玉光,霍霞,等.双重标记连接蛋白43
激光共聚焦显微镜检测方法的研究[J].汕头大学医学院学报,2001,14(3):177-179.Coyle
D,Doyle B,Murphy J M,et al.Expression of Connexin 26and Connexin 43is Reduced
in Hirschsprung’s Disease[J].Journal of Surgical Research,2016]，流式细胞仪测
定法[杨军,伍卫,梁蔚文,等.血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后缝隙连接蛋白Cx43表达的
变化[J].中山大学学报(医学科学版),2007,28(3):292-296.]等，然而未见利用高灵敏度
的化学发光法和高选择性抗原抗体识别反应相结合的检测方法，本研究用钴纳米粒子标记
抗体，以鲁米诺-Co-双氧水化学发光体系，建立了一种高灵敏检测心肌连接蛋白43的新方
法，并用于力竭运动后小鼠心肌连接蛋白43含量的测定。
发明内容
本发明旨在建立一种方法操作简单，成本低廉，灵敏度高的测定心肌连接蛋白43
的方法。
实现发明目的技术方案是：
一种检测力竭运动后小鼠心肌连接蛋白43含量的方法。其原理是，首先利用抗体
修饰钴纳米粒子，并利用戊二醛法将抗体修饰在氨基化磁珠表面。检测时，将含有心肌连接
蛋白43的样品加入到抗体修饰的磁珠溶液中，然后加入抗体修饰钴纳米粒子，形成三明治
夹心结构，随后进行分离，然后根据钴纳米粒子催化鲁米诺产生化学发光，根据化学发光强
弱实现对心肌连接蛋白43含量的测定；并对力竭运动后小鼠心肌中心肌连接蛋白43含量进
行测定。
测定步骤为：
(1)钴纳米粒子的制备
首先，将制备钴纳米粒子实验所用的玻璃仪器用王水泡洗2h，烘干备用。然后在
10mL的浓度为1％的氯化钴CoCl2·6(H2O)中加入1.0mL浓度为10％的氢氧化钠，50℃条件
下，搅拌反应30分钟，室温下冷却，得钴纳米粒子溶液，4℃条件下保存备用。
(2)抗体修饰钴纳米粒子的制备
首先，将上述所得的500μL钴纳米粒子溶液与2mL pH 7.4的磷酸缓冲溶液混合，并
加入1mM的巯基乙胺100μL，37℃条件下反应过夜，然后加入200μL含5％戊二醛的pH 7.0的
0.1M磷酸缓冲溶液，在37℃下反应2小时后，用磷酸缓冲溶液离心清洗3次，再分散在磷酸缓
冲溶液中，随后加入0.5mL心肌连接蛋白43抗体溶液，37℃条件下，震荡反应24h，得抗体/钴
纳米粒子复合物，离心清洗后，再次分散在磷酸缓冲溶液中，4℃下保存。
(3)抗体修饰磁珠的制备
将1.0mL的氨基化磁珠溶液用2.0mL的pH 7.0的0.1M磷酸缓冲溶液洗涤3次，然后
将其加入到200μL含5％戊二醛的pH 7.0 0.1M磷酸缓冲溶液中，在37℃下反应2小时后，用
磷酸缓冲溶液离心清洗3次，再分散在磷酸缓冲溶液中，随后加入抗体2μg，4℃振动孵育
12h，得抗体修饰磁珠；将所得复合物离心清洗后，再次分散在磷酸缓冲溶液中，4℃下保存。
(4)心肌连接蛋白43的检测
取20μL含心肌连接蛋白43的样品溶液加入到将50μL抗体修饰磁珠溶液中，37℃条
件下，反应30min，然后再加入50μL抗体修饰钴纳米粒子，37℃条件下，反应2h，磁性分离清
洗后，将磁性产物分散在磷酸缓冲溶液中，得磁性产物分散液，利用化学发光仪器进行化学
发光测定；
(5)化学发光测定
取200μL鲁米诺溶液置于微反应器中，加入20μL过氧化氢，然后注入上述(4)所得
的磁性产物分散液20μL，记录化学发光信号，根据化学发光信号的强度实现对心肌连接蛋
白43含量的测定。
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氯化钴(CoCl2·6(H2O))购自国药集团化学试剂有限公司；
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实验过程中使用的水为二次蒸馏水。
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附图说明
图1检测心肌连接蛋白43含量的原理示意图。
图2心肌连接蛋白43浓度与化学发光信号关系图。
发明的优点与效果
心肌连接蛋白43的浓度在0.07-20ng/mL之间时，化学发光信号强度随着心肌连接
蛋白43浓度的增大而增大。得到心肌连接蛋白43的线性回归方程为ICL＝442.9C-27.84(ICL
为化学发光信号强度；C为心肌连接蛋白43的浓度，ng/mL；n＝7，R＝0.998)。该方法检测限
为0.03ng/mL(3σ)。对浓度1.0 ng/mL的心肌连接蛋白43进行7次平行重复测定的RSD为
4.2％，表明本法有较好的重现性。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但不构成对发明的进一步限制。
实施例1实验条件优化
化学发光强度随抗体修饰钴纳米粒子溶液用量从10μL到50μL的增大而增加，当用
量大于50μL后，化学发光强度随之变化变缓，故选取50μL作为最佳抗体修饰钴纳米粒子溶
液用量。以过氧化氢浓度为变量检测化学发光强度的变化，当浓度从0.5mM逐渐增大时，化
学发光强度随过氧化氢的浓度增大而增强，并在浓度为1.6mM处到达峰值，之后信号强度基
本保持不变，所以1.6mM的过氧化氢浓度为本次实验的最佳浓度。化学发光信号随着鲁米诺
浓度从0.1mM到1.8增大而增强，当浓度为1.8mM时，化学发光强度最大，所以选择鲁米诺浓
度为1.8mM为本次实验的最佳浓度。化学发光强度在鲁米诺溶液的pH由8.5增加至10.5的过
程中递增，并在pH为10.5时到达峰值，此后开始递减，因此，鲁米诺溶液pH选择为10.5。
实施例2力竭运动后小鼠心肌中心肌连接蛋白43含量检测
对小鼠进行力竭运动并取材，检测力竭运动后小鼠心肌中心肌连接蛋白43的含
量。结果如表1所示，力竭运动后小鼠心肌中心肌连接蛋白43的含量变高，为5.70ng/mg，对
照组小鼠心肌中心肌连接蛋白43的含量为3.63ng/mg，低于力竭运动后小鼠心肌中心肌连
接蛋白43的含量。并利用加标回收法对方法进行了评价，回收率为99.2～105.4％，表明方
法具有可靠性，可以对实际样品进行测定。
表1.力竭运动后小鼠心肌中骨骼肌心肌连接蛋白43的含量
a n＝7；1、2、3为对照组；4、5、5为力竭运动组。