一种外周血淋巴细胞连接蛋白43与IL-2和IL-6表达的相关性分析方法技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种外周血淋巴细胞连接蛋白43与IL-2和IL-6表
达的相关性分析方法，具体地说，涉及一种自发性高血压大鼠外周血淋巴细胞连接蛋白43
与IL-2和IL-6表达的相关性分析方法。
背景技术
高血压作为多因素引起的慢性疾病，其病因和发病机制十分复杂。ARIMA等研究发
现，高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病均与机体免疫系统功能关系密切。免疫系统，尤其
外周血T细胞、B细胞及自然杀伤细胞中均表达连接蛋白(connexin,Cx)。Cx是缝隙连接的基
本组成单位，在相邻细胞间传递信息物质，构成缝隙连接细胞间通讯。MATSUE等研究发现，
在脂多糖和肿瘤坏死因子ɑ刺激下，单核细胞中Cx43表达可显著上调。因此，缝隙连接与机
体免疫炎性反应相关，参与免疫系统细胞间通讯。CD4+T细胞和CD8+T细胞作为外周血T细胞
的主要亚群细胞，参与调节机体免疫炎性反应，在抗感染、抗肿瘤方面发挥重要的免疫调节
作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种外周血淋巴细胞连接蛋
白43与IL-2和IL-6表达的相关性分析方法，初步探讨Cx43与高血压大鼠炎性反应间的关
系，为阐明Cx43对高血压患者炎性反应的作用机制提供理论依据。
其具体技术方案为：
一种外周血淋巴细胞连接蛋白43与IL-2和IL-6表达的相关性分析方法，包括以下
步骤：
步骤1、大鼠血压测定 应用BP-6无创血压监测仪测量大鼠尾动脉血压，避免大鼠
躁动，于大鼠清醒安静状态下连续测量3次，每次间隔至少1min，取测量3次平均值即为大鼠
收缩压。
步骤2、样本采集 3％戊巴比妥钠麻醉大鼠，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集腹主
动脉外周血5ml，1 500r/min离心5min，取血浆于-20℃保存，离心后的下层血细胞用于分离
外周血淋巴细胞。
步骤3、炎性因子IL-2和IL-6表达 取冻存于-20℃的血浆样品，ELISA法检测IL-2
和IL-6表达水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。
步骤4、淋巴细胞分离 将血细胞与0.9％氯化钠溶液1:1等体积稀释，吹打混匀。取
无菌15ml离心管，加入淋巴细胞分离液，将细胞悬液缓慢按照1:1比例加到淋巴细胞分离液
上层，保证血液置于淋巴细胞分离液上层。根据密度梯度离心法分离淋巴细胞，低速离心机
水平离心30min(1 500r/min，缓升缓降)。将分离的白色浑浊淋巴细胞层吸出至无菌15ml离
心管内，加入3倍0.9％氯化钠溶液洗涤，以1 800r/min离心6min洗涤2次，弃上清，沉淀即淋
巴细胞。加入1ml培养基重悬，吸取50μl到1.5ml离心管，加450μl磷酸盐缓冲液(PBS)稀释10
倍，显微镜下计数并用台盼蓝染色观察细胞活性。细胞活性为95％以上，调整细胞浓度为1
×106个/ml，将细胞接种在24孔板中。
步骤5、流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞Cx43表达 收集5×105个细胞于EP管内，
100μl PBS重悬细胞，分别加入相应流式抗体(CD4-APC，APC同型对照；CD8-PE，PE同型对照)1
μl，并设立阴性对照。125μl固定剂固定淋巴细胞，4℃孵育20min，Cx43一抗1μl抗体与99μl
1×破膜剂破膜，37℃孵育20min；FITC二抗1μl，37℃孵育20min；1ml 1×破膜剂洗涤，弃上
清液，PBS重悬细胞，流式细胞仪检测，流式CELLQuest软件进行分析。
步骤6、实时荧光定量PCR检测IL-2mRNA和IL-6mRNA表达 计数分离出的淋巴细胞，
调整培养基至细胞浓度为1×106个/ml。将淋巴细胞分为空白对照组、刀豆蛋白
(Concanavalin A，ConA)组(培养48h后加入5μg/ml ConA)和Gap27+ConA组(培养前加入5
00μmol/L Gap275，培养48h后加入5μg/ml ConA)。加入10％自体血清(血清处理步骤：56℃
灭活30min，以4 000r/min离心30min，4℃保存)，于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
TRIzol法提取上述培养的淋巴细胞mRNA，核酸蛋白含量检测仪测定A260/A280值，
1％甲醛变性凝胶电泳检测提取质量。选用GADPH作为内参基因，根据大鼠IL-2、IL-6基因
cDNA序列，设定引物序列(见表1)。将提取的mRNA样品、随机引物、Rtmix、dNTP混合液、焦碳
酸二乙酯(DEPC)水按照反转录体系配制反应体系，按照37℃反转录60min，90℃灭活反转录
酶5min的反应程序进行反转录合成cDNA。将2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix，
10×miScript Nucleics Mix通用引物，模板cDNA和RNase-Free water置于冰上，并轻轻混
匀，配制反应体系，按照95℃预变性2min，1个循环；95℃变性5s，60℃退火加延伸10s，40个
循环设置Bio-Rad荧光定量PCR仪，记录IL-2mRNA与IL-6mRNA相对表达量。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本研究发现，SHR大鼠伴随炎性反应，促炎因子释放增加，同时构成T细胞间缝隙连
接通道的Cx43表达显著上调，应用缝隙连接阻断剂阻断淋巴细胞间信息通讯后促炎因子的
释放显著下降，提示缝隙连接参与高血压炎性反应。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物 于2015年4月—2016年4月，选取SHR和正常血压的WKY大鼠各20
只，16～18周龄，雄性，体质量150～220g，均从北京维通利华实验动物有限责任公司购买
(许可证编号SCXK京2007-0001)，已达到清洁级标准，动物质量为一级标准。饲养环境要求：
良好通风、空气过滤系统，环境安静，室温保持20℃、湿度控制在45％左右，每日更换垫料和
饮用水，自由摄取水和食物。
1.1.2仪器及试剂 流式细胞仪(E6)购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，水
浴锅(H216)购自上海博讯实业有限公司，低速大容量离心机(LC-4016)购自安徽中科中佳
科学仪器有限公司，相差倒置显微镜(XD30)购自宁波舜宇有限责任公司，生物安全柜(BHC-
1300ⅡA2)购自阿尔泰实验室设备(北京)有限公司，CO2恒温培养箱(HF151)购自上海力申
科学仪器有限公司，凝胶成像仪(BioDoc Imaging)购自美国UVP公司，梯度PCR仪(TC-96/G/
H(b)C)购自杭州博日科技有限公司，酶标仪、微量分光光度计(K5500)购自北京凯奥科技发
展有限公司，荧光定量PCR仪(TIB-8000)购自泰普生物科技(中国)有限公司。
别藻青蛋白(allophycocyanin，APC)标记小鼠抗大鼠CD4抗体(B159112)、藻红蛋
白(phycoerythrin，PE)标记小鼠抗大鼠CD8a抗体(B166485)、PE标记IgG1、кIsotype Ctrl同
型对照(B179044)均购自BioLegend公司，小鼠来源抗大鼠Anti-Connexin 43(ab-79010)购
自Abcam公司，山羊抗小鼠IgG/FITC标记二抗(ZF-0312)购自北京中杉金桥生物科技有限公
司，大鼠IL-2(230240922)、IL-6(230641023)ELISA试剂盒均购自杭州联科生物有限责任公
司，淋巴细胞分离液(LTS10770125)购自天津灏洋科技有限责任公司，RPMI 1640培养基
(1279443)购自美国gibco公司，Concanavalin A(C-2010)购自美国Sigma公司，缝隙连接阻
断剂Gap27(A1045)购自Apexbio公司，实时定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-
PCR)试剂购自北京庄盟生物有限公司，TRIzol购自life techologies公司，引物序列由生
工生物工程股份有限公司设计合成。
1.2方法
1.2.1大鼠血压测定 应用BP-6无创血压监测仪测量大鼠尾动脉血压，避免大鼠躁
动，于大鼠清醒安静状态下连续测量3次，每次间隔至少1min，取测量3次平均值即为大鼠收
缩压。
1.2.2样本采集 3％戊巴比妥钠麻醉大鼠，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集腹主
动脉外周血5ml，1 500r/min离心5min，取血浆于-20℃保存，离心后的下层血细胞用于分离
外周血淋巴细胞。
1.2.3炎性因子IL-2和IL-6表达 取冻存于-20℃的血浆样品，ELISA法检测IL-2和
IL-6表达水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。
1.2.4淋巴细胞分离 将血细胞与0.9％氯化钠溶液1:1等体积稀释，吹打混匀。取
无菌15ml离心管，加入淋巴细胞分离液，将细胞悬液缓慢按照1:1比例加到淋巴细胞分离液
上层，保证血液置于淋巴细胞分离液上层。根据密度梯度离心法分离淋巴细胞，低速离心机
水平离心30min(1 500r/min，缓升缓降)。将分离的白色浑浊淋巴细胞层吸出至无菌15ml离
心管内，加入3倍0.9％氯化钠溶液洗涤，以1 800r/min离心6min。洗涤2次，弃上清，沉淀即
淋巴细胞。加入1ml培养基重悬，吸取50μl到1.5ml离心管，加450μl磷酸盐缓冲液(PBS)稀释
10倍，显微镜下计数并用台盼蓝染色观察细胞活性。细胞活性为95％以上，调整细胞浓度为
1×106个/ml，将细胞接种在24孔板中。
1.2.5流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞Cx43表达收集5×105个细胞于EP管内，100μ
l PBS重悬细胞，分别加入相应流式抗体(CD4-APC，APC同型对照；CD8-PE，PE同型对照)1μl，
并设立阴性对照。125μl固定剂固定淋巴细胞，4℃孵育20min，Cx43一抗1μl抗体与99μl 1×
破膜剂破膜，37℃孵育20min；FITC二抗1μl，37℃孵育20min；1ml 1×破膜剂洗涤，弃上清
液，PBS重悬细胞，流式细胞仪检测，流式CELLQuest软件进行分析。
1.2.6实时荧光定量PCR检测IL-2mRNA和IL-6mRNA表达计数分离出的淋巴细胞，调
整培养基至细胞浓度为1×106个/ml。将淋巴细胞分为空白对照组、刀豆蛋白
(Concanavalin A，ConA)组(培养48h后加入5μg/ml ConA)和Gap27+ConA组(培养前加入5
00μmol/L Gap275，培养48h后加入5μg/ml ConA)。加入10％自体血清(血清处理步骤：56℃
灭活30min，以4 000r/min离心30min，4℃保存)，于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
TRIzol法提取上述培养的淋巴细胞mRNA，核酸蛋白含量检测仪测定A260/A280值，
1％甲醛变性凝胶电泳检测提取质量。选用GADPH作为内参基因，根据大鼠IL-2、IL-6基因
cDNA序列，设定引物序列(见表1)。将提取的mRNA样品、随机引物、Rtmix、dNTP混合液、焦碳
酸二乙酯(DEPC)水按照反转录体系配制反应体系，按照37℃反转录60min，90℃灭活反转录
酶5min的反应程序进行反转录合成cDNA。将2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix，
10×miScript Nucleics Mix通用引物，模板cDNA和RNase-Free water置于冰上，并轻轻混
匀，配制反应体系，按照95℃预变性2min，1个循环；95℃变性5s，60℃退火加延伸10s，40个
循环设置Bio-Rad荧光定量PCR仪，记录IL-2mRNA与IL-6mRNA相对表达量。
表1实时荧光定量PCR引物序列
1.3统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，两
组间比较方差齐性者采用两样本t检验，方差非齐性者采用近似t检验；多组间比较采用方
差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1SHR和WKY大鼠收缩压比较 SHR大鼠收缩压为(211±15)mm Hg(1mm Hg＝
0.133kPa)，高于WKY大鼠的收缩压(122±5)mm Hg，差异有统计学意义(t＝25.22,P<0.01)。
2.2SHR和WKY大鼠炎性因子表达水平比较 SHR大鼠IL-2表达水平为(152.40±
29.62)pg/ml，高于WKY大鼠的(73.41±20.16)pg/ml，差异有统计学意义(t＝7.24，P<
0.05)；SHR大鼠IL-6表达水平为(29.74±1.90)pg/ml，高于WKY大鼠的(22.58±1.06)pg/
ml，差异有统计学意义(t＝14.72，P<0.05)。
2.3SHR和WKY大鼠CD4+和CD8+T细胞Cx43表达 SHR大鼠CD4+T细胞Cx43阳性表达率为
(3.48±0.58)％，高于WKY大鼠的Cx43阳性表达率(1.36±0.18)％，差异有统计学意义(t＝
15.61，P<0.05)。SHR大鼠外周血CD8+T淋巴细胞Cx43阳性表达率为(39.02±4.77)％，高于
WKY大鼠的Cx43阳性表达率(27.48±1.90)％，差异有统计学意义(t＝10.05，P<0.05)。
2.4各组细胞IL-2mRNA、IL-6mRNA相对表达水平比较 5μg/ml ConA和500μmol/L
Gap27刺激淋巴细胞，qRT-PCR检测发现ConA活化组IL-2、IL-6表达均显著高于Gap27阻断后
再活化组(P<0.01，n＝3)，差异具有统计学意义(见表2)。
表2 SHR大鼠和WKY大鼠各组细胞IL-2mRNA、IL-6mRNA相对表达水平比较(x±s,n
＝3)
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟
悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简
单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 石河子大学
<120> 一种外周血淋巴细胞连接蛋白43与IL-2和IL-6表达的相关性分析方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctctctgctc ctccctgttc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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gccaaatccg ttcacaccg 19
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<211> 16
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<213> 人工序列
<400> 3
acgcttgtcc tcgcta 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcacctgtaa gtccagcaac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttgggactga tgttgttgac 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgtgggtggt atcctctgt 19