一种水产品中恩诺沙星残留的免疫层析毛细管快速检测方法技术领域
本发明涉及一种水产品中恩诺沙星的检测方法，特别涉及一种水产品中恩诺沙星
残留的免疫层析毛细管快速检测方法。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的不断升高，人们对海鲜食品的消费逐渐攀升，水产品
养殖及生产加工市场逐渐扩大，因此在水产养殖中会添加一些有益于水产生物存活的抗生
素等药物。但食物链富集现象而影响了人体健康，农兽药残留、食物过敏等食品安全事件不
断发生，因此，受到人们的广泛重视。
恩诺沙星(enrofloxacin)是人工合成的第三代呋喹诺酮类药物，由于它具有抑菌
范围广、吸收快、药物在体内存留时间长、药效好的优点，被广泛应用于水产养殖和兽医临
诊中。目前有研究表明恩诺沙星在鲤鱼、虾、中华绒螯蟹等水产中均有残留，且证明恩诺沙
星具有低毒特性；其他研究也证明了其潜在的危害，如肠胃道不良反应、致幼年动物关节病
变等。
目前，针对恩诺沙星的检测包括高效液相色谱、液相色谱与质谱联用、毛细管电
泳、酶联免疫吸附法及胶体金试纸条等，但是均存在一定的不足，如灵敏度、重复性等问题。
寻找一种灵敏、可靠、快速的恩诺沙星检测方法成为大家关注的焦点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水产品中恩诺沙星残留的免疫层析毛细管快速检测
方法，操作简单，灵敏度好，重复性高，检测速度快，试剂用量少，稳定性好，对检测人员无要
求，不需要大型仪器，适合用于现场快速检测。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种水产品中恩诺沙星残留的免疫层析毛细管快速检测方法，包括如下步骤：
一、待测样品处理：取1.0g样品与2mL 2％磺基水杨酸溶液匀浆1～2min后，离心，
取上清液用2M NaOH调pH为8.0～8.5，并过0.45μm滤膜制成待测样品溶液；本步骤主要目的
是从水产品中提取恩诺沙星，常规的恩诺沙星的提取一般要经过组织匀浆，有机萃取，抽提
浓缩等一系列步骤才能得到较纯的恩诺沙星提取液。这样的提取方法复杂、耗时，不适合现
场的快速检测，因此本发明为满足快速高效的要求，采用了恩诺沙星的酸提取方法。
二、样品检测：检测时将待测样品溶液与金标一抗按1：3的体积比均匀混合得混合
液，取3～15μL混合液用移液枪注入免疫层析毛细管的检测区端，静置8～15min，然后用移
液枪推动混合液至免疫层析毛细管另一端的质控区，静置8～15min，将多余的混合液排出
免疫层析毛细管，将免疫层析毛细管在PBST缓冲液中抽洗3次，最后以裸眼定性或以扫描仪
半定量读取检测结果。
本发明基于现有检测方法中操作简单、灵敏度高的酶联免疫吸附法与胶体金试纸
条法的原理，采用玻璃毛细管为基底的免疫层析毛细管新技术检测方法，建立了一种针对
水产品中恩诺沙星残留的免疫层析毛细管检测方法。具有表面光滑、视觉易分析、检测快
速、操作简单及试剂用量少的优点，为药物残留的检测技术提供了新的思路方法。
作为优选，所述免疫层析毛细管的组装方法包括如下步骤：
(1)毛细管的处理：将玻璃毛细管浸没于热的piranha溶液中，超声清洗15～
20min，超纯水清洗至pH＝7，干燥、冷却后，将毛细管依次浸入KOH溶液、超纯水、HCl溶液、超
纯水及丙酮中分别超声清洗10-15min，105℃高温烘干后，冷却备用；
(2)毛细管的修饰：将清洗干净的毛细管浸没于修饰液中，37℃干燥环境中反应过
夜，置于大平皿中，先用无水甲苯振荡清洗3次，每次5min，再用丙酮振荡清洗3次，每次
5min，氮气气氛下干燥；
(3)免疫层析毛细管的组装：将作为检测区的抗原和作为质控区的二抗分别注入
步骤(2)处理得到的毛细管的两端，37℃下固定40min，用PBST缓冲液抽洗3次，每次用PBST
缓冲液5mL；再将毛细管全部浸入2wt％BSA溶液中，37℃封闭2h，用PBST缓冲液洗净并室温
吹干，4℃保存备用，获得免疫层析毛细管。
检测区的抗原与金标一抗进行特异性结合，当与含有恩诺沙星的待测样品存在
时，抗原与待测样品中的恩诺沙星竞争结合金标一抗，因而出现颜色差异；质控区的二抗也
能与金标一抗特异性结合，但不进行竞争反应，主要是金标一抗活性的鉴定。BSA溶液的注
入式保证封闭毛细管上没有连接抗原、二抗的非特异性结合位点，起到排除干扰的作用。玻
璃毛细管具有表面光滑、耐高温、耐酸碱、背景值低、易观察等优点，且价格低廉、易生产，在
市场推广上具有可观竞争力。
本发明克服传统免疫层析材料的局限并结合玻璃的优点，实现了恩诺沙星在免疫
层析毛细管检测方面的应用。
作为优选，步骤(2)中，修饰液按体积百分比计组成为：10％GPTMS、1％三乙胺及
89％无水甲苯。
作为优选，步骤(1)中的KOH溶液浓度为0.8-1.2mol/L，HCl溶液浓度为0.8-
1.2mol/L。
作为优选，步骤(1)中所述piranha溶液的制备方法如下：浓度为95wt％以上的浓
硫酸与双氧水以3:1体积比混合，冰浴条件混合，混合时将双氧水溶液缓慢加入浓硫酸中，
不断搅拌使混合液温度保持在80℃以下。
作为优选，步骤(3)中，所述抗原为恩诺沙星与BSA偶联的抗原，二抗为羊抗鼠二
抗。抗原的选择非常关键，单独的恩诺沙星属于半抗原，具备免疫反应性，而不具备免疫原
性。将恩诺沙星与蛋白质载体BSA结合，使其可以非特异结合在已修饰的玻璃毛细管壁上。
同时，本发明采用蛋白质载体BSA制备包被抗原EF-BSA，保证了抗体的较强特异性，使其保
持较高的检测灵敏性，可与样品中的EF竞争金标抗体而产生颜色差异，便于准确性分析，对
于检测的重复性和稳定性提高有帮助。
恩诺沙星与BSA偶联的抗原其制备方法如下：
1、BSA溶液封闭：将200μL乙二胺(EDA)，236mg/BSA，256mgEDC依次溶于10mL PBS
中，恒温震荡过夜(20℃、110r/min)后，经PBS(0.01M，pH7.4)完全透析，备用。
2、制备包被抗原：取30mgEF，10.4mgNHS，18.6mgEDC溶于500μL DMF中，室温振荡
24h，得a液。将a液逐滴加入50mg封闭好的BSA溶液中，室温避光振荡反应3h，取出进行透析3
天后，用紫外分光光度计进行紫外吸收光谱全波长扫描(200nm～400nm)，检验偶联情况，反
应液冷冻干燥，-80℃备用。
作为优选，恩诺沙星与BSA偶联的抗原与PBS缓冲液配制成浓度0.075mg/mL的抗原
溶液后注入毛细管，羊抗鼠二抗与PBS缓冲液配制成浓度0.69mg/mL的羊抗鼠二抗溶液后注
入毛细管。
作为优选，抗原溶液注入毛细管的用量为2μL，羊抗鼠二抗溶液注入毛细管的用量
为2μL。
作为优选，一抗为鼠抗恩诺沙星。
本发明的有益效果是：
1、本发明的前处理方法相对简单，根据恩诺沙星为酸稳定性，干扰蛋白可以通过
该途径除去，获得了纯度较高的恩诺沙星提取溶液，即防止杂蛋白交叉干扰，提高检测准确
度。
2、检测用时短，整个过程最多25min，实验结果易观察。同时可采用扫描仪进行灰
度扫描，实现其结果的半定量检测，全程不需要大型仪器，操作简便，对操作人员无要求。
3、以毛细管为免疫层析基底，避免了硝酸纤维素膜等传统基底的检测结果不明
显、重复性差等缺点，有利于检测结果的分辨。
4、玻璃毛细管具有表面光滑、背景值低、耐酸碱、基质无渗透等优点，作为免疫层
析的反应基底，使结果易观察，提高了检测灵敏度与重复性，延长了贮藏期。
5、毛细管直径较小，在通常情况下，只需微量待检溶液即可完成检测。
6、市面所售的玻璃毛细管价格低廉且销售广泛，作为检测材料，降低了整个检测
过程的成本，因此使其在检测方法领域具有极大的竞争潜力。
附图说明
图1是免疫层析毛细管对恩诺沙星检测结果的扫描图片，两端分别为控制区和检
测区，恩诺沙星的浓度为从0到15ng/mL。
图2是检测区的相对灰度对恩诺沙星浓度绘制的拟合曲线，恩诺沙星的浓度为从0
到50ng/mL。
图3是对免疫层析毛细管不同批次组内与组间的检测区结果扫描图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
1、仪器和试剂
恩诺沙星与BSA偶联的抗原(EF-BSA)：其制备方法如下：
1、BSA溶液封闭：将200μL乙二胺(EDA)，236mg/BSA，256mgEDC依次溶于10mL PBS
中，恒温震荡过夜(20℃、110r/min)后，经PBS(0.01M，pH7.4)完全透析，备用。
2、制备包被抗原：取30mgEF，10.4mgNHS，18.6mgEDC溶于500μL DMF中，室温振荡
24h，得a液。将a液逐滴加入50mg封闭好的BSA溶液中，室温避光振荡反应3h，取出进行透析3
天后，用紫外分光光度计进行紫外吸收光谱全波长扫描(200nm～400nm)，检验偶联情况，反
应液冷冻干燥，-80℃备用。
2、免疫层析毛细管的组装
(1)毛细管的处理：
piranha溶液的制备方法如下：浓度为95wt％以上的浓硫酸与双氧水以3:1体积比
混合，冰浴条件混合，即将双氧水溶液缓慢加入浓硫酸中，不断搅拌使混合液温度保持在80
℃以下，尽量保持无气泡产生的加入速度即可。
将毛细管迅速浸入上述热的piranha溶液中超声清洗15min，超纯水清洗至中性，
105℃的烘箱中干燥2h，冷却，然后将毛细管依次浸入浓度为0.8mol/L的KOH溶液(200mL)、
超纯水(200mL，中间更换两次)、浓度为0.8mol/L的HCl溶液(200mL)、超纯水(200mL，中间更
换两次)及丙酮(200mL)中分别超声清洗15min，然后在105℃的烘箱中干燥1h以上，以完全
除去水分。
(2)毛细管的修饰：
将清洗干净的毛细管浸没于含有10％GPTMS和1％三乙胺的无水甲苯的修饰液中，
37℃干燥环境中反应过夜，置于大平皿中，先用无水甲苯振荡清洗3次，每次约5min，再用丙
酮振荡清洗3次，每次约5min，氮气气氛下干燥。
(3)免疫层析毛细管的组装：
作为检测区的抗原和作为质控区的二抗分别注入步骤(2)处理得到的毛细管的两
端，37℃下固定40min，用PBST抽洗3次，每次用洗涤液PBST约5mL。再将毛细管全部浸入
2wt％BSA溶液中，37℃封闭2h，用PBST洗净并室温吹干，4℃保存备用，获得免疫层析毛细
管。
将作为检测区的抗原浓度0.075mg/mL的EF-BSA溶液(PH7.4，0.01mol/L PBS配
制)，作为质控区的二抗为浓度0.69mg/mL的羊抗鼠二抗溶液(PH7.4，0.01mol/L PBS配制)。
分别取2μL两种溶液注入毛细管的两端，37℃下固定40min，用PBST抽洗3次，每次用洗涤液
PBST约5mL。再将毛细管全部浸入2wt％BSA溶液中，37℃封闭2h，用PBST洗净并室温吹干，4
℃保存备用，获得免疫层析毛细管。
毛细管的质控区和检测区的组装原理简述如下：经强酸、强碱、有机试剂清洗等处
理使毛细管暴露羟基基团，通过硅烷试剂的修饰，可结合环氧基团共价连接目的蛋白质，将
包被原(EF-BSA)和羊抗鼠二抗分别固定在玻璃毛细管两端，作为检测区(TZ)和质控区
(CZ)。当含有目标药物恩诺沙星(EF)与金标一抗以一定比例混合注入到检测区，此时溶液
中的EF与毛细管上的EF-BSA同时竞争结合金标一抗，使金标一抗结合在检测区的颜色随恩
诺沙星含量的增大而逐渐变浅甚至消失，即检测结果判定为阳性；同样，颜色未变浅表现为
酒红色的混合液，即判定结果为阴性。而质控区的二抗与金标一抗的结合显色均为酒红色，
与EF含量无关，用以证明金标一抗的结合活性，且质控区显色，结果判定才有效，否则会出
现假阳性假阴性的现象，影响检测结果。
3、毛细管检测条件的优化
检测区与质控区的抗原与二抗的浓度选择，通过将抗原与二抗分别配制成0～
0.25mg/mL、0～1.2mg/mL，选取阴性样品使检测区与质控区颜色相近且肉眼易区分的稀释
浓度为最优，以保证灵敏度与肉眼检测达到较好的效果。因此，因此根据实验结果确定包被
抗原EF-BSA浓度为0.075mg/ml，羊抗鼠二抗浓度为0.69mg/ml。
固定时间与封闭时间的优化，将已确定的浓度进一步固定时间的优化，分别在37
℃固定10、20、30、40、50、60min，经确定保持稳定的最短时间为40min。以2wt％BSA对已固定
的抗原、二抗进行封闭，以1、1.5、2、2.5h进行不同时间的封闭。最终确定2h为BSA封闭时间。
按照已经确定好的抗原和二抗的包被量进行毛细管的组装，进一步确定一抗的检
测比例。本实验通过1：1～1：6的一抗稀释比例确定保证肉眼易观察的稀释比例为最优。因
此确定1：3为胶体金标记抗体稀释液体积比。
4、对恩诺沙星的检测
4.1胶体金标记的一抗(金标一抗)的制备
胶体金的制备：将实验用到的玻璃仪器等在新配置的王水中浸泡20min后，用大量
超纯水冲洗干净，放置于100℃以上进行干燥，待用。
向双颈瓶中加入100ml HAuCl4(1mM)在冷凝条件下使用磁力加热搅拌器均匀加
热，充分沸腾后，快速加入10ml 38.8mM柠檬酸三钠溶液，待颜色由淡黄变为深红色，继续回
流15mins后停止加热，继续搅拌冷却至室温。将冷却的胶体金溶液过0.22μm水系膜，置于4
℃条件避光保存。
胶体金标记的一抗的制备：10mL胶体金溶液中加入0.1M的K2CO3溶液，并缓慢加入
适量的的鼠抗恩诺沙星IgG抗体，使溶液保持约pH 8.0，缓慢均匀搅拌1h后，加入5％BSA和
1％的聚乙二醇(PEG 20000)至最终体积的1/10，继续搅拌1h后，3500r/min、4℃离心15min
除去暗红色沉淀，取上清液以10000r/min、4℃离心65min收集沉淀，将沉淀溶于1mL、pH 8.2
含有1％BSA、0.02％NaN3、5％蔗糖、0.1％Tween-20的Tris-HCl缓冲液，重复离心收集沉淀，
复溶于1mL的复溶液中，置于-20℃保存。
4.2具体实施
实施例1
一、待测样品处理：将1±0.1g鱼肉(从青岛家乐福超市中购买的大菱鲆)与2mL
2％磺基水杨酸溶液进行混合匀浆1～2min后，4500g、4℃离心15min，取上清液用2M NaOH调
PH为8.0～8.5，并过0.45μm膜制成待测溶液，置于4℃避光保存，作为测试样品。
二、样品检测：将4.1节制备的胶体金标记的一抗(金标鼠抗恩诺沙星)与测试样品
按1:3的体积比混合均匀得混合液，吸取混合液3μL注入检测区。静置10min后，用移液枪推
入质控区，停留10min，用PBST缓冲液(PH7.4)洗净吹干，即可通过肉眼定性观测结果或通过
扫描仪半定量计算检测结果。
实施例2
一、待测样品处理：将1±0.1g虾肉(从青岛家乐福超市中购买的南美白对虾)与
2mL 2％磺基水杨酸溶液进行混合匀浆1～2min后，4500g、4℃离心15min，取上清液用2M
NaOH调PH为8.0～8.5，并过0.45μm膜制成待测溶液，置于4℃避光保存，作为测试样品。
二、样品检测：将4.1节制备的胶体金标记的一抗(金标鼠抗恩诺沙星)与测试样品
按1:3的体积比混合均匀得混合液，吸取混合液3μL注入检测区。静置10min后，用移液枪推
入质控区，停留10min，用PBST缓冲液(PH7.4)洗净吹干，即可通过肉眼定性观测结果或通过
扫描仪半定量计算检测结果。
实施例3
一、待测样品处理：将1±0.1g鱼肉(从青岛家乐福超市购买的鲅鱼)与2mL2％磺基
水杨酸溶液进行混合匀浆1～2min后，4500g、4℃离心15min，取上清液用2M NaOH调PH为8.0
～8.5，并过0.45μm膜制成待测溶液，置于4℃避光保存，作为测试样品。
二、样品检测：将4.1节制备的胶体金标记的一抗(金标鼠抗恩诺沙星)与测试样品
按1:3的体积比混合均匀得混合液，吸取混合液3μL注入检测区。静置10min后，用移液枪推
入质控区，停留10min，用PBST缓冲液(PH7.4)洗净吹干，即可通过肉眼定性观测结果或通过
扫描仪半定量计算检测结果。
当含有目标药物恩诺沙星(EF)待测溶液与金标一抗混合液注入到检测区，此时溶
液中的EF与毛细管上的EF-BSA同时竞争结合金标一抗，使金标一抗结合在检测区的颜色随
恩诺沙星含量的增大而逐渐变浅甚至消失，即检测结果判定为阳性；同样，颜色未变浅表现
为酒红色的混合液，即判定结果为阴性。若出现质控区不显色，即为检测结果失效。显色后
的免疫层析毛细管可通过扫描仪进行灰度扫描，分析色度。通过色度与恩诺沙星浓度进行
四参数拟合，进一步确定半定量检测限。
表1本发明的方法检测水产品中不同浓度的恩诺沙星(EF)与环丙沙星(CIP)
a:无红色条带
b:明显的红色条带
4.3不同浓度恩诺沙星的检测分析
以一系列浓度梯度的标准恩诺沙星溶液(0.01M PH7.4的PBS溶液配制)与金标一
抗等体积比混合后，吸取混合液3μL注入检测区。静置10min后，用移液枪推入质控区，停留
10min，用PBST缓冲液(PH7.4)洗净吹干，即可通过肉眼定性观测结果或通过扫描仪半定量
计算检测结果如图1。当恩诺沙星达到5ppb时，检测区颜色开始降低，随浓度增加，颜色继续
降低甚至消限，因此本发明确定免疫层析毛细管检测技术的恩诺沙星视觉检测限为5ppb。
本发明将已检测的免疫层析毛细管用HP平板扫描仪进行高质量的图片扫描。将扫
描的图片转化为灰度图像进行相对灰度的计算，运用相对灰度比值与恩诺沙星浓度可形成
四元拟合确定其半定量检测限如图2所示，并计算其半定量检测限为1.29ppb。当恩诺沙星
在0～15ppb间表现出良好的线性关系，其关系式为：y＝-0.0636x+0.99869，R2＝0.9734。说
明本发明在此范围内可实现准确检测。
4.4毛细层析管的特异性
胶体金免疫层析毛细管检测法对恩诺沙星检测的特异性是通过检测不同浓度梯
度的恩诺沙星类似物:环丙沙星、诺氟沙星、沙拉沙星、氯霉素、土霉素等类似物进行验证。
结果发现：该方法也可检测环丙沙星，并根据上述4.3的检测方法进行视觉检测限与半定量
检测限的确定，即该方法的环丙沙星视觉检测限为10ppb，半定量检测限为4.37ppb；针对诺
氟沙星在中高浓度有所检出，而其他类似物均无交叉。因此，本发明可准确检测恩诺沙星与
环丙沙星的药物残留，符合中华人名共和国农业部公告(第235号)恩诺沙星检测指标(含环
丙沙星共同检测)小于100ppb。
4.5毛细层析管的稳定性和重复性
对5个批次制备的免疫层析毛细管，每个批次3个平行进行验证。对低中浓度的样
品进行检测如图3，其检测结果进行扫描并进行色度分析，发现批间差异相对偏差均小于
2％，说检测结果比较稳定。
将同一批次制备的免疫层析毛细管4℃干燥、4℃抑菌溶液中分别储存40天，进行
阴性样本检测检测区和控制区的颜色均没有显著变化，说明储存稳定性良好。免疫层析毛
细管的稳定性可能受环境温度、湿度、光及微生物的潜在影响，破坏了以环氧基团连接的共
价键桥，因此进一步针对其保藏情况，以严格无菌条件及紫外光照条件下常温贮藏，其稳定
性可长达4个月以上，增强了其贮藏稳定性。
6、与现有方法的比较
本发明的方法对恩诺沙星检测的效果与其他快速检方法的最新研究进行比较，结
果见表2可知，本发明的方法具有较低的检测限、用时较短，具备方法的优越性和快速检测
竞争力。
表2恩诺沙星快速检测方法最新研究的比较
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的
限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。