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1、10申请公布号CN104073467A43申请公布日20141001CN104073467A21申请号201310102720422申请日20130327C12N5/078201001A61K35/14200601A61P35/0020060171申请人上海宇研生物技术有限公司地址200233上海市徐汇区漕宝路103号11幢08室72发明人徐荻张尚泉吴涤梵74专利代理机构上海华工专利事务所普通合伙31104代理人应云平54发明名称一种人DCCIK免疫活性细胞的制备方法57摘要本发明公开了一种人DCCIK免疫活性细胞的制备方法，包括以下步骤（1）从人外周血中分离单个核细胞；（2）将单个核细胞接种。
2、到适合淋巴细胞培养的培养基中，加入IFN、IL2、抗CD3单抗、GMCSF、IL4，培养35天；（3）加入TNF，继续培养12天；（4）加入IL2，继续培养710天，即得DCCIK细胞。本发明直接在单个核细胞中加入各种细胞因子和刺激因子组合，使DC细胞和淋巴细胞共同诱导，互相刺激成熟，既简化了操作步骤，减少实验耗材，又可缩短细胞培养的时间，同时规范化的实验流程技术容易掌握，便于临床推广应用。51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104073467ACN104073467A1/1页21一种人DCCIK免疫活。
3、性细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤（1）从人外周血中分离单个核细胞；（2）将单个核细胞接种到适合淋巴细胞培养的培养基中，加入IFN、IL2、抗CD3单抗、GMCSF、IL4，培养35天；（3）加入TNF，继续培养12天；（4）加入IL2，继续培养710天，即得DCCIK细胞。2如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述单个核细胞是采用人淋巴细胞分离液密度梯度离心的方法制备。3如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述培养基为无血清培养基。4如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述IFN的浓度为2001000U/ML、所述IL2的浓。
4、度为100500U/ML、所述抗CD3单抗的浓度为1050NG/ML、所述GMCSF的浓度为500U/ML、所述IL4的浓度为5001000U/ML。5如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述单个核细胞的细胞浓度调整为12106/ML。6如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中所述TNF的浓度为5001000U/ML。7如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中所述IL2的浓度为5001000U/ML。8如权利要求17中任一项所述的制备方法制备得到的DCCIK细胞。9如权利要求8所述的DCCIK细胞在制备抗肿瘤药物的应用。权利要求书CN1040。
5、73467A1/4页3一种人DCCIK免疫活性细胞的制备方法技术领域0001本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人DCCIK免疫活性细胞的制备方法。背景技术0002国内外大量基础和临床研究证明免疫治疗与传统的手术、放疗、化疗相结合对肿瘤患者病情的控制、生活质量的改善和生存期的延长具有重要的作用，近来研究更发现非特异性免疫细胞可以杀伤肿瘤干细胞，防止肿瘤的复发和转移（RTALLERICOETAL，THEJOURNALOFIMMUNOLOGY,2013,190（5）238190）。目前国内外应用最多的非特异性免疫细胞治疗方法是CIK、DCCIK细胞治疗。0003CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞。
6、（CYTOKINEINDUCEDKILLER），是通过多种细胞因子在体外将人外周血单个核细胞诱导的免疫效应细胞，具有增殖能力强，对肿瘤的非MHC杀伤能力强的特点，与其它免疫细胞制剂相比具有细胞扩增数量多、抗肿瘤效果强而且毒副反应更小的优点。CIK细胞的制备方法和应用已有较多的文献和专利公开（高岱清，一种制备CIK细胞的方法，专利申请号2012103654997）0004在人体免疫系统中，DC细胞（树突状细胞）是最为重要的高度专职化的主要抗原递呈细胞，在诱导针对相关抗原的高效、特异性T细胞免疫应答中起到关键作用。00052001年，研究发现将肿瘤患者自体的DC细胞加入体外诱导的CIK细胞中，两种。
7、细胞可以互相促进成熟，并诱导出比同源CIK细胞增殖活性和肿瘤细胞杀伤活性更强的细胞群（MARTEN,AETAL,JIMMUNOTHER,2001,246502510）。我国科学家也开展了大量DCCIK的共培养研究，证明DCCIK比CIK具有更强的细胞增殖率，并能分泌更多的IL12、IFN等细胞因子，对肿瘤细胞的杀伤活性也更为强大（LI，SJETAL，ZHONGHUAZHONGLIUZAZHI2007OCT29107337）。0006现有的DCCIK培养技术需要从人外周血单个核细胞（PBMC）中分离出贴壁的单核细胞和悬浮的淋巴细胞分别诱导，等单核细胞诱导出的DC细胞成熟后再与悬浮的淋巴细胞共培养。
8、，该方法技术复杂，对操作人员的技术水平和熟练度要求也高，所以不适合用于大规模的稳定的技术推广。发明内容0007为了解决现有的DCCIK培养技术中，DC细胞需要从贴壁的单核细胞诱导成熟后再与CIK细胞混合所存在的操作繁琐、技术复杂的问题，本发明提供了一种简单、高效、易推广应用的DCCIK制备技术。0008因此，本发明的第一个目的在于提供一种人DCCIK免疫活性细胞的制备方法。0009本发明的第二个目的在于提供所述制备方法制备得到的人DCCIK免疫活性细胞。0010本发明的第三个目的在于所述人DCCIK免疫活性细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。0011为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案说明书。
9、CN104073467A2/4页40012一种人DCCIK免疫活性细胞的制备方法，包括以下步骤0013（1）从人外周血中分离单个核细胞；0014（2）将单个核细胞接种到适合淋巴细胞培养的培养基中，加入IFN、IL2、抗CD3单抗、GMCSF、IL4，培养35天；0015（3）加入TNF，继续培养12天；0016（4）加入IL2，继续培养710天，即得DCCIK细胞。0017根据本发明，所述步骤（1）中所述单个核细胞是采用人淋巴细胞分离液密度梯度离心的方法制备。0018根据本发明，所述步骤（2）中所述培养基为无血清培养基。0019根据本发明，所述步骤（2）中所述IFN的浓度为2001000U/M。
10、L、所述IL2的浓度为100500U/ML、所述抗CD3单抗的浓度为1050NG/ML、所述GMCSF的浓度为500U/ML、所述IL4的浓度为5001000U/ML。0020根据本发明，所述步骤（2）中所述单个核细胞的细胞浓度调整为12106/ML。0021根据本发明，所述步骤（3）中所述TNF的浓度为5001000U/ML。0022根据本发明，所述步骤（4）中所述IL2的浓度为5001000U/ML。0023本发明的有益效果本发明直接在单个核细胞中加入各种细胞因子和刺激因子组合，使DC细胞和淋巴细胞共同诱导，互相刺激成熟，既简化了操作步骤，减少实验耗材，又可缩短细胞培养的时间，同时规范化的。
11、实验流程技术容易掌握，便于临床推广应用。具体实施方式0024以下通过具体实施例，对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。0025实施例1、DCCIK细胞和CIK细胞的制备002611、本发明的DCCIK细胞的制备0027本发明的DCCIK细胞的制备方法如下0028采集患者外周血，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心分离出单个核细胞。将单个核细胞接种到GTT551无血清培养基（购自日本TAKARA公司），调整细胞浓度为1106/ML，添加IFN（1000U/ML）、IL2（500U/ML）、抗CD3单抗（20NG/ML）、IL4（1000U/ML）、GMC。
12、SF（500U/ML）。然后在37、5CO2条件下培养，5天后即可诱导出未成熟DC细胞，加入TNF（500U/ML）使DC成熟。7天后加入含IL2（500U/ML）的GTT551无血清培养基隔天传代培养710天，即得DCCIK细胞。002912、现有技术的DCCIK细胞的制备0030现有技术的DCCIK细胞的制备方法如下0031采集患者外周血，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心分离出单个核细胞。取单个核细胞接种到GTT551无血清培养基，调整细胞浓度为1106/ML，添加IFN（1000U/ML）。然后在37、5CO2条件下培养2H。将非黏附细胞移入经抗CD3单抗包被的100ML培养瓶中，添加RH。
13、IL1（100U/ML）、RHIL2（300U/ML），隔天传代培养。在留有贴壁的黏附细胞的培养瓶中，加入含IL4（1000U/ML）、GMCSF（500U/ML）的GTT551无血清培养基，在37、5CO2条件下培养5天，加入TNF（500U/ML）继续培养。第7天，将分别诱说明书CN104073467A3/4页5导培养7天的DC与CIK细胞15混合后，按5105/ML浓度再隔天传代培养710天，即得DCCIK细胞。003213、现有技术的CIK细胞的制备0033现有技术的CIK细胞的制备方法如下0034采集患者外周血，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心分离出单个核细胞。将单个核细胞接种到GTT。
14、551无血清培养基，调整细胞浓度为1106/ML，添加IFN（1000U/ML）、抗CD3单抗（20NG/ML）、RHIL2（500U/ML）。然后在37、5CO2条件下培养，隔天传代培养15天，即得CIK细胞。0035实施例2、细胞数、细胞表型和肿瘤细胞杀伤活性测定0036将实施例1中制备的三种细胞进行细胞数、细胞表型和肿瘤细胞杀伤活性测定，结果如下。003721、细胞数测定0038将三种细胞培养不同时间，通过细胞计数测定细胞扩增倍数，结果如表1所示。0039表1、细胞扩增倍数结果004000410042如表1所示，结果显示本发明混合诱导培养的DCCIK增殖倍数与现有技术的方法获得的DCCI。
15、K细胞基本一致，在培养15天时，比CIK细胞培养增殖倍数提高4倍以上。004322、细胞表型分析0044将培养15天的三种细胞应用FITC标记抗人CD分子单抗，然后与DCCIK细胞表面CD结合，测试DCCIK免疫效应细胞CD3CD56的百分率，具体操作如下0045取一定体积的细胞（细胞总数为1106/ML）悬液于流式细胞仪测试管中，离心，弃上清液，保留细胞。按照美国BECTONDICKINSON公司的标记抗体使用说明，将抗人的CD3FITC、抗CD56PE加入测试管中，混匀，4、30分钟，1000RMP离心3MIN，用PBS洗涤细胞三次，然后悬浮于05MLPBS中，流式细胞仪测试。0046结果。
16、如表2所示。0047表2、细胞表型分析结果00480049如表2所示，结果显示本发明混合诱导培养的DCCIK免疫效应细胞中CD3CD56的说明书CN104073467A4/4页6百分率与现有技术的方法获得的DCCIK细胞基本一致，并且显著高于CIK细胞。005023、肿瘤杀伤活性分析0051将培养15天的三种免疫细胞作为效应细胞，靶细胞为对NK细胞敏感的K562肿瘤细胞株（中科院上海生命科学研究院提供），按照效靶比101的比例加入96孔培养板中，另设单独靶细胞组和单独效应细胞组为对照，在37，5CO2培养过夜，采用MTT法测定波长为570NM处吸光度。结果如表3所示。0052表3、肿瘤杀伤活性分析结果00530054如表3所示，结果显示本发明混合诱导培养的DCCIK细胞对于肿瘤细胞的杀伤活性与现有技术的方法获得的DCCIK细胞活性相似，并且强于CIK细胞。0055综上所述，本发明的DCCIK免疫活性细胞的制备方法是直接在单个核细胞中加入各种细胞因子和刺激因子组合，使DC细胞和淋巴细胞共同诱导，互相刺激成熟，操作简便。本发明制备的DCCIK免疫活性细胞在细胞增殖倍数、细胞表型及肿瘤杀伤活性方面与现有技术的方法获得的DCCIK免疫活性细胞相当，并且高于CIK细胞。说明书CN104073467A。