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1、10申请公布号CN104059040A43申请公布日20140924CN104059040A21申请号201410320456622申请日20140708CCTCCM201425620140615C07D307/86200601A61K31/343200601A61P35/00200601C12P17/04200601C12R1/64520060171申请人福建师范大学地址350117福建省福州市大学城福建师范大学旗山校区72发明人郑永标王继峰庞海月74专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊54发明名称具有抗肿瘤活性的倍半萜类化合物及其制备方法57摘要本发明涉及一种具有。
2、抗肿瘤活性的倍半萜类化合物及其制备方法，属于生物医药领域。所述倍半萜类化合物结构式。该化合物源于野生鲍鱼菇（PLEUROTUSCYSTIDIOSUS）ZYB2013，将该倍半萜类化合物作为抗肿瘤药物或肿瘤细胞增殖抑制药物。本发明所述的倍半萜化合物结构新颖，具有很强的抗肿瘤活性。测定化合物的抗肿瘤活性，发现其对前列腺癌细胞DU145、C42B和LNCAP的有较强的抑制效果。结果表明，所述的倍半萜化合物具有抗肿瘤活性，可应用于制备抗肿瘤药物或其他生物活性先导物。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页10申请公布。
3、号CN104059040ACN104059040A1/1页21一种倍半萜类化合物，具有如下式12中的一种的结构式。2一种如权利要求1所述的倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于通过发酵培养野生鲍鱼菇（PLEUROTUSCYSTIDIOSUS）ZYB2013，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物，所述野生鲍鱼菇（PLEUROTUSCYSTIDIOSUS）ZYB2013，已于2014年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2014256。3权利要求1所述的倍半萜类化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制药物中的用途。4权利要求1所述的倍半萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。5根据。
4、权利要求3所述的倍半萜类化合物的应用，其特征在于所述肿瘤细胞为前列腺癌细胞DU145、C42B和LNCAP。权利要求书CN104059040A1/6页3具有抗肿瘤活性的倍半萜类化合物及其制备方法技术领域0001本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的倍半萜类化合物及其制备方法，属于生物医药领域。背景技术0002倍半萜（SESQUITERPENES）是指分子中含15个碳原子的天然萜类化合物。倍半萜类化合物分布较广，在木兰目（MAGNOLIALES）、芸香目（RUTALES）、山茱萸目（CORNALES）及菊目（ASTERALES）植物中最丰富。在植物体内常以醇、酮、内酯等等形式存在于挥发油中，是挥发油中高。
5、沸点部分的主要组成部分。多具有较强的香气和生物活性，是医药、食品、化妆品工业的重要原料。0003本发明人研究得知，野生鲍鱼菇（PLEUROTUSCYSTIDIOSUS）ZYB2013（已于2014年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2014256），固体培养前期菌丝洁白，培养后期菌丝会产生黑色分泌物。遂对发酵产物的活性成分进行研究。研究发现所示倍半萜类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见所示倍半萜类化合物对肿瘤细胞的增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。发明内容0004本发明的目的在于提供一种由真菌发酵产生的倍半萜类化合物及其制备方法。0005本发明的。
6、另一目的在于将该倍半萜类化合物作为抗肿瘤药物或肿瘤细胞增殖抑制药物。0006本发明所涉及的真菌为野生鲍鱼菇（PLEUROTUSCYSTIDIOSUS）ZYB2013，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏编号为CCTCCM2014256，保藏的培养物名称及注明的鉴别特征为野生鲍鱼菇PLEUROTUSCYSTIDIOSUS，保藏日为2014年6月15日。0007本发明所述倍半萜化合物的化学结构式如下。0008本发明所述的倍半萜化合物的制备方法，通过发酵培养野生鲍鱼菇（PLEUROTUSCYSTIDIOSUS）ZYB2013，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物，所述野生鲍鱼。
7、菇（PLEUROTUSCYSTIDIOSUS）ZYB2013，已于2014年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2014256。0009具体步骤为1）真菌固体培养将保藏编号为CCTCCM2014256的野生鲍鱼菇（PLEUROTUS说明书CN104059040A2/6页4CYSTIDIOSUS）ZYB2013斜面菌种活化后进行固体培养发酵，固体发酵的培养基配方按重量比为马铃薯1030，葡萄糖13，琼脂粉052，余量为水，PH自然，01MPA、121灭菌30MIN，置于2530恒温培养箱中培养2050天；2）发酵产物处理发酵结束后，将菌丝体与发酵基质切成小块，用13倍体。
8、积的乙酸、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的几种混合，其中乙酸体积占15，浸提15遍以上，过滤收集有机浸提液，在4050减压浓缩至膏状，膏状物用纯水和乙酸乙酯（纯水和乙酸乙酯的体积为11）萃取18次，乙酸乙酯相在4050减压浓缩至膏状，得到乙酸乙酯粗提物浸膏；3）将2）所述的乙酸乙酯粗提物浸膏用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析（反相硅胶采用RP18，用量为样品质量的40400倍），先用纯水洗脱510个柱体积，再以甲醇水梯度，分管收集，各管于4050分别减压浓缩，根据薄层层析（以氯仿甲醇101为展开剂，以10硫酸乙醇为显色剂）结果，将含有目标化合物的收集管合并为组分FR1；4）将FR1进行反相硅胶柱层析，以甲。
9、醇水为洗脱剂，分管收集，每试管取样进行薄层层析，合并相似组分得到FRC1和FRC2。FRC1经SEPHADEXLH20葡聚糖凝胶柱层析，丙酮洗脱，接着经反相硅胶柱层析，40甲醇洗脱，再经正相硅胶柱层析，氯仿甲醇（2001）洗脱得到化合物1。将FRC2经SEPHADEXLH20葡聚糖凝胶柱层析，丙酮洗脱，正相硅胶柱层析，氯仿甲醇（2001）洗脱，再经SEPHADEXLH20葡聚糖凝胶柱层析，丙酮洗脱，分管收集，薄层层析检测得到化合物2。0010本发明还保护了所述的倍半萜类化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制药物中的用途，及在制备抗肿瘤药物中的用途。所述肿瘤细胞为前列腺癌细胞DU145、C42B和LNCA。
10、P。0011根据质谱（ESI）、高分辨质谱（HRMSEI）、圆二色谱（CD）、旋光（A）、紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）和核磁共振波谱（1HNMR、13CNMR、HSQC、HMBC、1H,1HCOSY和NOESY）的数据对化合物进行结构鉴定，可确定化合物结构。利用细胞毒MTT（噻唑蓝）法（参见文献MOSMANNTRAPIDCOLORIMETRICASSAYFORCELLULARGROWTHANDSURVIVALAPPLICATIONTOPROLIFERATIONANDCYTOTOXICITYASSAYSJJIMMUNOLMETHODS，1983，65（12）5563）测定化合物的抗肿瘤活性。
11、，发现其对前列腺癌细胞DU145、C42B和LNCAP的有较强的抑制效果。结果表明，所述的倍半萜化合物具有抗肿瘤活性，可应用于制备抗肿瘤药物或其他生物活性先导物。0012本发明所述的倍半萜化合物结构新颖，具有很强的抗肿瘤活性。利用野生鲍鱼菇（PLEUROTUSCYSTIDIOSUS）ZYB2013发酵制得，发酵原料来源价格便宜，制备方法简单，容易实现工业化生产。具体实施方式0013在如下的实施例中所指的化合物1、2的化学结构说明书CN104059040A3/6页5以下实施例将对本发明作进一步说明。0014实施例1配制固体PDA培养基（每升水中含15L分装于750个90MM玻璃培养皿中，每个约装。
12、20ML培养基，灭菌后接入已活化的野生鲍鱼菇（PLEUROTUSCYSTIDIOSUS）ZYB2013（已于2014年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2014256）菌丝块，于28恒温培养箱中进行培养43天。培养后，将野生鲍鱼菇菌丝体连同培养基切碎，置于龙头瓶中，加入有机溶剂（乙酸乙酯甲醇乙酸体积比80155）浸提6次，收集提取液，在40减压浓缩至膏状，膏状物用纯水和乙酸乙酯11萃取6次，乙酸乙酯相用无水硫酸钠脱水后，在40减压浓缩至膏状，得到乙酸乙酯粗提物浸膏（44057G）。0015将上一步骤中44057G乙酸乙酯粗提物，用适量甲醇充分溶解，进行反相硅胶（17。
13、0G）柱层析。用甲醇水梯度水，30甲醇，50甲醇，70甲醇，甲醇和水分别洗脱15L、15L、15L、14L、1L和1L，流速约为20ML/MIN，每管收集200ML，每试管取样进行薄层层析（展开剂为氯仿甲醇151，显色剂10硫酸乙醇；下同）分析结果，合并相似组分，得到FRA（1955MG）、FRB（1548MG）、FRC（4957MG）、FRD（2400MG）、FRE（17335MG）、FRF（6930MG）和FRG（3188MG）七个组分。0016将上一步骤得到的组分FRC（4957MG）进行反相硅胶（30G）柱层析，分别以35甲醇水和45甲醇水为洗脱剂，分管收集，每试管取样进行薄层层析，合。
14、并相似组分得到FRC1（2229MG）和FRC2（1341MG）。FRC1经SEPHADEXLH20葡聚糖凝胶（120G）柱层析，丙酮洗脱得到FRC11（886MG），接着经反相硅胶柱层析（30G），300ML40甲醇洗脱得到FRC111（565MG），FRC111经正相硅胶（2G）柱层析，150ML氯仿甲醇（2001）洗脱得到化合物1（61MG）。将FRC2经SEPHADEXLH20葡聚糖凝胶（120G）柱层析，丙酮洗脱得到FRC21（166MG）和FRC22（490MG）。FRC21用正相硅胶（1G）柱层析，150ML氯仿甲醇（2001）洗脱得到FRC211（73MG），再经SEPHADE。
15、XLH20葡聚糖凝胶（30G）柱层析，丙酮洗脱，分管收集，薄层层析检测得到化合物2（30MG）。0017将上一步骤所得的化合物1、2，进行质谱（ESI）、高分辨质谱（HRMSEI）、圆二色谱（CD）、旋光（A）、紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）和核磁共振波谱（1HNMR、13CNMR、HSQC、HMBC、1H,1HCOSY和NOESY）测定，并确定化合物结构。0018化合物1，白色无定形，易溶于甲醇，A517C023，MEOH；UVVISMEOH，/NM216；HRMSEI，M/Z2661521理论值2661518；IRKBRNMAX3441,1749，1623CM1；结合1H和13CNMR。
16、谱数据表1确定分子式为C15H22O4。红外光谱中，化合物1在3441、1749和1623CM1有较强吸收，分别提示在化合物1含有羟基、羰基和双键基团。分析1H和13CNMR以及DEPT谱，表明化合物1含有3个甲基，3个亚甲基（其中一个为端烯上的亚说明书CN104059040A4/6页6甲基），5个次甲基（其中3个连氧，1个为烯次甲基），4个季碳（其中1个连氧，2个为烯碳，1个为羰基）。在HMBC谱中，两个甲基质子H312和H313与C11和C10以及相互之间的存在明显碳氢远程相关，再根据H10与C9、C12和C13的碳氢远程相关以及C9（C1998S）的化学位移值，表明化合物1含有由C9、C。
17、10、C11、C12和C13组成的带羰基的异戊二烯片段。根据HMBC谱中可观察到的如下碳氢远程相关端烯的亚甲基H215与C6和C8，H1与C2、C7和C8，H6与C7，H8与C7，以及1H1HCOSY谱中存在的H6与H1的较强氢氢相关，可以建立由C1、C6、C7、C8和C15组成的端烯取代的呋喃结构片段。1H1HCOSY谱中，H1与H2和H6，以及H25与H4和H6有较强的相关点，再根据H314与C2、C3和C4较强的HMBC碳氢远程相关，可以建立由C1、C2、C3、C4、C5、C6和C15组成的由羟基和甲基取代的环已烷结构片段，并可由H24与C2、C5、C6和C14较强的HMBC碳氢远程相关。
18、进一步确认。HMBC谱中还有发现H8与C9，和H25与C7和C15的相关，据此可将三个片段组成化合物1的基本结构。NOESY谱中H1与H6，H6与H5A，H5A与H6具有明显的相关，表明H1、H6、H5A同一朝向，同时，H2与H314，H2与H8具有明显的NOESY相关，表明H2、H314、H8朝向相反，因此化合物1的相对构型得以建立，经检索化合物1为BISABOLANE型倍半萜，命名为PLEUROTONA。0019表1化合物1的NMR数据（MEOD,500M）（注字母Q,T,D,S分别表示伯，仲，叔，季碳，由DEPT图确定；DHH化学位移；DCC化说明书CN104059040A5/6页7学位。
19、移；J耦合常数；MULTIPLICITY多重裂峰，下文同）。0020化合物2，白色无定形，易溶于甲醇，A796C032，MEOH；UVVISMEOH，/NM247；ESI，M/Z2812MH；HRMSEI，M/Z2821461理论值2821467；IRKBRNMAX3443,1758，1684，1622CM1；结合1H和13CNMR谱数据表2确定分子式为C15H22O5。分析1H和13CNMR以及DEPT谱，表明化合物2含有3个甲基，3个亚甲基（其中一个为端烯上的亚甲基），4个次甲基（其中2个连氧，1个为烯次甲基），5个季碳（其中2个连氧，2个为烯碳，1个为羰基）。通过NMR数据比较，表明化合。
20、物2与化合物1的结构类似，仅化合物1中的C8位为连氧的次甲基，而化合物2中的C8位为双氧取代的季碳。化合物2的结构也由HMBC实验中观察到的碳氢远程相关（H312和H313与C11和C10以及相互之间，H10与C12、C13和C9，H1与C2、C7和C8，H4与C5、C14、C6、C3和C2，H5与C4、C6、C3和C7，H314与C2、C3和C4，H215与C6、C7和C8），以及1H1HCOSY谱中存在的较强氢氢相关H1与H6和H2，H5与H4和H6予以确认。NOESY谱中H1与H6，H6与H5A，H5A与H6具有明显的相关，表明H1、H6、H5A同一朝向，同时，H2与H314，H2与H4。
21、B具有明显的NOESY相关，表明H2、H314、H4B朝向相反，据此化合物2的相对构型也得以建立。化合物2也是BISABOLANE型倍半萜，命名为PLEUROTONB。0021表2化合物2的NMR数据（MEOD,500M）说明书CN104059040A6/6页8实施例2用MTT法测定化合物对前列腺癌细胞DU145、C42B和LNCAP的抑制效果。把培养好的前列腺癌细胞DU145、C42B和LNCAP制成单细胞悬液，用细胞板计数并稀释至细胞浓度为6104个/ML。于96孔板中接种细胞，每孔80L。另设2孔无细胞、仅有80L培养液DULBECCOSMODIEDEAGLESMEDIA（DMEM,GI。
22、BCO,USA）10小牛血清的用于仪器调零的空白对照孔。置37，5CO2的培养箱中培养24H，然后加入20L用培养液稀释好的样品。同时，往阳性对照孔加20L顺铂，往阴性对照孔和空白对照孔各加20L培养液。继续培养72H，每孔加10L5MG/MLMTT。37反应3H，每孔加100L10SDS001MOL/LHCL溶解过夜。酶标仪比色测定（测定波长570NM，参考波长655NM）。对肿瘤细胞的抑制率计算方法为（阴性对照组OD值实验组OD值）/阴性对照组OD值空白组OD值100。采用SPSS软件计算IC50值。实验表明，化合物1对前列腺癌细胞DU145、C42B和LNCAP的IC50值分别为0174、0104和0091MM，化合物2对前列腺癌细胞DU145、C42B和LNCAP的IC50值分别为0028、0052和0051MM，化合物12显示了较强的抑制前列腺癌细胞的活性。可见，本发明所述的倍半萜化合物可作为抗肿瘤药物或其他生物活性先导物。说明书CN104059040A。