一种鱼油中EPA、DHA及总W3酸含量测定的色谱方法.pdf

本发明公开了一种鱼油中EPA、DHA及总w-3酸含量测定的色谱方法，包括以下步骤：（1）酯化处理；（2）样品溶液配制；（3）标准品溶液配制；（4）色谱条件设定；（5）进样顺序；（6）通过待测样品与标准品的保留时间和峰面积关系进行对比，确定样品中的含量；在含有w-3脂肪酸的鱼油试样处理过程中，对不饱和脂肪酸皂化反应完成后，直接用三氟化硼甲醇溶液进行成酯反应；之后直接用含有BHT的异辛烷溶液提取不饱和脂肪酸酯作为测定试样。本方法采用恰当的成酯方法和试样后处理方法，测试操作周期短，能够有效避免操作中的挥发等问题，测定结果准确可靠，尤其适合于工业生产等需要规模化测定的场合。

权利要求书
1.   一种鱼油中EPA、DHA及总w-3酸含量测定的色谱方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）酯化处理：EPA对照品和样品进行甲酯化处理转换成酯；
（2）样品溶液配制：精密称取约含10 mg DHA的样品于容量瓶中，加少量氢氧化钠溶液调节pH，100°C水浴加热5分钟；加适量三氟化硼甲醇溶液，混匀，在100°C水浴加热2 分钟，冷却至50°C，加入含BHT的异辛烷溶液，混匀，加饱和氯化钠溶液定容至刻度；当异辛烷层和水层分离时，移取适量异辛烷层至具塞的容量瓶中，加适量水至容量瓶中，混匀；移取上层溶液至第二个同样大小的容量瓶中，加水混匀；移取上层溶液至第三个同样大小的容量瓶中，加少量无水硫酸钠混匀；
（3）标准品溶液配制：将DHA甲酯标准品、已酯化的EPA标准品和含有C18：3， C20：4， C20：5， C22：5和C22：6的混合脂肪酸的酯的对照品直接用样品溶剂配成标准溶液待测；
（4）色谱条件设定：
a. 色谱柱：DBFF-FFAP，15mm′0.53mm，涂层1.0 um或等效的柱子；
b. 载气：氮气；
c. 流速：0.5 mL/min；
d. 分流比：20：1；
e. 进样体积：2 μL；
f. 进口温度：250 °C；
g. 检测器温度：270 °C；
h. 加热程序：炉温：170°C保持1.5 min，升温速度：3°C/min，240°C保持30 min；
（5）进样顺序：EPA标准溶液6针作为系统适用性，DHA标准溶液2针 ，混合脂肪酸对照溶液1针，样品2针，最后再进1针EPA 标准溶液；
（6）通过待测样品与标准品的保留时间和峰面积关系进行对比，确定样品中的含量。

2.  根据权利要求1所述鱼油中EPA、DHA及总w-3酸含量测定的色谱方法，其特征在于：测定对象包括EPA、DHA、总w-3酸或总w-3酸中的其它单独一种或几种。

3.  根据权利要求1所述鱼油中EPA、DHA及总w-3酸含量测定的色谱方法，其特征在于：除鱼油保健品外，还适用于含有一种或多种w-3酸的药品和药用动植物的测定。

说明书一种鱼油中EPA、DHA及总w-3酸含量测定的色谱方法
技术领域
本发明属于气相色谱法（GC）在食品药品组分分析中的具体应用，更具体地说，涉及一种鱼油中EPA、DHA及总w-3酸含量测定的色谱方法。
背景技术
鱼油是一种具有很高利用价值的天然保健食品。其富含的w-3不饱和脂肪酸具有帮助降低胆固醇，防止血液凝固，预防血栓、动脉硬化及高血压疾病，降低血液黏度，促进血液循环，消除疲劳，缓和痛风及风湿性关节炎症的功效。鱼油中所富含的w-3不饱和脂肪酸中，尤以二十碳五烯酸（EPA）（C20：5 n-3）和二十二碳六烯酸（DHA）（C22：6 n-3）最为重要。EPA对肺病、肾病、2型糖尿病、大肠溃疡和节段性回肠炎等的治疗都会起到积极作用；DHA为大脑及视网膜中含量最高的w-3脂肪酸，占大脑中多元不饱和脂肪酸的40%，视网膜中多元不饱和脂肪酸的60%，对脑和视觉的发育和功能维持起到重要作用。同时EPA和DHA能阻止血小板在血管壁上的沉积，预防或减轻动脉粥样硬化和冠心病等发生。因此，准确测定鱼油中EPA、DHA及总w-3酸的含量对鱼油产品的生产加工、功效评价等有重要意义。色谱法是测定EPA、DHA和总w-3酸含量的标准方法，但操作过程中通常需要提前配置抗氧化溶液，再用抗氧化溶液配置标准溶液和待测溶液，用多份溶液分别优化测定条件，并分别测定后得出EPA、DHA和总w-3酸的含量。已有操作方法复杂，且测定过程中易出现溶剂挥发造成所得结果异常。
发明内容
、要解决的问题
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提出一套简便的样品和标准品处理方法，并选择相应的色谱条件，同时测定鱼油中EPA、DHA和总w-3酸含量的方法，通过直接加入2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）、盐类物质来配置标准品和样品溶液，直接进样进行测定。
、技术方案  
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种鱼油中EPA、DHA及总w-3酸含量测定的色谱方法，包括以下步骤：
（1）酯化处理：EPA对照品和样品进行甲酯化处理转换成酯；
（2）样品溶液配制：精密称取约含10 mg DHA的样品于容量瓶中，加少量氢氧化钠溶液调节pH，100°C水浴加热5分钟；加适量三氟化硼甲醇溶液，混匀，在100°C水浴加热2 分钟，冷却至50°C，加入含BHT的异辛烷溶液，混匀，加饱和氯化钠溶液定容至刻度；当异辛烷层和水层分离时，移取适量异辛烷层至具塞的容量瓶中，加适量水至容量瓶中，混匀；移取上层溶液至第二个同样大小的容量瓶中，加水混匀；移取上层溶液至第三个同样大小的容量瓶中，加少量无水硫酸钠混匀；
（3）标准品溶液配制：将DHA甲酯标准品、已酯化的EPA标准品和含有C18：3， C20：4， C20：5， C22：5和C22：6的混合脂肪酸的酯的对照品直接用样品溶剂配成标准溶液待测；
（4）色谱条件设定：
a. 色谱柱：DBFF-FFAP，15mm′0.53mm，涂层1.0 um或等效的柱子；
b. 载气：氮气；
c. 流速：0.5 mL/min；
d. 分流比：20：1；
e. 进样体积：2 μL；
f. 进口温度：250 °C；
g. 检测器温度：270 °C；
h. 加热程序：炉温：170°C保持1.5 min，升温速度：3°C/min，240°C保持30 min；
（5）进样顺序：EPA标准溶液6针作为系统适用性，DHA标准溶液2针 ，混合脂肪酸对照溶液1针，样品2针，最后再进1针EPA 标准溶液；
（6）通过待测样品与标准品的保留时间和峰面积关系进行对比，确定样品中的含量，具体算法为：
EPA（mg/g）=(A  样) （Wst）*1000/（Ast）/（W样）
DHA （mg/g）=(A  样) （Wst）*1000*328.51/（Ast）/（W样）/342.51
总w-3酸（mg/g）=EPA+DHA+ An-3(EPA+DHA)/(Aepa+Adha) 
其中：An-3=Ac18：3+Ac20：4+Ac22：5
式中：A 样：样品中组分EPA 或DHA 的峰面积                                                 
Ast ：标准溶液中组分EPA 或DHA 的峰面积
W样： 样品的称重，mg
Wst：EPA 或DHA标准品的称重，mg。
进一步的，测定对象包括EPA、DHA、总w-3酸或总w-3酸中的其它单独一种或几种。
更进一步的，除鱼油保健品外，还适用于含有一种或多种w-3酸的药品和药用动植物的测定。
、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明在皂化反应完成后直接用三氟化硼甲醇溶液进行成酯反应；反应后直接用含有BHT的异辛烷溶液提取不饱和脂肪酸酯进样测定，由于巧妙选择了酯化和提取试剂，使操作过程得到简化，测定结果更加稳定可靠，很大程度上避免了由于挥发等因素导致的测定结果异常等情况的发生。
附图说明
图1为本方法对一种鱼油产品EPA、DHA和总w-3酸含量测定图谱；
图中A为EPA标准品图；B为DHA标准品图；C为混合脂肪酸标准品图，C18：3、C20：4和C22：5的保留时间分别为10.56 min、15.07 min和20.87 min；D为Mega EPA/DHA 300mg softgels样品检测图谱。 
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
如图1所示，Mega EPA/DHA 300mg softgels样品中EPA、DHA和总w-3酸含量的测定：
（1）试剂和储备溶液：
14% 的三氟化硼甲醇溶液
甲醇，氯化钠，异辛烷，无水硫酸钠，氢氧化钠，2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）
0.5 N 氢氧化钠的甲醇溶液：称取2g氢氧化钠于100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度；
BHT溶液：称取25mgBHT 至500ml容量瓶中，加异辛烷溶解并稀释至刻度；
标准氯化钠溶液：在100 ml水中溶解足够多的氯化钠（即氯化钠饱和溶液）。
对照品：DHA甲酯，EPA标准品。
（2）标准溶液的制备：对照品中EPA 和样品同时处理转换成酯。而DHA和混合脂肪酸对照品因本身就是酯，不用处理，直接用溶剂溶解后进样。
（3）样品溶液的制备：精密称取相当于10 mg DHA的样品于25 mL  容量瓶中，加3 mL 0.5 N氢氧化钠溶液，混匀，在100°C水浴加热5分钟 ，加5 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，混匀，在100°C水浴加热2 分钟，冷却至50°C，加入10 mL含50 mg BHT /L的异辛烷，混匀，加饱和氯化钠溶液定容至刻度。当异辛烷层和水层分离时，移取适量异辛烷层至具塞的5 mL的容量瓶中，加1 mL水至5 mL容量瓶中，混匀。移取上层溶液至第二个5 mL容量瓶中，加1 mL水混匀。移取上层溶液至第三个5 mL容量瓶中，加少量的无水硫酸钠混匀。
（4）按照第三部分发明内容中所述的色谱条件和进样顺序设定色谱检测条件，进样检测，并在相应保留时间处读取峰面积。按照如下公式计算各组分含量：
EPA（mg/g）=(A 样) （Wst）*1000/（Ast）/（W样）
DHA （mg/g）=(A 样) （Wst）*1000*328.51/（Ast）/（W样）/342.51
总w-3酸（mg/g）=EPA+DHA+ An-3(EPA+DHA)/(Aepa+Adha) 
其中：An-3=Ac18：3+Ac20：4+Ac22：5
式中：A 样：样品中组分EPA 或DHA 的峰面积
Ast ：标准溶液中组分EPA 或DHA 的峰面积
W样： 样品的称重，mg
Wst：EPA 或DHA标准品的称重，mg
得到样品中EPA含量为：168.4 mg/g
DHA含量为：129.1 mg/g
总w-3酸含量为：328.2 mg/g
测定结果证明，本方法所用成酯反应试剂和萃取试剂合理，操作周期短，简便易行，能够有效避免操作和反应过程中的挥发问题，测定结果可靠。因此，本方法非常适合于鱼油等保健食品或药品中EPA、DHA和总w-3酸含量的实际测定，尤其适用于工业生产等需要规模化测定的场合。