说明书一种基于定量核磁共振氢谱法测定芳基萘内酯型木脂素纯度的方法
技术领域
本发明涉及医药化工领域，特别是一种基于定量核磁共振氢谱法测定芳基萘内酯型木脂 素纯度的方法。
背景技术
由于生物合成的复杂性，天然产物的结构也复杂多样。以常规的色谱学方法为主的分离 纯化手段往往很难将结构非常相似的天然产物分离开来，而天然产物中混有痕量的高活性的 杂质会导致生物活性的错误结论。据相关报道，天然产物熊果酸具有120种生物活性，有些 生物活性在不同的文献中是完全相反的，如抗菌活性，细胞毒活性。出现这样结论的原因是， 测试活性所用的熊果酸样品不是单一的熊果酸化学实体，与其共存的杂质严重影响了活性结 果。因此建立完善的天然产物纯度评价方法是其准确的生物活性评价的必要条件。同时高纯 度的天然产物也是相关药材质量评价所必须的。因此天然产物的纯度评价是非常重要的。
芳基萘内酯型木脂素是从植物中发现的数目较多的一类木脂素，目前已在40余种植物中 有报道。该类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、杀虫等作用。芳基萘内酯型木脂素类化合 物以鬼臼毒素为代表，其衍生物依托泊苷(etoposide，VP-16)和替尼泊苷(teniposide，VM-26) 于上个世纪80年代应用于临床，对乳腺癌、睾丸癌、小细胞肺癌、淋巴癌、儿童白血病等多 种癌症均有良好的治疗效果，以鬼臼毒素为代表的芳基萘内酯型木脂素是目前研究最深入的 一类天然产物之一，一直备受国内外学者的广泛关注。此类化合物在相关药材中的含量主要 通过薄层色谱，高效液相色谱，毛细管电泳色谱，其中以带有紫外检测器的高效液相色谱方 法最为普遍，这种方法对于那些没有紫外吸收的化合物无法检测，必须有高纯度标准品作对 照，该标准品价格昂贵、不易获得，且此操作方法复杂耗时长。定量核磁共振氢谱法，由于 其操作快速简便、样品消耗量少、同时给出定性的结构信息和定量分析结果，特别是定量核 磁共振氢谱法不依赖于被测物的高纯度标准品，因此定量分析的成本大大降低。利用定量核 磁共振氢谱法，选择内标物替代使用目标测试物的标准品做外标的高效液相色谱法进行芳基 萘内酯型木脂素的纯度测定是一项非常重要的研究工作。但至今尚未见到采用定量核磁共振 氢谱法测定芳基萘内酯型木脂素的纯度的公开报道。
发明内容
针对上述情况，为了克服现有技术之缺陷，本发明提供一种基于定量核磁共振氢谱法测 定芳基萘内酯型木脂素纯度的方法，可有效解决现有芳基萘内酯型木脂素纯度检测技术成本 高、对照品不易获得，操作方法复杂、耗时长的问题。
本发明解决的技术方案为，该方法包括以下步骤：称取10-14mg的内标物，溶解于0.8-1.2 mL的DMSO-d6中，制备成内标物溶液；称取10-50mg的芳基萘内酯型木脂素，溶解于0.8-1.2 mL的DMSO-d6中，制备成目标分析物溶液；量取80-120μL的内标物溶液，180-220μL的 目标分析物溶液，180-220μL的DMSO-d6，转移到离心管中，制成样品溶液，将该样品溶液 混悬25-35s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，定量核磁测试的条件：扫描次数(NS)，8 或16；光谱宽度(SW)，15-25ppm；弛豫时间(D1)，16-35s；测试温度，20-30℃；脉冲角度， 30°，或45°，或90°；采集时间(AQ)，2.5-3.5s；测定内标物上芳香质子和芳基萘内酯型木脂 素H-2,6的峰面积，得出目标分析物相对于内标物的摩尔质量比，再通过目标分析物与内标 物的质量比依据公式：
P X = I X I Std · N Std N X · M X M Std · m Std m · P Std ]]>
计算出目标分析物的纯度PX，其中：
Ix为目标分析物的峰面积；IStd为内标的峰面积；Nx为目标分析物的原子核的数目；NStd为 内标的原子核的数目；Mx为目标分析物的摩尔质量；MStd为内标的摩尔质量；Mx为目标分 析物的质量；mStd为内标的质量；Px为目标分析物的纯度；PStd为内标物的纯度；
所述的芳基萘内酯型木脂素为去氧鬼臼毒素，鬼臼毒素，4-去甲鬼臼毒素，鬼臼毒素-7′-O-β-D- 吡喃葡萄糖苷，4-去甲鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷中的任一种；
所述内标物为1,4-二硝基苯，3,4,5-三氯吡啶，1,3,5-三氯-2-硝基苯中的任一种。
本发明成本低，可快速准确的评价芳基萘内酯型木脂素的纯度，有良好的经济和社会效 益。
附图说明
图1为本发明定量核磁谱图。
图2为本发明定量核磁共振法测定的4-去甲鬼臼毒素与1,4-二硝基苯摩尔比和重量分析 法测定的摩尔比线性回归结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
本发明方法包括以下步骤：称取10-14mg的内标物，溶解于0.8-1.2mL的DMSO-d6中， 制备成内标物溶液；称取10-50mg的芳基萘内酯型木脂素，溶解于0.8-1.2mL的DMSO-d6中，制备成目标分析物溶液；量取80-120μL的内标物溶液，180-220μL的目标分析物溶液， 180-220μL的DMSO-d6，转移到离心管中，即得样品溶液，将该样品溶液混悬25-35s，转移 至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测试的条件：扫描次数(NS)，8或16；光 谱宽度(SW)，15-25ppm；弛豫时间(D1)，16-35s；测试温度，20-30℃；脉冲角度，30°，或 45°，或90°；采集时间(AQ)，2.5-3.5s；测定内标物上芳香质子和芳基萘内酯型木脂素H-2,6 的峰面积，得出目标分析物相对于内标物的摩尔质量比，再通过目标分析物与内标物的质量 比依据公式计算出目标分析物的纯度；
所述的芳基萘内酯型木脂素为去氧鬼臼毒素，鬼臼毒素，4-去甲鬼臼毒素，鬼臼毒素-7′-O-β-D- 吡喃葡萄糖苷，4-去甲鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，sinolignan A中的任一种；
R1＝CH3或H；R2＝H，OH，glc或6-acetyl-glc
所述内标物为1,4-二硝基苯，3,4,5-三氯吡啶，1,3,5-三氯-2-硝基苯中的任一种；
所述芳基萘内酯型木脂素纯度依据如下公式获得
P X = I X I Std · N Std N X · M X M Std · m Std m · P Std ]]>
Ix为目标分析物的峰面积；IStd为内标的峰面积；Nx为目标分析物的原子核的数目；NStd为 内标的原子核的数目；Mx为目标分析物的摩尔质量；MStd为内标的摩尔质量；Mx为目标分 析物的质量；mStd为内标的质量；Px为目标分析物的纯度；PStd为内标物的纯度。
实施例1
本发明方法包括以下步骤：称取12.47mg的1,4-二硝基苯，溶解于1.0mL的DMSO-d6中，制备成1,4-二硝基苯内标物溶液；称取28.61mg的去氧鬼臼毒素，溶解于1.0mL的 DMSO-d6中，制备成去氧鬼臼毒素目标分析物溶液；量取100μL的1,4-二硝基苯内标物溶液， 200μL的去氧鬼臼毒素目标分析物溶液，200μL的DMSO-d6，转移到离心管中，即得样品溶 液，将该样品溶液混悬30s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测试的条 件：扫描次数(NS)，16；光谱宽度(SW)，20ppm；弛豫时间(D1)，16s；测试温度，25℃；脉 冲角度，30°；采集时间(AQ)，3.2s；测定1,4-二硝基苯上芳香质子和去氧鬼臼毒素H-2,6的 峰面积，得出去氧鬼臼毒素相对于1,4-二硝基苯的摩尔质量比，再通过去氧鬼臼毒素与1,4- 二硝基苯的质量比依据公式计算出去氧鬼臼毒素的纯度。
实施例2
本发明方法包括以下步骤：称取12.85mg的1,4-二硝基苯，溶解于1.0mL的DMSO-d6中，制备成1,4-二硝基苯内标物溶液；称取29.95mg的鬼臼毒素，溶解于1.0mL的DMSO-d6中，制备成鬼臼毒素目标分析物溶液；量取100μL的1,4-二硝基苯内标物溶液，200μL的鬼 臼毒素目标分析物溶液，200μL的DMSO-d6，转移到离心管中，即得样品溶液；将该样品溶 液混悬30s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测试的条件：扫描次数(NS)， 16；光谱宽度(SW)，20ppm；弛豫时间(D1)，16s；测试温度，25℃；脉冲角度，30°；采集时 间(AQ)，3.2s；测定1,4-二硝基苯上芳香质子和鬼臼毒素H-2,6的峰面积，得出鬼臼毒素相对 于1,4-二硝基苯的摩尔质量比，再通过鬼臼毒素与1,4-二硝基苯的质量比依据公式计算出鬼 臼毒素的纯度。
实施例3
本发明方法包括以下步骤：称取12.90mg的1,4-二硝基苯，溶解于1.0mL的DMSO-d6中，制备成1,4-二硝基苯内标物溶液；称取29.35mg的4-去甲鬼臼毒素，溶解于1.0mL的 DMSO-d6中，制备成4-去甲鬼臼毒素目标分析物溶液；量取100μL的1,4-二硝基苯内标物溶 液，200μL的4-去甲鬼臼毒素目标分析物溶液，200μL的DMSO-d6，转移到离心管中，即得 样品溶液，将该样品溶液混悬30s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测 试的条件：扫描次数(NS)，8；光谱宽度(SW)，25ppm；弛豫时间(D1)，35s；测试温度，30℃； 脉冲角度，90°；采集时间(AQ)，3.5s；测定1,4-二硝基苯上芳香质子和4-去甲鬼臼毒素H-2,6 的峰面积，得出4-去甲鬼臼毒素相对于1,4-二硝基苯的摩尔质量比，再通过4-去甲鬼臼毒素 与1,4-二硝基苯的质量比依据公式计算出4-去甲鬼臼毒素的纯度。
实施例4
本发明方法包括以下步骤：称取11.87mg的1,4-二硝基苯，溶解于1.0mL的DMSO-d6中，制备成1,4-二硝基苯内标物溶液；称取39.84mg的4-去甲鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖 苷，溶解于1.0mL的DMSO-d6中，制备成4-去甲鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷目标分析 物溶液；量取100μL的1,4-二硝基苯内标物溶液，200μL的4-去甲鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡 萄糖苷目标分析物溶液，200μL的DMSO-d6，转移到离心管中，即得样品溶液，将该样品溶 液混悬30s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测试的条件：扫描次数(NS)， 8；光谱宽度(SW)，15ppm；弛豫时间(D1)，16s；测试温度，20℃；脉冲角度，30°；采集时 间(AQ)，3.2s；测定1,4-二硝基苯上芳香质子和4-去甲鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷H-2,6 的峰面积，得出4-去甲鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷相对于1,4-二硝基苯的摩尔质量比， 再通过4-去甲鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷与1,4-二硝基苯的质量比依据公式计算出4- 去甲鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的纯度。
实施例5
本发明方法包括以下步骤：称取11.80mg的1,4-二硝基苯，溶解于1.0mL的DMSO-d6中，制备成1,4-二硝基苯内标物溶液；称取40.24mg的鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，溶 解于1.0mL的DMSO-d6中，制备成鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷目标分析物溶液；量取 100μL的1,4-二硝基苯内标物溶液，200μL的鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷目标分析物溶 液，200μL的DMSO-d6，转移到离心管中，即得样品溶液，将该样品溶液混悬30s，转移至 核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测试的条件：扫描次数(NS)，16；光谱宽度 (SW)，20ppm；弛豫时间(D1)，16s；测试温度，25℃；脉冲角度，30°；采集时间(AQ)，3.2 s；测定1,4-二硝基苯上芳香质子和鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷H-2,6的峰面积，得出鬼 臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷相对于1,4-二硝基苯的摩尔质量比，再通过鬼臼毒素-7′-O-β-D- 吡喃葡萄糖苷与1,4-二硝基苯的质量比依据公式计算出鬼臼毒素-7′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的纯 度。
实施例6
本发明方法包括以下步骤：该方法包括以下步骤：称取12.83mg的1,4-二硝基苯，溶解 于1.0mL的DMSO-d6中，制备成1,4-二硝基苯内标物溶液；称取47.08mg的sinolignan A， 溶解于1.0mL的DMSO-d6中，制备成sinolignan A目标分析物溶液；量取100μL的1,4-二硝 基苯内标物溶液，200μL的sinolignan A目标分析物溶液，200μL的DMSO-d6，转移到离心 管中，即得样品溶液，将该样品溶液混悬30s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的 定量核磁测试的条件：扫描次数(NS)，16；光谱宽度(SW)，20ppm；弛豫时间(D1)，35s； 测试温度，25℃；脉冲角度，90°；采集时间(AQ)，3.5s；测定1,4-二硝基苯上芳香质子和 sinolignan A的H-2,6的峰面积，得出sinolignan A相对于1,4-二硝基苯的摩尔质量比，再通过 sinolignan A与1,4-二硝基苯的质量比依据公式计算出sinolignan A的纯度。
实施例7
本发明方法包括以下步骤：称取10.91mg的3,4,5-三氯吡啶，溶解于0.8mL的DMSO-d6中，制备成3,4,5-三氯吡啶内标物溶液；称取12.11mg的鬼臼毒素，溶解于0.8mL的DMSO-d6中，制备成鬼臼毒素目标分析物溶液；量取80μL的3,4,5-三氯吡啶内标物溶液，220μL的鬼 臼毒素目标分析物溶液，220μL的DMSO-d6，转移到离心管中，即得样品溶液，将该样品溶 液混悬25s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测试的条件：扫描次数(NS)， 16；光谱宽度(SW)，20ppm；弛豫时间(D1)，16s；测试温度，25℃；脉冲角度，30°；采集 时间(AQ)，3.2s；测定1,4-二硝基苯上芳香质子和鬼臼毒素H-2,6的峰面积，得出鬼臼毒素相 对于3,4,5-三氯吡啶的摩尔质量比，再通过鬼臼毒素与3,4,5-三氯吡啶的质量比依据公式计算 出鬼臼毒素的纯度。
实施例8
本发明方法包括以下步骤：称取11.52mg的1,3,5-三氯-2-硝基苯，溶解于1.2mL的 DMSO-d6中，制备成1,3,5-三氯-2-硝基苯内标物溶液；称取15.86mg的sinolignan A，溶解于 1.2mL的DMSO-d6中，制备成sinolignan A目标分析物溶液；量取120μL的1,3,5-三氯-2-硝 基苯内标物溶液，180μL的sinolignan A目标分析物溶液，180μL的DMSO-d6，转移到离心 管中，即得样品溶液，将该样品溶液混悬35s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的 定量核磁测试的条件：扫描次数(NS)，16；光谱宽度(SW)，20ppm；弛豫时间(D1)，16s； 测试温度，25℃；脉冲角度，30°；采集时间(AQ)，3.2s；测定1,3,5-三氯-2-硝基苯上芳香质 子和sinolignan A的H-2,6的峰面积，得出sinolignan A相对于1,3,5-三氯-2-硝基苯的摩尔质 量比，再通过sinolignan A与1,3,5-三氯-2-硝基苯的质量比依据公式计算出sinolignan A的纯 度。
上述实施例1-8的参数和芳基萘内酯型木脂素纯度的结果如表1
本发明方法稳定可靠，可以准确地测定芳基萘内酯型木脂素的纯度，有关实验资料如下：
1.实验材料
4-去甲鬼臼毒素购买于南京青泽医药科技有限公司(纯度为98.0％)。1,4-二硝基苯购买 于日本东京化成工业株式会社。色谱甲醇购买于天津四友精细化学品有限公司，DMSO-d6购 买于剑桥同位素实验室。定量核磁谱图采用Bruker Avance 500MHz核磁共振仪测定。高效 液相色谱采用Waters Alliance 2489分离系统和Waters 2695紫外检测系统进行测定。
2.方法学确证
2.1.线性考察
精确称取一定量的4-去甲鬼臼毒素和1,4-二硝基苯于5ml的样品管中，加0.5ml的 DMSO-d6溶解，得到不同摩尔比例(0.946、0.6291、0.3078、1.516、2.947)的4-去甲鬼臼 毒素和1,4-二硝基苯的混合标准样品溶液。通过对定量核磁共振法测定的4-去甲鬼臼毒素与 1,4-二硝基苯摩尔比和重量分析法测定的摩尔比进行线性回归，得出线性方程，Y＝1.002X– 0.001，R2＝1。表明该方法具有良好的线性。线性样品的制备及测试结果见表1和图1。
表1 线性样品的制备和测试结果
2.2.专属性
通过测定标准样品溶液中可能存在的干扰的核磁氢信号考察来考察该方法的专属性。测 试结果表明，化学位移从δ6.2至9.0这一范围内，基线是平的，目标测试物中的H-2,6和 1,4-二硝基苯上的芳氢质子信号没有收到任何氢信号的干扰，峰形是对称的，且这两个信号 的信噪比大于1000。因此该方法的专属性较强。
2.3.准确性
通过测定三组样品的平均回收率和相对标准偏差(RSD)来考察该方法的精确性。结果见 表2，三组样品的平均回收为100.2％，相对标准偏差(RSD)为0.51％。说明该方法能够准确 地测定芳基萘内酯型木脂素的纯度。
表2.4-去甲鬼臼毒素的准确性测定结果，
组号 4-去甲鬼臼毒素(mg) 1.4-二硝基苯(mg) 纯度(％) 回收率(％)
Set-1 5.94 1.29 98.9 100.9
Set-1 5.77 1.25 97.3 99.3
Set-1 6.67 1.38 98.7 100.7
Set-2 9.85 1.07 97.8 99.8
Set-2 10.00 1.09 98.3 100.3
Set-2 11.13 1.16 98.6 100.6
Set-3 15.03 1.06 97.9 99.9
Set-3 17.10 1.18 98.1 100.1
Set-3 15.64 1.09 98.3 100.3
Mean 98.2 100.2
RSD(％) 0.51
2.4.精密度
日内精密度和日间精密度的结果分别见表3和表4。日内精密度和日间精密度的相对标 准偏差(RSD)分别为0.32％和0.36％，表明该方法精密度良好。
表3 4-去甲鬼臼毒素的日内精密度测定结果
编号 4-去甲鬼臼毒素(mg) 1.4-二硝基苯(mg) 纯度(％)
1 5.94 1.29 98.3
2 6.02 1.34 98.2
3 5.87 1.30 97.6
4 5.96 1.33 98.0
5 6.07 1.34 98.0
6 6.01 1.30 97.5
Mean 97.9
RSD(％) 0.32
表4 4-去甲鬼臼毒素的日间精密度测定结果
编号 4-去甲鬼臼毒素(mg) 1.4-二硝基苯(mg) 纯度(％)
1 6.04 1.32 98.2
2 6.01 1.30 98.3
3 5.85 1.29 97.6
4 5.86 1.31 98.1
5 6.07 1.36 98.0
6 6.15 1.34 97.4
Mean 97.9
RSD(％) 0.36
2.5.稳定性
制备好的标准样品溶液分别在0、8、16和24小时后测定纯度，RSD为0.34％，表明样 品溶液在24小时内是稳定存在的。结果见表5。
表5 4-去甲鬼臼毒素的稳定性测定结果
2.6.定量核磁测定法和高效液相色谱法对芳基萘内酯型木脂素纯度测定的比较研究
为进一步确证该方法的准确性，采用高效液相色谱法对芳基萘内酯型木脂素的纯度进行 了测定。液相色谱条件为，甲醇-水梯度洗脱(35-65％，0-35min；65-100％，35-50min)； 检测波长210nm；流速1.0ml/ml；柱温25℃。统计结果表明，定量核磁测定法和高效液相色 谱法对芳基萘内酯型木脂素纯度的测定结果是基本一致的。具体见表6。
表6 定量核磁测定法和高效液相色谱法对芳基萘内酯型木脂素纯度的测定结果
根据本实验的分析结果，与传统的高效液相色谱方法相比，定量核磁共振氢谱法具有以 下优点：
①快速。对于每个定量核磁共振样品的前处理及分析需要15min即可。而高效液相色谱 法每个样品的前处理和分析共计65min(样品前处理5min；色谱柱平衡10min；色谱分析50min)。 每个样品定量核磁共振氢谱法可节约50min。
②准确。对于缺乏共轭系统的化合物，带有紫外检测器的高效液相色谱法是不响应的。 因此当目标分析物中混有这类缺乏共轭系统的杂质时，分析结果是不准确的。定量核磁共振 氢谱法检测的是氢核，对于有机化合物来说氢核是普遍存在的，目标分析物和与其共存的有 机杂质是否含有共轭系统，定量核磁共振氢谱法都能对其准确的检测出来。
③节约成本。定量核磁共振氢谱法用廉价易得的结构简单分子量适中的有机小分子做内 标，本次试验采用1,4-二硝基苯做内标，需要量约1mg,成本是15元；0.5ml的DMSO-d6，成 本为20元。对于定量核磁共振氢谱法，每个样品需要约35元。高效液相色谱法，色谱甲醇 60ml,成本约2元；需要目标物的标准品约10mg,不同的芳基萘内酯型木脂素的成本也不尽相 同,去氧鬼臼毒素(335元)，鬼臼毒素(190元)，4-去甲鬼臼毒素(225元)，对于高效液相 色谱法，每个样品需要192-337元，节约成本157-302元。而芳基萘内酯型木脂素糖苷如鬼 臼毒素-7′-O-β-D-葡萄糖苷，4-去甲鬼臼毒素-7′-O-β-D-葡萄糖苷，sinolignan A在市场上很 难买到，因此对于这三个芳基萘内酯型木脂素糖苷的绝对纯度测定无法通过高效液相色谱法 进行测定。
上述实验可以清楚的表明，本发明公开了芳基萘内酯型木脂素纯度测定方法，定量核磁共 振氢谱法可以快速准确地测定芳基萘内酯型木脂素的纯度，成本低，为芳基萘内酯型木脂素 进一步准确的生物活性评价和相关药材的质量控制提供了前期基础，为天然产物的纯度评价 做出创造性贡献，具有良好的经济和社会效益。