用于区分肝癌和肺癌的生物标记物.pdf

本发明涉及区分肝癌和肺癌的新生物标记物，所述生物标记物对不同癌症中病理学改变较敏感，特别是在疾病或损伤早期阶段。本发明的目的是提供区分肝癌和肺癌的特异性多胺生物标记物，该标记物为人尿液中的酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸，确切地说是酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸的浓度的比值。该生物标记物对癌症中病理学改变较敏感，可用于癌症的诊断、预后和疗效评价。

权利要求书
1.  人尿液中酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸作为区分肺癌与肝癌的标记物的应用。

2.  如权利要求1所述的应用，其特征在于酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸浓度的比值作为区分肺癌与肝癌的标记物的应用。

3.  一种应用酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸浓度的比值区分肺癌与肝癌的方法，其步骤包括：
（1）分别收集已知肺癌患者和肝癌患者的尿液；
（2）分别检测肺癌患者和肝癌患者尿液中的酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸的浓度；
（3）用步骤（2）测得的酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸浓度的比值进行聚类分析。

4.  如权利要求3所述的方法，其特征在于聚类分析为SPSS软件（版本号19.0）中的系统聚类分析方法。

说明书用于区分肝癌和肺癌的生物标记物
技术领域
本发明涉及区分肝癌和肺癌的新生物标记物，所述生物标记物对不同癌症中 病理学改变较敏感，特别是在疾病或损伤早期阶段。
背景技术
代谢组学(metabonomics/metabolomics)是继基因组学、转录组学、蛋白质 组学之后提出的一门新的学科，是系统生物学中的一个重要组成部分。生物机体 在受到外界病源或环境改变的刺激时，会产生多层次、多器官和多组织的应答反 应，这些应答反应最终将影响到终端代谢水平的变化正是研究这种机体在受到内 因、外因的刺激时，机体内的终端小分子代谢物(通常指分子量小于1000Da)的 变化规律的科学，从整体上动态地阐述生理或病理状态下机体对外界刺激的应答 和动态系统性的变化过程，为全面理解多因素影响下的癌症的发生机制研究将提 供一个新的视角。同时，从整体上考察人体的生理状态，能得到更多的疾病相关 信息，有利于癌症的早期诊断。另外，代谢组学技术分析的样本主要是尿液和血 液，其采集过程对人体无伤害或是有极小的伤害，因此代谢组学的方法将有利于 癌症的大规模筛查。
癌症是一大类恶性肿瘤的统称。癌细胞的特点是无限制、无止境地增生，使 患者体内的营养物质被大量消耗；癌细胞释放出多种毒素，使人体产生一系列症 状；癌细胞还可转移到全身各处生长繁殖，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不 振、发热以及严重的脏器功能受损等等，继而破坏组织、器官的结构和功能，引 起坏死出血合并感染，患者最终由于器官功能衰竭而死亡。
肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，无论是在全世界还是国内上来看,肺癌 均占肿瘤之首，其发病率和病死率均迅速上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居 首位。肺癌的发病率和死亡率在逐年上升，世界年患病人数在90万左右，我国 近10年内恶性肿瘤发病率及死亡率以肺癌增长最为迅速，肺癌已成为我国第一 大癌症。肺癌是复发转移率高的肿瘤，即使进行根治性切除，也多因术后复发转 移而死亡。肺癌的病发与不良的生活习惯,环境因素与大气污染等密切相关。肺 癌生长速度缓慢，病程较长的早期诊断与治疗可以在很大程度上给患者带来治愈 的机会，肺癌的诊断中肿瘤标记物的检测就显得十分重要。
据统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。原发性 肝癌按细胞分型可分为肝细胞型肝癌、胆管细胞型肝癌及混合型肝癌。按肿瘤的 形态可分为结节型、巨块型和弥漫型。原发性肝癌在我国属于高发病，一般男性 多于女性。中国是乙肝大国，我国的肝癌多在乙肝肝硬化的基础上发展而来，丙 肝病人也在逐渐增加，乙肝后也会发展为肝癌。目前我国发病人数约占全球的半 数以上，占全球肝癌病人的55％，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一 大杀手。因其恶性度高、病情进展快，病人早期一般没有什么不适，一旦出现症 状就诊，往往已属中晚期。故治疗难度大、疗效差，发病后生存时间短。在我国， 每年有11万人死于肝癌，其中男性8万，女性3万，占全世界肝癌死亡人数的 45％。作为最常见的一种恶性肿瘤，肝癌死亡率仅居高，全国每年至少有12万 人被肝癌夺去生命。
肝癌起病隐匿，超过60％的肝癌患者在初次就诊时已经进入中晚期，从而失 去根治性治疗的机会，总体5年生存率只有7％左右。目前，临床上常用的肝癌 诊断标记物为甲胎蛋白，简称AFP。然而，甲胎蛋白诊断肝癌的敏感度和特异度 并不十分理想，在妊娠妇女、急慢性肝炎、生殖腺肿瘤和胃肠道肿瘤等人群中也 可能升高。而且，临床上有40％的肝癌患者甲胎蛋白并不升高，呈现阴性。因 此，寻找特异性和敏感性均高的诊断肝癌、特别是早期肝癌的分子标记物，成为 临床研究的重点和难点。
目前临床上以大分子癌症标记物的单一或联合使用作为癌症诊断手段的研 究较多，而对于小分子类癌症标记物缺乏系统深入的研究。现代研究表明，内源 性小分子物质多胺类化合物与癌症的发生密切相关。国内外研究均表明癌症患者 体内多胺水平高于正常人群及非肿瘤患者体内多胺水平。多胺在生物体内多是水 溶性的，通常在体液pH环境下完全质子化，以多阳离子形式存在，常与RNA， DNA等多阴离子复合体结合在一起，并处于动态平衡之中。多胺能直接参与生 物体内的多种生理活动，如核酸的复制、转录、翻译，蛋白质的合成和膜结构的 稳定等，它是生物体生长和细胞代谢所必须的内源性微量活性物质。一般在RNA, DNA及蛋白质合成增高之前，多胺含量急剧上升，如在癌症组织中多胺水平明 显升高，而多胺的过度积累还会导致细胞的凋亡及转变，使癌症进一步恶化。多 胺包括1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺、酰化精脒、酰化精胺等。多胺包 括1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺、酰化精脒、酰化精胺等。目前研究未 能证实何种多胺为癌症的生物标记物，也没有发现区分不同癌症的特异性生物标 记物，这大大影响了多胺作为癌症辅助诊断、预后和疗效评价指标等方面的应用。
发明内容
本发明的目的是提供区分肝癌和肺癌的特异性多胺生物标记物，该标记物为 人尿液中的酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸，确切地说是酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸的浓 度的比值。
本发明采用UHPLC-MS/MS法分别检测肺癌患者与肝癌患者血浆样本中1,3-丙 二胺(DAP)，腐胺(PUT)，尸胺(CAD)，精脒(SPD)，精胺(SPM)， 胍丁胺(AGM)，鸟氨酸(ORN)，赖氨酸(LYS)，精氨酸(ARG)，S-腺 苷蛋氨酸(SAM)，酰化腐胺(NPUT)，酰化精胺(NSPM)，酰化精脒(NSPD) 与γ-氨基丁酸(GABA)等14种与多胺合成与分解代谢密切相关的物质。(详见 Determination of polyamine metabolome in plasma and urine by ultrahigh  performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method:Application  to identify potential markers for human hepatic cancer.Anal Chim Acta. 2013；791:36-45)对于得到的检测数据，首先对所测得的尿液多胺类物质的数据 进行异常值检测,去掉由于样本收集或者测定误差等导致的异常样本。进而分别对 肺癌和肝癌患者赋值为1和2作为因变量,以14种待测物为自变量进行二元逻辑回 归分析,所得到的变量酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸浓度的比值可以作为区分肺癌与 肝癌的依据。最后以此变量为指标采用聚类分析的方法进行验证。结果表明以尿 液中酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸浓度的比值为指标可以将肺癌患者与肝癌患者区 分开来。
附图说明
图1为实施例3中，去除异常值后以肺癌患者与肝癌患者尿液中酰化精脒与S-腺 苷蛋氨酸浓度比值为指标的聚类谱系图。结果表明以尿液中酰化精脒与S- 腺苷蛋氨酸浓度的比值为指标可以将肺癌患者与肝癌患者区分开来。(图 中GU01-GU50为肝癌患者数据，其中异常值去除了GU05，GU30，GU39， GU40，GU45与GU50；FU01-FU50为肺癌患者数据，其中异常值去除了 FU03，FU17，FU32，FU33与FU44)。
具体实施方式
实施例1 肺癌与肝癌尿液样品收集方法
收集经病理细胞学证实为肺癌患者50例，其中男性30例，女性20例,年龄 27-77岁，平均53岁。肝癌患者50例，其中男性30例，女性20例,年龄45-77岁,平 均57岁。采集肺癌与肝癌患者晨尿，于超低温冰箱中低于-80℃冷冻保存。
取尿液样品250μL于EP管中，加入50μL加入血的甲醇：水(20:80，v：v) 混合溶液和50μL溶液内标溶液(1,6-己二胺，100ng/mL)，涡旋30s。加入含0.1％ 乙酸的甲醇溶液后涡旋5min，15000r/min离心3min，取上清液于空气流下吹 干，以50μL含0.05％七氟丁酸甲醇溶液–含0.05％七氟丁酸水溶液(20:80,v/v) 复溶。取5μL上清液用于UHPLC-MS/MS分析。
实施例2 肺癌与肝癌尿液样品中多胺类物质的检测方法
对实施例1制得的5μL上清液进行UHPLC-MS/MS分析，检测条件如下：
(1)试剂
标准物质1,3-丙二胺，腐胺，尸胺盐酸盐，精脒盐酸盐，精胺盐酸盐，胍丁 胺硫酸盐，酰化腐胺盐酸盐，酰化精脒盐酸盐，酰化精胺盐酸盐，鸟氨酸盐酸盐， 赖氨酸，精氨酸，S-腺苷蛋氨酸，七氟丁酸均为Sigma公司产品。HPLC级甲醇 为Fisher公司产品，其它化学试剂仅为分析纯，水为去离子重蒸水。
(2)仪器
Prominence UFLC XR型超快速高分离液相色谱仪配有LC-20AD输液泵、 SIL-20AC自动进样器、CTO-20AC柱温箱和DGU-20A3脱气机(日本岛津株 式会社)；API 4000型三重四极杆串联质谱仪(美国ABSCIEX公司)和Analyst 1.5. 1数据处理系统；AB135-S电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；超声 波发生器(浙江象山石浦海天电子仪器厂)；液体快速混合器(上海医科大学仪 器厂)；HC-2516高速离心机(科大创新股份有限公司)。
(3)色谱条件
采用岛津公司XRLC-20AD ProminenceTMUFLC系列仪器，色谱柱: Shim-pack XR-ODS色谱柱(75mm×3.0mm，2.2μm)，流动相:以0.05％七氟 丁酸水溶液(A)-0.05％七氟丁酸甲醇(B)梯度洗脱，梯度洗脱程序如下： 0.01-2.00min，20％B；2.01-4.00min，20％B→50％B；4.01–6.00min，50％B； 6.01–9.00min，20％B。流速:0.4mL/min；柱温:40℃；进样量:5μL。
(4)质谱条件
采用AB公司QTRAPTM4000 MS/MS系列质谱仪。离子源:ESI；检测模式: 正离子模式；扫描模式:多反应离子监测(MRM)。源温度500℃；气帘气(氮气) 压力138kPa(20psi)；雾化气压力276kPa(40psi)；涡轮气压力276kPa(40psi)； 离子喷雾电压5500V；各待测物离子源参数与定量分析方法如表一所示，扫描时间 为200ms。以所建立的方法测定50例肺癌患者和50例肝癌患者尿液中多胺代谢轮 廓中各待测物的含量，每一样品测试一次。根据标准曲线，计算尿液样品中各待 测物浓度。(数据见附表二)
表一 多胺代谢物离子源参数与定量分析方法

表二 50名肺癌患者与50名肝癌患者尿液中多胺代谢物浓度分布情况。

实施例3 肺癌与肝癌尿液样品的数理统计方法
对实施例2测得的数据首先进行异常值检验，采用汉佩尔检验法进行分析，其 具体步骤为：
1.计算整个数据集的均值(Me)，该均值将这一数据集分为高低俩部分。
2.根据数据集中所有元素的均值计算ri
ri＝(xi-Me)为数据集中的简单数据，
x属于1--n这一数据集，n为数据集中元素的数量，Me为均值
计算偏差Me|ri|的均值，根据条件|ri|≥4.5Me|ri|
当以上条件成立时，该数据集中的数值即被视为异常值。
5例肺癌数据与6例肝癌数据被去除。进而分别对肺癌尿液与肝癌尿液数据赋 值1与2作为因变量，14个多胺待测物作为自变量进行二元逻辑回归分析。结果在 回归方程中得到自变量酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸，其回归系数Sig值均小于0.001 (详见表三)。根据酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸的相关系数为-0.905，表示为负相 关(详见表四)。因此对酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸的浓度做比值，应用SPSS软件 (版本19.0)对肺癌患者与肝癌患者血浆中酰化精脒与S-腺苷蛋氨酸比值的情况 进行系统聚类分析，采用离差平方和法(Ward’s method)，以切比雪夫定律 (chebychev)作为样品相似性的测度。聚类分析将89个尿液样本分为2类，其中肺 癌患者被分成一组，肝癌患者被分为另一组。证明采用尿液中酰化精脒与S-腺苷 蛋氨酸浓度的比值可以区分肺癌患者与肝癌患者。(详见图1)
表三 肺癌患者与肝癌患者二元逻辑回归分析结果
Variables in the Equation

a.Variable(s)entered on step 1:SAM.
b.Variable(s)entered on step 2:NSPD.
c.Variable(s)entered on step 3:ARG.
d.Variable(s)entered on step 4:DAP.
表四 肺癌患者与肝癌患者二元逻辑回归分析结果
Correlation Matrix