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1、(10)申请公布号 CN 102260744 A (43)申请公布日 2011.11.30 CN 102260744 A *CN102260744A* (21)申请号 201110202716.6 (22)申请日 2011.07.20 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 浙江工商大学 地址 310018 浙江省杭州市下沙高教园区学 正街 18 号 (72)发明人 傅玲琳 王彦波 (74)专利代理机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 33100 代理人 徐关寿 (54) 发明名称 一种特异性指示禽。
2、粪便污染的基因检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种特异性指示禽粪便污染的 基因检测方法， 包括从水域中提取待测水样 DNA ； 用特异性引物荧光定量PCR选择性扩增样品DNA ； 将扩增产物核苷酸序列与基因标记 Av-Bac 核 苷酸序列进行比对的步骤。本发明将基因标记 Av-Bac 用于水体中禽源粪便污染 （非点源污染） 的溯源， 具有显著的宿主特异性， 正确判别率可达 100%。 并可定量检测禽粪便污染情况， 从而能正确 评估其污染贡献率。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2。
3、 页 CN 102260748 A1/1 页 2 1. 一种特异性指示禽粪便污染的基因检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： a) 从水域中提取待测水样 DNA ； b) 用荧光定量 PCR 扩增样品 DNA ； 其中， 引物核苷酸序列为 ： 正向引物 Av-BacF: 5 - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3 反向引物 Av-BacR: 5 -CGCCCATTGACCAATA-3 探针序列为 ： FAM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA ； c) 将上述扩增产物核苷酸序列与下述核苷酸序列进行比对 ： Av-Bac ： 5 -CTTCG ATGGA TAGGG G。
4、TTCT GAGAG GAAGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3 若二者核苷酸序列相同， 且该序列平均浓度为每毫升样品中含2.50.3 log10拷贝， 则 该水域判断为受禽粪便污染的水域。 2. 如权利要求 1 所述的基因检测方法， 其特征在于， 步骤 b 中， 荧光定量 PCR 反应的引 物浓度为 300 nmol， 探针浓度为 200 nmol。 3. 如权利要求 1 所述的基因检测方法， 其特征在于， 步骤 b 中， 荧光定量 PCR 反。
5、应程序 为 ： 95 C， 10 min ； 95 C 15 sec, 58 C 1 min， 45 个循环， 在每个循环退火、 延伸阶 段收集荧光信号。 4. 一种用于权利要求 1-3 任一权利要求所述基因检测方法的引物， 其特征在于， 该 引物序列为 ： 正向引物 Av-BacF: 5 - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3 ； 反向引物 Av-BacR: 5 -CGCCCATTGACCAATA-3 。 权 利 要 求 书 CN 102260744 A CN 102260748 A1/5 页 3 一种特异性指示禽粪便污染的基因检测方法 技术领域 0001 本发明属于环境生物技术领。
6、域， 具体涉及一种特异性指示禽粪便污染的基因检测 方法。 背景技术 0002 随着沿海养殖业的发展， 农业非点源污染畜禽排泄物污染已成为影响近海海 域及养殖水体环境质量的重要污染源。畜禽养殖排泄物多以非点源的方式进入水体环境， 其随机性、 散在性、 广泛性和多样性给管理和控制造成了巨大困难。 动物粪便带来的大量致 病微生物， 诸如霍乱弧菌、 伤寒沙门氏菌、 肠兰伯氏鞭毛虫、 甲型肝炎病毒、 贝类 Norwalk 病 毒等可以随着污染的水体到处传播。部分细菌或病毒能够直接作用于海洋动植物， 导致鱼 类或贝类等水产养殖品大量死亡 ； 部分致病菌还可以存活于贝类或鱼类体内， 通过食物链 进入人体， 。
7、造成流行病传染病的暴发。 由此可见， 粪便污染不仅给水产养殖业和海洋生态环 境带来危害， 而且还威胁着人类的健康生活。治病要去根， 治污当溯源。建立监测、 溯源和 示踪为一体的近岸海域及养殖水环境非点源污染示踪监测体系势在必行。 0003 为了解决农业粪便污染对水环境带来的污染问题， 以美国为代表的先进国家开始 了一种新型识别粪便污染源技术微生物源示踪 （Microbial Source Tracking, MST） 的研究。 MST是指利用微生物为污染源的示踪指示物， 识别污染环境中污染物 （特别是粪便） 来源的生物技术。MST 监测的优势主要体现在 ： 1) 准确识别环境水域中非点源污染，。
8、 特别 是粪便污染的来源 ； 2) 正确评估非点源污染水体的污染贡献率 ； 3) 明确各已知污染源与 病原微生物和污染危害之间的相关性 ； 4) 用于预测各已知污染源污染物的迁移化规律和 扩散途径。 0004 微生物源示踪的具体方法可分为依赖数据库型 （library-dependent methods, LDMs） 和非依赖数据库型 （library-independent methods, LIMs） 两大类。LDMs 方法是 利用不同宿主来源指示微生物 （如E. coli） 表型或基因型的差异建立相应数据库， 并参照 数据库信息判别未知宿主来源的指示菌， 从而追溯粪便污染的来源 ； 包括。
9、抗生素耐药法、 脂 肪酸分析法、 核糖体法、 脉冲场电泳法、 rep-PCR 指纹分析法等。LIMs 方法主要依赖于宿主 特异性分子标记的检测， 关键在于筛选针对不同动物宿主的特异性标记。目前研究较为成 熟且应用广泛的是 LDMs， 然而此类方法需要大量菌株的分离纯化及相关特性数据库的建 立， 耗时耗力且具有区域局限性 ； 因此， 基于宿主特异性标记检测的 LIMs 方法越来越受到 关注。近年来研究发现， 宿主特异性拟杆菌属 （Bacteroidales） 16S rRNA 基因标记的检测 可有效用于指示人源和动物源粪便污染， 是一种理想的 LIMs 方法。已有研究筛选得到特 异性指示人、 狗。
10、、 牛和猪粪便污染的Bacteroidales 16S rRNA 基因标记 （Kildare et al., 2007, Water Res. 41:37013715; Layton et al., 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72:42144224; Mieszkin et al., 2009, Appl. Environ. Microbiol. 75:3045 3054） ， 而特异性指示禽粪便污染的Bacteroidales 16S rRNA 基因标记未见报道。 说 明 书 CN 102260744 A CN 102260748 A2/5 页 4 发明。
11、内容 0005 本发明的目的在于通过系统进化分析禽粪便拟杆菌属 （Bacteroidales） 16S rRNA 序列， 获得一种特异性指示禽粪便污染的基因标记 Av-Bac， 最终将该基因标记应用于水体 中禽源粪便污染的溯源。 0006 一种特异性指示禽粪便污染的基因检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： a) 从水域中提取待测水样 DNA ； b) 用荧光定量 PCR 扩增样品 DNA ； 其中， 引物核苷酸序列为 ： 正向引物 Av-BacF: 5 - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3 反向引物 Av-BacR: 5 -CGCCCATTGACCAATA-3 探针序列为 ：。
12、 FAM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA ； c) 将上述扩增产物核苷酸序列与下述核苷酸序列进行比对 ： Av-Bac ： 5 -CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GAAGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3 若二者核苷酸序列相同， 且该序列平均浓度为每毫升样品中含2.50.3 log10拷贝， 则 该水域判断为受禽粪便污染的水域。 0007 进一步地， 步骤 b 中， 荧光定量 PCR 反应的引物浓度为 。
13、300 nmol， 探针浓度为 200 nmol。 0008 步骤 b 中， 荧光定量 PCR 反应程序为 ： 95 C， 10 min ； 95 C 15 sec, 58 C 1 min， 45 个循环， 在每个循环退火、 延伸阶段收集荧光信号。 0009 本发明还提供了一种用于上述基因检测方法的引物， 其特征在于， 该引物 序 列 为 ： 正 向 引 物 Av-BacF: 5 - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3 ； 反 向 引 物 Av-BacR: 5 -CGCCCATTGACCAATA-3 。 0010 本发明中的基因标记 Av-Bac 是通过系统进化分析得到， 具体方法如。
14、下 ： （一） 拟杆菌属 （Bacteroidales） 16S rRNA 基因序列系统进化分析 采集我国东海近岸部分海域周围主要养殖禽类和海鸟粪便样品， 并提取粪样 DNA ； 利 用 引 物 Bac32F/Bac708R 选 择 性 扩 增Bacteroidales 16S rRNA 基 因，获 得 禽 源 Bacteroidales 16S rRNA 基因文库 ； 将 23 个代表性序列与 GenBank 中 16S rRNA 序列同源 性比对， 构建系统进化树 （图 1） ， 并获得 1 个禽类特异性序列聚类簇 Cluster A。 0011 （二） 特异性指示禽粪便污染基因标记 （A。
15、v-Bac） 的引物与序列特征 根据上述 Cluster A 中的序列比对， 设计用于荧光定量 PCR 检测的引物和探针， Av-BacF: 5 - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3 Av-BacR: 5 -CGCCCATTGACCAATA-3 Av-BacProbe: FAM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA 上述引物扩增片段长度为 103 bp， 即为特异性指示禽粪便污染基因标记 Av-Bac， 其核 苷酸序列为 ： 5 -CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GAAGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA。
16、 AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3 （三） 应用 Av-Bac 荧光定量 PCR 检测样品的特异性评价 将 Av-Bac 标记用于荧光定量 PCR 检测 58 个已知来源的粪样 （包括猪、 牛、 羊、 狗、 说 明 书 CN 102260744 A CN 102260748 A3/5 页 5 鸡、 鸭、 鹅、 海鸟来源） ， real-time PCR 反应时 Av-BacF/ Av-BacR 最佳浓度为 300 nmol， Av-BacProbe 最佳浓度为 200 nmol。最佳反应程序为 ： 95 C， 10 m。
17、in ； 95 C 15 sec, 58 C 1 min， 45 个循环， 在每个循环退火、 延伸阶段收集荧光信号。结果显示， 禽类样品 中均能特异性扩增 103 bp 大小的条带， Av-Bac 标记的平均浓度为每克粪样中含 6.80.4 log10拷贝 ； 而在其他动物粪便中无特异性条带。利用此基因标记进行水体的禽源粪便污染 溯源可保证 100% 的准确率。 0012 本发明具有以下优点 ： （1） 将基因标记 Av-Bac 用于水体中禽源粪便污染 （非点源污染） 的溯源， 具有显著的宿 主特异性， 正确判别率可达 100%。 0013 （2） 用基因标记 Av-Bac 可定量检测禽粪便污。
18、染情况， 从而能正确评估其污染贡献 率。 0014 （3） 采用 Av-Bac 基因标记检测水体的粪便污染属于微生物源示踪 （MST） 方法中的 非依赖数据库型 （LIMs） ， 无需菌株的分离培养及特征数据库的建立， 操作简单、 省时省力， 且不受地域限制。 附图说明 0015 图 1 是基于禽源拟杆菌属 16 S rRNA 基因构建的系统发育树 （鸡源 ： FcB， 鸭源 ： FdB， 鹅源 ： FgB， 海鸟源 ： SgB） 。 0016 图 2 是禽源 Av-Bac 标记的 real-time PCR 扩增曲线。 0017 图 3 是 Real-time PCR 检测部分已知来源的粪样。
19、 Av-Bac 基因标记的电泳图。其 中， 泳道 1、 4 和 8 为鸡源， 泳道 9 和 10 为鸭源， 泳道 14 为鹅源， 泳道 17 为海鸟源） 。 具体实施方式 0018 1样品采集及 DNA 提取 采集我国东海近岸部分海域 （宁波、 舟山、 象山港、 杭州湾） 周围主要养殖禽类 （鸡、 鸭、 鹅） 和海鸟粪便样品， 每种禽粪 30 份。取无菌采便棒插入新鲜粪便中， 确保采便棒两侧小孔 滞纳一定量粪便， 将采便棒放入无菌试管内并做好记录， 用冰盒带回实验室并在 24 h 内进 行处理。样品命名为 ： 鸡源 FcB1-30， 鸭源 FdB1-30， 鹅源 FgB1-30， 海鸟源 Sg。
20、B1-30。每个样 品取 250 mg（湿重） 采用 FastDNA spin kit for soil（MP Biomedical） 试剂盒提取 DNA。 0019 2 禽源Bacteroidales 16S rRNA 基因文库构建 利用引物 Bac32F: 5-AACGCTAGCTACAGGCTT-3/Bac708R: 5-CAA TCGGAGTTCTTCGTG-3 从提取的 DNA 样品中选择性扩增Bacteroidales 16S rRNA 基因。PCR 反应条件为 ： 94 C 5 min， 94 C 30 sec， 61 C 30 sec， 72 C 30 sec， 30个循环 ；。
21、 72 C 延伸 7 min。PCR 产物经 QiaQuick gel purification（Qiagen） 试剂盒纯化后， 克 隆至 pCR2.1 载体， 转化大肠杆菌 TOP10F 。蓝白斑筛选获得 69 个阳性克隆， 挑阳性菌落于 37 C、 130 rpm 下振荡培养 24 h 后离心收集， 保存于 20 C 待测序。 0020 3 Bacteroidales 16S rRNA 序列进化分析 序列测定由上海英俊 （Invitrogen） 生物技术有限公司测序部完成。用 Sequencher v. 4. 8 软件编辑原始 16S rRNA 基因克隆序列， 然后利用 DOTUR 软件分。
22、析克隆序列。具有 2% 说 明 书 CN 102260744 A CN 102260748 A4/5 页 6 的序列差别者定义为分类操作单元 （即 Operational taxonomic unit， 简称 OUT） 。在选取 OTU 的同时， 对文库进行饱和曲线分析。每个 OTU 中选取 1 个克隆序列 （如果该 OTU 含有 的克隆序列多于 1 个 ) 做为代表序列， 共获 23 个代表性序列。将其与 NCBI 网络数据库中 的同源序列进行比对。根据比对结果， 选取相似度最高的同源序列作为参照序列。将选取 的同源参照序列和本研究所得 OTU 代表序列结合在一起。然后通过 Bioedit 。
23、软件包中的 ClustalW将序列对齐， 并将对齐后的序列文件转为MEGA 4.0软件的文件输入格式。 最后用 MEGA 4.0 软件做系统进化分析。构建系统进化树时， 迭代运算 1000 次。 0021 系统进化分析显示有 1 个禽类特异性序列聚类簇 Cluster A（图 1） 。该聚类簇包 含了本研究获得的 11 个 OTU 序列， 其中 FdB22、 FgB24 和 SgB15 与 GenBank 中已知的鸡特异 性标记同源性达 95% 以上 ； FcB18、 SgB10 和 FdB23 与已知的鹅特异性标记同源性达 99% 以 上 ； FdB7和FdB13与已知的鸭特异性标记同源性达。
24、93%以上 ； SgB21与已知的海鸟特异性标 记同源性达 99%。因此， 根据 Cluster A 设计禽类相关特异性基因标记。 0022 4特异性指示禽粪便污染基因标记 （Av-Bac） 的获得 将 Cluster A 中的Bacteroidales 16S rRNA 部分序列 （OTU） 进行比对， 以同源的 片段设计 PCR 扩增的引物和探针。 0023 用于 real-time PCR 检测的引物和探针， 核苷酸序列为 ： Av-BacF: 5 - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3 Av-BacR: 5 -CGCCCATTGACCAATA-3 Av-BacProbe: F。
25、AM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA。 0024 上述引物扩增片段长度为 103 bp， 即为特异性指示禽粪便污染基因标记 Av-Bac， 其核苷酸序列为 ： 5 -CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GAAGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3 。 0025 实施例 1 ： 已知来源粪样 real-time PCR 检测 Av-Bac 标记的特异性 将 Av-Bac 标记用于荧光定量 PCR 检测 58 个。
26、已知来源的粪样 （包括猪、 牛、 羊、 狗、 鸡、 鸭、 鹅、 海鸟来源） ， real-time PCR 反应时 Av-BacF/ Av-BacR 最佳浓度为 300 nmol， Av-BacProbe 最佳浓度为 200 nmol。最佳反应程序为 ： 95 C， 10 min ； 95 C 15 sec, 58 C 1 min， 45 个循环， 在每个循环退火、 延伸阶段收集荧光信号。结果显示， 禽类样品 中均能特异性扩增 103 bp 大小的条带， Av-Bac 标记的平均浓度为每克粪样中含 6.80.4 log10拷贝 ； 而在其他动物粪便中无特异性条带 （图 3） 。利用此基因标记进。
27、行水体的禽源粪 便污染溯源可保证 100% 的准确率。 0026 实施例 2 ： Av-Bac 标记溯源检测水环境中粪便污染的来源 于东海近岸部分海域 （宁波、 舟山、 象山港、 杭州湾） 采集水样共 141 份， 采用 FastDNA spin kit for soil （MP Biomedical） 试剂盒提取样品 DNA。用荧光定量 PCR 扩增样品 DNA ； 其中， 引物核苷酸序列为 ： 正向引物 Av-BacF: 5 - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3 ； 反向引物 Av-BacR: 5 -CGCCCATTGACCAATA-3 ； 探针序列为 ： FAM-GAACTG。
28、AGACACGGTCC-TAMRA。 0027 将上述扩增产物核苷酸序列与 Av-Bac 标记核苷酸序列进行比对 ： Av-Bac ： 5 -CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GAAGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3 。 说 明 书 CN 102260744 A CN 102260748 A5/5 页 7 0028 结果显示， 共有27份样品中可特异性检测到103 bp大小的条带， 说明禽类粪便污 染水样的检出率为 1。
29、9.1%， 即东海近岸部分海域存在禽粪便污染。Av-Bac 标记的平均浓度 为每毫升水样中含 2.50.3 log10拷贝。 说 明 书 CN 102260744 A CN 102260748 A1/2 页 8 序列表 浙江工商大学 一种特异性指示禽粪便污染的基因检测方法 4 PatentIn version 3.3 1 104 DNA Bacteroidales 1 cttcgatgga taggggttct gagaggaagg tcccccacat tggaactgag acacggtcca 60 aactcctacg ggaggcagca gtgaggaata ttggtcaatg ggcg 104 2 20 DNA 人工序列 2 cttcgatgga taggggttct 20 3 16 DNA 人工序列 3 cgcccattga ccaata 16 序 列 表 CN 102260744 A CN 102260748 A2/2 页 9 4 17 DNA 人工序列 4 gaactgagac acggtcc 17 序 列 表 CN 102260744 A CN 102260748 A1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102260744 A CN 102260748 A2/2 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 102260744 A 。