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1、(10)申请公布号 CN 102262134 A (43)申请公布日 2011.11.30 CN 102262134 A *CN102262134A* (21)申请号 201110163340.2 (22)申请日 2011.06.17 G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (71)申请人 中国计量科学研究院 地址 100013 北京市朝阳区北三环东路 18 号 (72)发明人 武利庆 毕佳明 宋德伟 王晶 杨彬 (74)专利代理机构 北京双收知识产权代理有限 公司 11241 代理人 卢新 左明坤 (54) 发明名称 CryIAb 蛋白标准物质定值的方。
2、法 (57) 摘要 本发明提供一种 CryIAb 蛋白标准物质定值 的方法， BT 晶体蛋白具有高特异的杀虫活性， 是 近年来应用最为广泛的生物杀虫剂。在实际检 测工作中， 经常需要对待检测转基因作物进行 CryIAb 蛋白定性和定量检测， 但是对于其标准物 质定值是否准确的研究现在还很少。本发明所 解决的技术问题是填补上述技术空白， 提供一种 CryIAb 蛋白标准物质定值的方法， 具有良好的准 确性、 可靠性和溯源性。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 CN 102262147 A1/1 页 2 1. 一。
3、种 CryIAb 蛋白标准物质定值的方法， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： (1) 合成三条特异性肽段 ： LIGNYTDHAVR、 TLSSTLR、 IVAQLGQGVYR 用于进行 CryIAb 蛋白 定量 ； (2) 同时使用全氘标记的亮氨基合成对应的三条同位素标记肽段 ； (3) 以亮氨酸、 异亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸和 / 或苯丙氨酸标准物质为标准， 以同位素标 记亮氨酸、 异亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸和 / 或苯丙氨酸为内标， 采用同位素稀释质谱法对合 成的三条标准肽段进行准确定量 ； (4)按400L溶液中所含CryIAb蛋白质量， 根据三条肽段的纯度计算酶切后所得三条 目标。
4、肽段的质量， 配制相应浓度标准肽段及同位素内标肽段 ； (5) 准确称量 400L CryIAb 蛋白溶液， 加入并称量相应体积的同位素内标溶液 ； 使酶 切后所得目标肽段与内标肽段摩尔比为 1 1 ； (6) 离心干燥上述已加入内标的蛋白溶液， 加入 100L 的 8M 尿素溶液对蛋白进行变 性处理 ； 10min 后加入 2L 1M 的二硫苏糖醇溶液在 60 摄氏度水浴中加热 60min ； 然后加 入 2L 1M 的碘乙酰胺， 在暗处反应 40min ； 加入 6L 1M 的二硫苏糖醇还原多余的碘乙酰 胺 ； 用 100mM 的碳酸氢胺溶液稀释尿素至 1M 以下， 加入 2L 0.5mg。
5、/mL 的胰蛋白酶溶液进 行酶切 ； 酶切 96 小时后采用同位素稀释质谱法对三条肽段进行准确定量 ； (7) 根据质谱所得酶切后肽段与同位素肽段的比例配制标准肽段与内标肽段比例的标 准曲线 ； 计算溶液中肽段含量， 根据蛋白的分子量计算每400L溶液中CryIAb蛋白的浓度 作为标准物质的定值结果。 权 利 要 求 书 CN 102262134 A CN 102262147 A1/3 页 3 CryIAb 蛋白标准物质定值的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种标准物质的定值方法， 尤其是涉及一种杀虫晶体蛋白 CryIAb 标 准物质定值的方法。 背景技术 0002 对通过均匀性、 稳定性。
6、检验合格样料的特性值进行测量， 在标准物质技术领域称 为表征化(原文为characterize， 即对材料特性进行测量) ； 由计量权威部门对表征化获得 的样料特性的量值进行计量学溯源性(以下简称溯源性)确认和相应测量不确定度评定合 理性确认， 在标准物质技术领域称为定值 ( 原文为 certify， 即对测量获得的结果进行认证 确认， 在其它技术领域一般称为认证 )。因此， 对有证标准物质的定值， 实际上应分为两步 ： 首先是对经过均匀性、 稳定性检验合格的样料特性值进行测量， 也就是表征化 ； 然后是对测 量结果的溯源性和测量不确定度评定的合理性进行有效性确认。 0003 苏云金芽胞杆菌 。
7、(Bacillus thuringiensis， 简称 Bt) 是一种革兰氏阳性菌， 广泛 存在于土壤、 尘埃、 水域、 沙漠、 植物、 昆虫尸体中 ( 贾士荣等， 2001)。1901 年， 日本学者石 渡从染病的家蚕体液中首次分离出 Bt 菌， 并证明部分 Bt 对鳞翅目昆虫有杀虫活性。1915 年， Berliner 注意到 Bt 在芽胞形成过程中， 其一端出现小的包含物， 但不知杀虫活性与此 有关。二十世纪 50 年代， 人们才发现 Bt 菌的杀虫活性与伴胞晶体有关 (Hannay， 1953)， 并证实这种伴胞晶体由蛋白质组成 (Hannay and Fitz-James， 1955。
8、)。这种蛋白通常被称 作 - 内毒素 (-endotoxins) 或杀虫晶体蛋白 (insecticidal crystal protein， ICP)。 1989 年 Hofte 和 Whiteley 根据晶体蛋白的氨基酸序列和杀虫谱的不同， 将已经发表的 42 种晶体蛋白分为 5 群 14 亚类。其中具有溶血溶细胞作用的 27kDa 晶体蛋白基因被命名为 Cyt 基因， 其他只有杀虫活性的 13 亚类命名为狭义的晶体蛋白基因， 即 Cry 基因。Cry 基因 可划分四群， 即 CryI 为鳞翅目特异性， CryII 为鳞翅目和双翅目特异性， CryIII 为鞘翅目 特异性， CryIV 双。
9、翅目特异性。CryI 是研究的最多的一类 Bt 杀虫晶体蛋白， 目前常见的转 Bt 基因是 CryIA(b)、 (c)， Cry9c。BT 晶体蛋白具有高特异的杀虫活性， 是近年来应用最为 广泛的生物杀虫剂。在实际检测工作中， 经常需要对待检测转基因作物进行 CryIAb 蛋白定 性和定量检测， 但是对于其标准物质定值是否准确的研究现在还很少。 发明内容 0004 本发明所解决的技术问题是填补上述技术空白， 提供一种 CryIAb 蛋白标准物质 定值的方法， 具有良好的准确性、 可靠性和溯源性。 0005 上述定值方法， 包括以下步骤 ： 0006 (1) 合成三条特异性肽段 ： LIGNYT。
10、DHAVR、 TLSSTLR、 IVAQLGQGVYR 用于进行 CryIAb 蛋白定量 ； 0007 (2) 同时使用全氘标记的亮氨基合成对应的三条同位素标记肽段 ； 0008 (3) 以亮氨酸、 异亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸和 / 或苯丙氨酸标准物质为标准， 以同位 说 明 书 CN 102262134 A CN 102262147 A2/3 页 4 素标记亮氨酸、 异亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸和 / 或苯丙氨酸为内标， 采用同位素稀释质谱法 对合成的三条标准肽段进行准确定量 ； 0009 (4)按400L溶液中所含CryIAb蛋白质量， 根据三条肽段的纯度计算酶切后所得 三条目标肽段的质。
11、量， 配制相应浓度标准肽段及同位素内标肽段 ； 0010 (5) 准确称量 400L CryIAb 蛋白溶液， 加入并称量相应体积的同位素内标溶液 ； 使酶切后所得目标肽段与内标肽段摩尔比为 1 1 ； 0011 (6)离心干燥上述已加入内标的蛋白溶液， 加入100L的8M尿素溶液对蛋白进行 变性处理 ； 10min 后加入 2L 1M 的二硫苏糖醇 (DTT) 溶液在 60 摄氏度水浴中加热 60min ； 然后加入 2L 1M 的碘乙酰胺 (IAA)， 在暗处反应 40min ； 加入 6L 1M 的二硫苏糖醇还原 多余的碘乙酰胺 ； 用100mM的碳酸氢胺溶液稀释尿素至1M以下， 加入2。
12、L0.5mg/mL的胰蛋 白酶 (Trypsin) 溶液进行酶切， 每 24 小时补充 2L 的 Trypsin ； 酶切 96 小时后采用同位 素稀释质谱法对三条肽段进行准确定量 ； 0012 (7) 根据质谱所得酶切后肽段与同位素肽段的比例配制标准肽段与内标肽段比例 的标准曲线 ； 计算溶液中肽段含量， 根据蛋白的分子量计算每400L溶液中CryIAb蛋白的 浓度作为标准物质的定值结果。 0013 其中本发明中使用的 CryIAb 标准物质制备过程 ： 0014 (1) 配制浓度为 0.1的氨水溶液， 用于溶解经过纯化的 CryIAb。 0015 (2) 配制浓度为 50g/g CryIA。
13、b 溶液。 0016 (3)将CryIAb溶液分装至500L冻存管中， 每只冻存管中分装400L溶液， 分装 好的标准物质在 -80 摄氏度冰箱中冷冻保存。 0017 采用上述技术方案， 本发明可以达到的技术效果是 ： 0018 (1) 采用氨水溶解制备 CryIAb 标准物质， 提高了 CryIAb 溶解度， 保证了标准物质 的均匀性 ； 0019 (2) 采用同位素稀释质谱基准方法对标准肽段和 CryIAb 蛋白质含量进行测定， 保 证了定值结果的准确 ； 0020 (3) 在采用同位素稀释质谱法对标准肽段定量时同时选用多个氨基酸定量结果的 平均值 ； 在采用同位素稀释质谱法对 CryIA。
14、b 定量时同时选用三条酶切肽段定量结果的平 均值， 提高了定值结果的可靠性。 0021 (4) 标准物质定值结果可最终溯源到 SI 单位。 具体实施方式 0022 为进一步说明本发明， 结合以下实施例具体说明 ： 0023 实施例 1 ： 0024 ( 一 )CryIAb 标准物质制备过程 ： 0025 (1) 配制浓度为 0.1的氨水溶液， 用于溶解经过纯化的 CryIAb。 0026 (2) 配制浓度为 50g/g CryIAb 溶液。 0027 (3)将CryIAb溶液分装至500L冻存管中， 每只冻存管中分装400L溶液， 分装 好的标准物质在 -80 摄氏度冰箱中冷冻保存。 0028。
15、 ( 二 ) 标准物质定值 ： 说 明 书 CN 102262134 A CN 102262147 A3/3 页 5 0029 (1) 选择检测 LIGNYTDHAVR， TLSSTLR， IVAQLGQGVYR 三条特异性肽段进行 CryIAb 蛋白定量。 0030 (2) 合成上述三条肽段， 同时使用全氘标记的亮氨基合成对应的三条同位素标记 肽段。 0031 (3) 以国家亮氨酸、 异亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸和 / 或苯丙氨酸标准物质为标准， 以 同位素标记亮氨酸、 异亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸和 / 或苯丙氨酸为内标， 采用同位素稀释质 谱法对合成的三条标准肽段进行准确定量。 0032。
16、 (4)按400L溶液中所含CryIAb蛋白质量， 根据三条肽段的纯度计算酶切后所得 三条目标肽段的质量， 配制相应浓度标准肽段及同位素内标肽段。 0033 (5) 准确称量 400L 蛋白溶液， 加入并称量相应体积的同位素内标溶液。使酶切 后所得目标肽段与内标肽段摩尔比尽量为 1 1。 0034 (6)离心干燥加入内标的蛋白溶液， 加入100L的8M尿素溶液对蛋白进行变性处 理。10min 后加入 2L 1M 的二硫苏糖醇 (DTT) 溶液在 60 摄氏度水浴中加热 60min。然后 加入 2L 1M 的碘乙酰胺 (IAA)， 在暗处反应 40min。加入 6L 1M 的 DTT 还原多余的。
17、 IAA。 用 100mM 的碳酸氢胺溶液稀释尿素至 1M 以下， 加入 2L 0.5mg/mL 的 Trypsin 溶液进行酶 切， 每 24 小时补充 2L 的 Trypsin。酶切 96 小时后采用同位素稀释质谱法对三条肽段进 行准确定量。 0035 (7) 根据质谱所得酶切后肽段与同位素肽段的比例配制标准肽段与内标肽段比例 的标准曲线。计算溶液中肽段含量， 根据蛋白的分子量计算每 400L 溶液中 CryIAb 蛋白 的浓度作为标准物质的定值结果， 每批标准物质的定值结果不一样， 本实施例的定值结果 为 48.9g/g， 本发明采用的同位素稀释质谱法经过国际比对的验证， 方法达到国际等。
18、效。 0036 ( 三 ) 实施例中使用的仪器 0037 (1) 分析天平 0038 (Sartorius BS323S 型， 最大称量为 320g， 精度为 0.001g， 德国 ) 0039 (Sartorius ME235S 型， 最大称量为 230g， 精度为 0.01mg， 德国 ) 0040 (METTLER TOLEDO XP26 型， 最大称量为 22g， 精度为 0.001mg， 瑞士 ) 0041 (METTLER TOLEDO UMX2 型， 最大称量为 2.1g， 精度为 0.1g， 瑞士 ) 0042 (2)超低温冰箱(Deep Freezer VXE570型， Th。
19、ermo Electron Corporation， 法国) 0043 (3) 恒温摇床 (S16R-2 型， SHEL LAB， 美国 ) 0044 (4) 冷冻干燥器 ( 日立， 日本 ) 0045 (5) 烘箱 (UFE500 型， MEMMERT， 美国 ) 0046 (6) 液相色谱 - 质谱联用仪 (Agilent 6410Triple Quard LC/MS， Agilent， 美国 ) 0047 (7) 超纯水系统 (Milli-Q 型， MILLIPORE， 美国 ) 0048 (8)pH 计 (3STAR 型， Thermo Electron Corporation， 法国 ) 0049 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述， 并非对本发明的范 围进行限定， 在不脱离本发明设计精神的前提下， 本领域普通工程技术人员对本发明的技 术方案作出的各种变形和改进， 均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。 说 明 书 CN 102262134 A 。