结核分枝杆菌的抗原蛋白及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102260328 A (43)申请公布日 2011.11.30 CN 102260328 A *CN102260328A* (21)申请号 201010231572.2 (22)申请日 2010.07.15 C07K 14/35(2006.01) C12N 15/31(2006.01) G01N 33/569(2006.01) (71)申请人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人 何正国 李雨庆 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 (54) 发明名称 结核分枝杆菌的抗原蛋白及应用 (5。

2、7) 摘要 本发明属于基因工程技术领域， 与传染病分 子诊断技术领域有关。本发明具体涉及三种结核 分枝杆菌抗原蛋白的制备及其在制备结核病诊断 检测试剂盒中的应用。所述的结核分枝杆菌抗 原蛋白， 它们的核苷酸序列分别如序列表 SEQ ID NO ： 1， 3， 5 所示， 它们编码的蛋白质的氨基酸序列 分别如序列表 SEQ ID NO ： 2， 4， 6 所示。生物学试 验表明本发明制备的三种结核分枝杆菌抗原蛋白 能够在制备结核病诊断检测试剂盒中应用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 14 页 序列表 8 页 附图 。

3、4 页 CN 102260332 A1/1 页 2 1. 结核分枝杆菌抗原蛋白， 它的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1， SEQ ID NO ： 3 和 SEQID NO ： 5 所示。 2. 权利要求 1 所述的抗原蛋白， 它编码的氨基酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 2， SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 6 所示。 3. 权利要求 1 或 2 所述的抗原蛋白在制备结核病诊断检测试剂盒中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102260328 A CN 102260332 A1/14 页 3 结核分枝杆菌的抗原蛋白及应用 技术领域 0001 本发明属。

4、于基因工程技术领域， 也涉及到传染病分子诊断技术领域， 具体涉及 3 种结核分枝杆菌抗原蛋白及在制备结核病诊断检测试剂盒中的应用。 背景技术 0002 动物细菌性传染病对人类健康的威胁日益严重， 给国民经济和社会稳定造成冲击 和影响。结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis， 结核病的主要致病菌 ) 是一种严 重危害人类健康的病原菌， 全世界有三分之一人口携带处于潜伏状态的结核分枝杆菌， 每 年大约有两百万人死于结核病 (Raviglione M C.TheTB epidemic from 1992 to 2002. Tuberculosis(Edinb)， 200。

5、3， 83 ： 4-14.)。近年来， 结核分枝杆菌合并人类免疫缺陷病毒 (HIV) 感染及多重耐药结核菌株的出现， 对人类公共卫生事业的威胁更加严峻。因此， 开发 结核病及耐药结核病的简单、 快速、 敏感的诊断技术， 成为当前控制结核病的重要策略和手 段。 0003 到目前为止， 临床上结核病的诊断标准主要是在显微镜下直接观察结核分枝杆菌 的痰涂片法。 但是， 痰标本细菌学检查的灵敏度非常低， 临床上主要还根据临床症状和影像 学资料来综合诊断结核病。而另一个诊断标准结核杆菌培养作为结核病诊断的 “金标准” ， 需要耗费大量的时间， 同时还需要有高水平的技术人员操作， 限制了其在临床结核病诊断。

6、 中的应用。 0004 研究人员利用各种新兴的分子生物学以及现代免疫学理论和技术， 已经开发出一 些有希望的检测方法， 比如快速分枝杆菌全自动培养和检测、 噬菌体生物扩增法和噬菌体 生物发光法、 利用 DNA 或者 RNA 的扩增技术、 利用新型免疫学方法等。但是， 这些技术均需 要高成本以及高技术水平的操作人员， 限制了它们在低收入国家的推广的和应用， 而这些 国家的结核病感染率往往都比较高。 0005 鉴于此， 本发明申请人根据前期从结核分枝杆菌基因组序列中筛选得到的三个抗 原蛋白编码基因， 将其在大肠杆菌中克隆表达纯化， 并进一步应用于结核病的体外分子诊 断。本发明建立了一种快速、 低成。

7、本、 易于操作的基于 ELISA 技术的结核病诊断方法， 该方 法与在中国市场上应用较为广泛使用的两种同类试剂盒 TB-DOT( 上海奥普生物医药有限 公司 ) 和 TB-check-1( 法国 VEDA LAB 公司 ) 相比， 敏感性和特异性都得到了显著提高。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷， 通过分子生物学技术和方法， 制备三种 适用于诊断检测结核病的新型结核分枝杆菌抗原蛋白， 将所述的三种新型抗原蛋白应用于 结核病的 ELISA 诊断检测。 0007 本发明是这样实现的 ： 0008 申请人前期从结核分枝杆菌基因组序列中筛选得到三个基因片段， 它们能够强烈 的与。

8、结核病人的血清发生反应。它们的核苷酸序列分别如序列表 SEQ ID NO ： 1， 3， 5 所示， 说 明 书 CN 102260328 A CN 102260332 A2/14 页 4 它们编码的氨基酸序列分别如序列表 SEQ ID NO ： 2， 4， 6 所示。其中从 Rv1987 基因 (NCBI 登录号 NP_216503.1， GeneID ： 885815， 基因注释为可能的几丁质酶 ) 中筛选得到如序列 表 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列， 序列长度为 0.429kb， 从 Rv3807c 基因 (NCBI 登录号 NP_218324.1， GeneID ： 8。

9、86134， 基因注释为可能的保守的跨膜蛋白 ) 中筛选得到如序列 表 SEQ ID NO ： 2 所示的核苷酸序列， 序列长度为 0.498kb， 从 Rv3887c 基因 (NCBI 登录号 NP_218404.1， GeneID ： 886211， 基因注释为可能的保守的跨膜蛋白 ) 中筛选得到如序列表 SEQ ID NO ： 1所示的核苷酸序列， 序列长度为1.53kb。 申请人通过基因克隆方法， 获得含有 这三个抗原蛋白的重组大肠杆菌。然后， 在大肠杆菌中表达纯化这三个结核分枝杆菌抗原 蛋白。 最后， 利用获得的抗原蛋白进行结核病的检测， 并与市售的结核病诊断试剂盒的检测 结果进行比。

10、较。 0009 生物学试验表明， 本发明克隆的上述三个基因编码的抗原蛋白可以作为特异性抗 原蛋白应用于结核病的检测。 0010 在本发明的实施例中， 申请人提供了三种结核分枝杆菌抗原蛋白的详细制备方 法， 并描述了这三个抗原蛋白在结核病诊断中的应用前景。 0011 本发明的优点是， 操作成本低， 并能够快速、 便捷、 准确的检测结核病。 0012 本发明更详细的技术方案参见 具体实施方式 。 附图说明 0013 序列表 SEQ ID NO ： 1 是本发明克隆的 Rv1987 基因片段的核苷酸序列。 0014 序列表 SEQ ID NO ： 2 是本发明克隆的 Rv1987 基因片段编码的蛋白。

11、质的氨基酸序 列。 0015 序列表 SEQ ID NO ： 3 是本发明克隆的 Rv3807c 基因片段的核苷酸序列。 0016 序列表SEQ ID NO ： 4是本发明克隆的Rv3807c基因片段编码的蛋白质的氨基酸序 列。 0017 序列表 SEQ ID NO ： 5 是本发明克隆的 Rv3887c 基因片段的核苷酸序列。 0018 序列表SEQ ID NO ： 6是本发明克隆的Rv3887c基因片段编码的蛋白质的氨基酸序 列。 0019 图 1 ： 本发明的技术流程图。 0020 图 2 ： 本发明使用的抗原基因序列在结核分枝杆菌 H37Rv 菌株基因组中所处的位 置(括号内显示为有下。

12、划线的为所述的抗原序列在NCBI数据库中的编号， 其后的冒号后的 数字为该编号所示序列在结核分枝杆菌 H37Rv 菌株基因组中的位置， 该位置后显示的加粗 斜体字为所述的结核分枝杆菌的菌株号 )。 0021 图 3 ： 是本发明使用的 pET-28a(+) 载体图谱。 0022 图 4 ： 是本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的 PCR 扩增结果。从左到右样 品依次是 ： Marker、 Rv1987、 Rv3807c、 Rv3887c。 0023 图 5 ： 是本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的双酶切验证结果。从左到右 样品依次是 ： Marker、 Rv1987、 Rv3807c、 。

13、Rv3887c。 0024 图 6 ： 是本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白的纯化结果。从左到右样品依次是 ： Marker、 Rv1987、 Rv3807c、 Rv3887c、 Mutiple-antigen( 即 混 合 抗 原 蛋 白 ： 将 Rv1987、 说 明 书 CN 102260328 A CN 102260332 A3/14 页 5 Rv3807c 和 Rv3887c 按浓度比为 1 1 1 的比例混合 )。 0025 图 7 ： 是本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白的 western-blot 结果。从左到右样品依 次是 ： Rv1987、 Rv3807c、 Rv3887c。 0026。

14、 图 8 ： 本 发 明 的 结 核 分 枝 杆 菌 抗 原 蛋 白 与 两 种 商 购 的 试 剂 盒 (TB-DOT 和 TB-check-1) 在 结 核 病 诊 断 中 的 敏 感 性 的 比 较 结 果。 从 左 到 右 样 品 依 次 是 ： Mutiple-antigen、 Rv3807c、 Rv3887c、 Rv1987、 TB-DOT、 TB-check-1。 0027 图 9 ： 本 发 明 的 结 核 分 枝 杆 菌 抗 原 蛋 白 与 两 种 商 购 的 试 剂 盒 (TB-DOT 和 TB-check-1) 在 结 核 病 诊 断 中 的 特 异 性 的 比 较 结 。

15、果。 从 左 到 右 样 品 依 次 是 ： Mutiple-antigen、 Rv3807c、 Rv1987、 Rv3887c、 TB-check-1、 TB-DOT。 0028 图 10 ： 本 发 明 的 结 核 分 枝 杆 菌 抗 原 蛋 白 与 两 种 商 购 的 试 剂 盒 (TB-DOT 和 TB-check-1) 在 结 核 病 诊 断 中 的 准 确 性 的 比 较 结 果。 从 左 到 右 样 品 依 次 是 ： Mutiple-antigen、 Rv3807c、 Rv3887c、 Rv1987、 TB-DOT、 TB-check-1。 具体实施方式 0029 实施例 1 。

16、： 结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的 PCR 扩增 0030 申请人前期从结核分枝杆菌基因组序列中筛选得到三个基因片段， 它们能够强烈 的与结核病人的血清发生反应。它们的核苷酸序列分别如序列表 SEQ ID NO ： 1， 3， 5 所示， 它们编码的氨基酸序列分别如序列表 SEQ ID NO ： 2， 4， 6 所示。其中从 Rv1987 基因 (NCBI 登录号 NP_216503.1， GeneID ： 885815， 基因注释为可能的几丁质酶 ) 中筛选得到如序列 表 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列， 序列长度为 0.429kb， 从 Rv3807c 基因 (NCBI 登录。

17、号 NP_218324.1， GeneID ： 886134， 基因注释为可能的保守的跨膜蛋白 ) 中筛选得到如序列 表 SEQ ID NO ： 2 所示的核苷酸序列， 序列长度为 0.498kb， 从 Rv3887c 基因 (NCBI 登录号 NP_218404.1， GeneID ： 886211， 基因注释为可能的保守的跨膜蛋白 ) 中筛选得到如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列， 序列长度为 1.53kb。 0031 1、 结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的引物设计方法 ： 根据 NCBI 提供的结核分 枝杆菌 H37Rv( 结核分枝杆菌 H37Rv 菌株的公众获得来源 。

18、： 中国医学细菌保藏管理中心， 菌种编号为 ： 93004。网址 ： http:/www.cmccb.org.cn/) 基因组核酸序列 (NCBI 登录号 ： AL123456.2) 获得结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的核苷酸序列， 根据编码基因内部的酶 切位点， 选择基因内部没有的酶切位点组合 ( 使用 SacI 和 NotI 的酶切位点组合 )， 从编码 基因的前后各取 20bp 设计引物， 具体引物序列如下 ( 下划线所示为酶切位点序列 ) ： 0032 R1987forward ： ATAT GAGCTC ATGGCCGGACTGAACATTTA， 0033 R1987reverse ：。

19、 GAGCG GCGGCCGC CTAGGTGCAAGGATATTGCC ； 0034 R3807cforward ： GATG GAGCTC ATGGTGGCCGTGCAGTCGGC， 0035 R3807creverse ： GAGAG GCGGCCGC TCATCTCTTCCGGGCCCTTT ； 0036 R3887cforward ： TTAT GAGCTC GTGACTGCGCCGCATAAGGT， 0037 R3887creverse ： CGAGC GCGGCCGC TTAGTGGCGAAGCCATGCAA。 0038 对应基因的 PCR 结果参见图 4。PCR 反应体系和反应。

20、条件如表 1 和表 2 ： 0039 表 1PCR 反应体系 说 明 书 CN 102260328 A CN 102260332 A4/14 页 6 0040 0041 表 2PCR 反应条件 0042 0043 PCR 产物回收纯化 ： 0044 采用上海生物工程技术有限公司的 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒回收 DNA 片 段， 按照 UNIQ-10 柱式离心式 DNA 凝胶回收试剂盒的说明书的步骤进行， 具体操作如下 ： 0045 (1) 用 1.0的琼脂糖胶电泳， 使目的 DNA 片段与其它 DNA 分开， 在紫外灯下， 用 在酒精灯火焰上烧过的手术刀片切下含有目的 DNA。

21、 片段的琼脂块， 放入 1.5ml 灭菌离心管 中 ； 0046 (2)按每100mg琼脂糖胶加入400l Binding Buffer， 置55水浴中10分钟， 使 琼脂糖凝胶彻底融化 ( 加热溶胶时， 每 2 分钟混匀一次 ) ； 0047 (3) 将 UNIQ-10 柱放入收集管中， 将融化的胶溶液转移到 UNIQ-10 柱中， 室温静置 2 分钟， 室温 8000 转 / 分钟离心 1 分钟 ； 0048 (4)倒掉收集管中的废液， 向UNIQ-10柱中加入500l Wash Solution， 室温8000 转 / 分钟离心 1 分钟 ； 0049 (5) 重复步骤 4 ； 0050。

22、 (6)取下UNIQ-10柱， 倒掉收集管中的废液， 将UNIQ-10柱放入同一个收集管中， 室 温 12000 转 / 分钟离心 1 分钟 ； 0051 (7) 将 UNIQ-10 柱放入一个灭菌的 1.5ml 离心管中， 在柱子底部的膜中央加 20l ddH2O， 室温放置 2 分钟后， 12000 转 / 分钟离心 1 分钟， 离心管中的液体即为回收的 DNA 片 段， 保存于 -20备用。 0052 实施例 2 ： 构建结核分枝杆菌抗原基因的组氨酸标签融合表达载体 0053 本实施例中使用的通用 LB 培养基和附加的抗生素卡那霉素 ( 见具体步骤所示 ) 配方参见J.萨姆布鲁克， EF。

23、.弗里奇， T.曼尼阿蒂斯著， 黄培堂， 王嘉玺等译， 分子克隆实验 指南 ( 第三版 )， 科学出版社， 2002 年。 说 明 书 CN 102260328 A CN 102260332 A5/14 页 7 0054 (1)将通过实施例1获得的结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因PCR产物和pET28a表 达载体 ( 载体图谱见图 3) 分别经对应限制性内切酶 ( 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ) 消化 ； 0055 (2) 将通过步骤 (1) 获得的酶切产物和载体在 16进行连接过夜 ； 0056 连接反应的体系见表 3 ： 0057 表 3 连接反应的体系 0058 0059 (3)。

24、 连接产物的转化 ： 取 100l DH5 感受态细胞 ( 购自上海超研生物科技有限 公司 ) 加入到 1.5mlEP 管中， 加入通过步骤 (2) 获得的连接产物各 5l 并混匀。置冰上 30 分钟后， 42热激 90 秒， 冰浴 1 分钟。加入 400l LB 培养基， 于 37 200 转 / 分钟振荡培 养 45 分钟。复苏后的大肠杆菌菌液于 4000 转 / 分钟离心 3 分钟， 弃去 400l 上清， 将剩 余的 100l 重悬并涂布于含有 30g/ml 卡那霉素的 LB 琼脂平板， 37倒置培养 16h 至菌 落出现 ； 0060 (4) 分别将得到的转化子接种至 LB 培养基 。

25、37培养过夜 ； 0061 (5) 质粒的提取 ： 将菌液转入 1.5ml 离心管内， 于 4 12000 转 / 分钟离心 1 分钟， 弃上清， 倒立离心管于吸水纸上， 使液体流尽。加入 100l 冰预冷的溶液 I， 用移液器反复 吹吸使菌体充分悬浮， 再加入200l新鲜配制的溶液II， 反复颠倒离心管数次， 冰浴5min， 最后加入 150l 冰预冷的溶液 III， 温和颠倒离心管数次， 冰浴 10min。于 4以 12000 转 / 分钟离心 6 分钟， 吸取上清至另一支 1.5ml 离心管中， 加入 2 倍体积的无水丙醇， 混和均 匀， 室温静置 5min。室温 12000 转 / 分。

26、钟离心 6 分钟， 弃上清， 沉淀用 75乙醇漂洗后， 自 然干燥。沉淀用 20l ddH2O 溶解。即得到结核分枝杆菌抗原基因的组氨酸标签重组表达 载体 ； 0062 (6) 重组质粒的双酶切鉴定 ： 分别利用 SacI 和 NotI 酶切重组表达质粒， 酶切后应 出现预期大小的外源片段和载体片断即为正确的重组质粒。 重组质粒的双酶切结果参见图 5。 0063 实施例 3 ： 结核分枝杆菌抗原蛋白在大肠杆菌中诱导表达 0064 本实施例中使用的通用 LB 培养基和附加的抗生素卡那霉素 ( 见具体步骤所示 ) 配方参见J.萨姆布鲁克， EF.弗里奇， T.曼尼阿蒂斯著， 黄培堂， 王嘉玺等译，。

27、 分子克隆实验 指南 ( 第三版 )， 科学出版社， 2002 年。 0065 (1) 将通过实施例 2 获得的重组质粒分别转化 BL21(DE3) 菌株 ( 购自上海超研生 物科技有限公司 ) ： 取 100l BL21(DE3) 感受态细胞加入到 1.5mlEP 管中， 加入通过实施 例 3 获得的重组质粒各 1l 并混匀。置冰上 30 分钟后， 42热激 90 秒， 冰浴 1 分钟。加 入 400l LB 培养基， 于 37 200 转 / 分钟振荡培养 45 分钟。复苏后的大肠杆菌菌液于 4000 转 / 分钟离心 3 分钟， 弃去 400l 上清， 将剩余的 100l 重悬并涂布于含。

28、有 30g/ 说 明 书 CN 102260328 A CN 102260332 A6/14 页 8 ml 卡那霉素的 LB 琼脂平板， 37倒置培养 16h 至菌落出现 ； 0066 (2) 从步骤 (1) 转化得到的平板上挑取单菌落接入 1ml 含有卡那霉素 (30g/ml) 的 LB 培养基中。于 37摇床培养过夜 ； 0067 (3) 向步骤 (2) 获得的过夜培养物中加入 1ml 含有卡那霉素 (30g/ml) 以及 IPTG( 异丙基 -D- 硫代半乳糖苷， 终浓度 1.0mM) 的 LB 培养基。于 37摇床继续培养 12 个小时 ； 0068 (4) 将通过步骤 (3) 获得的。

29、培养物转移至 1.5ml 离心管中， 12000 转 / 分钟离心 1 分钟收集菌体， 倒去上清， 将菌体于 -20保存。 0069 实施例 4 ： 结核分枝杆菌抗原蛋白的变性纯化 0070 本实施例中使用的缓冲液 B、 C 和 E 配方参见表 4 所示。 0071 表 4 实施例 4 中使用的缓冲液 B、 C 和 E 的组分及其配比 0072 0073 (1) 向在实施例 3 中收集的菌体中加入 1ml 缓冲液 B， 于 37摇床孵育过夜， 使菌 体裂解 ； 0074 (2) 将步骤 (1) 裂解后的菌体于 4， 16000 转 / 分钟离心 1 小时， 将上清取出到 1.5ml 离心管 ；。

30、 0075 (3) 取 20l 镍亲和层析胶珠 ( 购自 GE 公司 ) 到一个 1.5ml 离心管， 加入 1ml 磷 酸缓冲液 (PBS， 配方参见上述 分子克隆技术实验指南 ， 2002 年， 科学出版社， pH7.4)， 轻 柔混匀， 2000 转 / 分钟离心 10 秒， 小心吸出上清， 重复三次 ； 0076 (4)向步骤(3)的胶珠里加入0.5ml 50mM NiSO4， 轻柔混匀， 2000转/分钟离心10 秒， 小心吸出上清 ； 0077 (5) 向步骤 (4) 的胶珠里加入 1ml PBS， 轻柔混匀， 2000 转 / 分钟离心 10 秒， 小心 吸出上清， 重复三次 ；。

31、 0078 (6) 向步骤 (5) 的胶珠里加入 1ml 缓冲液 B， 轻柔混匀， 2000 转 / 分钟离心 10 秒， 小心吸出上清 ； 0079 (7) 将步骤 (2) 获得的上清与步骤 (6) 获得的胶珠在一个 1.5ml 离心管中室温混 匀 1 小时， 2000 转 / 分钟离心 10 秒， 小心吸出上清 ； 0080 (8) 向步骤 (7) 的胶珠里加入 1ml 缓冲液 C， 轻柔混匀， 2000 转 / 分钟离心 10 秒， 小心吸出上清 ； 0081 (9) 向步骤 (8) 的胶珠里加入 50l 缓冲液 E， 轻柔混匀， 2000 转 / 分钟离心 10 秒， 小心吸出上清 ；。

32、 0082 (10) 通过步骤 (9) 获得的上清中即包含结核分枝杆菌抗原蛋白 ； 0083 (11)结核分枝杆菌抗原蛋白浓度的测定 ： 使用Thermo Scientific NANODROP 100 Spectrophotometer 测定蛋白质的浓度， 按照该仪器的使用说明书进行操作。 0084 实施例 5 ： 结核分枝杆菌抗原蛋白的 SDS-PAGE( 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ) 和 说 明 书 CN 102260328 A CN 102260332 A7/14 页 9 western-blot 检测 0085 本实施例中使用的缓冲液配方如下 ： 0086 2SDS上样缓冲液(10ml) 。

33、： 称取0.4g SDS， 加入1ml Tris-Cl(pH6.8)， 2ml 1溴 酚蓝， 4ml 50甘油， 1ml ddH2O， 充分搅拌溶解 ； 0087 1M DTT ： 称取 3.09g DTT 粉末， 加入 20ml 的 0.01M NaOAc(pH5.2)， 溶解后使用 0.22m 滤膜过滤除菌， 分装成小份， -20保存 ； 0088 30丙烯酰胺溶液 ： 称取 290g 丙烯酰胺， 10g N， N - 亚甲基双丙烯酰胺， 加入 600ml ddH2O， 充分搅拌溶解， 用 ddH2O 定容至 1L， 用 0.45m 滤膜过滤， 与棕色瓶中 4保 存 ； 0089 2.0M。

34、 Tris-Cl(pH8.8) ： 称取242.2g Tris-碱， 加入800ml ddH2O， 用浓HCl调节pH 至 8.8， 用 ddH2O 定容至 1L ； 0090 1.0M Tris-Cl(pH6.8) ： 称取121.1g Tris-碱， 加入800ml ddH2O， 用浓HCl调节pH 至 6.8， 用 ddH2O 定容至 1L ； 0091 10 SDS ： 称取 10g 十二烷基硫酸钠 (SDS)， 加入 80ml ddH2O， 68加热溶解， 滴加 浓盐酸调节 pH 至 7.2， 用 ddH2O 定容至 100ml ； 0092 10过硫酸铵 ： 称取 1g 过硫酸铵，。

35、 加入 10ml ddH2O 充分搅拌溶解， 贮存与 4 ； 0093 5Tris- 甘氨酸电泳缓冲液 ： 称取 15.1g Tris- 碱， 94g 甘氨酸， 5g SDS， 用 ddH2O 定容至 1L ； 0094 染色液 ： 称取1g考马斯亮蓝R-250， 依次加入250ml异丙醇， 100ml冰醋酸和650ml ddH2O ； 0095 脱色液 ： 100ml 醋酸， 50ml 乙醇， 850ml ddH2O ； 0096 转移缓冲液 ： 39mM甘氨酸， 48mM Tris-碱， 0.037SDS(电泳级)， 20甲醇。 (2.9g 甘氨酸， 5.8gTris- 碱， 0.37g 。

36、SDS， 200mL 甲醇， 用 ddH2O 定容到 1L) ； 0097 TBS 缓冲液 ： 称取 8.8g NaCl， 加入 20ml 1M Tris-Cl(pH8.0)， 用 ddH2O 定容至 1L ； 0098 TBST 缓冲液 ： 在 TBS 中加入终浓度为 0.05 Tween-20 ； 0099 DAB 显色液 ( 购自武汉意德生物技术有限公司 ) ： 向 1ml ddH2O 中分别滴加 A 液、 B 液、 C 液各一滴， 混合均匀。 0100 具体实施步骤 ： 0101 (1)SDS-PAGE 电泳样品的制备 ： 取 10l 通过实施例 4 得到的结核分枝杆菌抗原 蛋白， 加。

37、入 2SDS 上样缓冲液 8l， 1M DTT 2l， 混匀后于 100 10min， 12000 转 / 分钟 离心 1 分钟 ； 0102 (2)SDS 聚丙烯酰胺凝胶的配制及电泳 ： 0103 13.5的分离胶配制体系见表 5 ： 0104 表 5 实施例 5 中分离胶的组分及其配比 说 明 书 CN 102260328 A CN 102260332 A8/14 页 10 0105 0106 将各成分加入后迅速混合， 加入制胶板中， 表面覆盖一层异丙醇。室温放置凝固 后， 倒去异丙醇， 用 ddH2O 冲洗反复冲洗， 吸水纸吸干。 0107 浓缩胶的配置体系见表 6 ： 0108 表 6。

38、 实施例 5 中浓缩胶的组分及其配比 0109 0110 0111 将各成分加入后迅速混合， 加入分离胶的上面， 灌满后插入加样梳。 待浓缩胶凝固 后， 取下梳子 ； 0112 将凝胶固定于电泳装置上， 加入足够量的 Tris- 甘氨酸电泳缓冲液， 在加样孔中 分别加入各样品 ； 0113 电压80V， 电泳15分钟， 至溴酚蓝进入分离胶 ； 电压120V， 至溴酚蓝泳出胶底面， 终 止电泳。 0114 (3) 聚丙烯酰胺凝胶染色与脱色 ( 如果进行 western-blot 则跳过此步骤 ) ： 卸下 凝胶， 用考马斯亮蓝 R-250 染色液染色 30 分钟， 再用脱色液进行脱色， 观察结果。

39、。 0115 (4) 结核分枝杆菌抗原蛋白的 western-blot 检测 ： 转膜 ： 切出 6 张滤纸和 1 张硝 酸纤维膜 (NC 膜 )， 滤纸和膜的大小要和步骤 (2) 的凝胶大小相同 ； 将硝酸纤维膜在转移缓 冲液中浸泡 5 分钟 ； 在另一浅托盘中加入少量转移缓冲液， 将 6 张滤纸浸泡于其中 ； 在电极 的负极面上， 依次放3层滤纸、 聚丙烯酰胺凝胶、 硝酸纤维膜和3层滤纸 ； 彻底排除各层间的 气泡 ； 将电极的负极面盖到膜胶复合体上 ； 将电转移槽放于冰浴中， 连接电源， 恒流 250mA， 转移 2 小时 ； 0116 (5) 封闭 ： 将 NC 膜置于 5的脱脂奶粉中。

40、， 室温封闭 1 小时 ； 0117 (6) 洗膜 ： 弃封闭液， 用 1TBST 洗 NC 膜 3 次， 每次 5 分钟 ； 0118 (7) 一抗孵育 ： 将 NC 膜放入用 1TBST 稀释的兔抗 His-tag 抗体 ( 稀释体积比 1 5000)( 购自武汉飞羿科技有限公司 )， 室温孵育 1 小时 ； 0119 (8) 洗膜 ： 取出 NC 膜， 用 1TBST 洗膜 3 次， 每次 5 分钟 ； 说 明 书 CN 102260328 A CN 102260332 A9/14 页 11 0120 (9) 二抗孵育 ： 将 NC 膜转入用 1TBST 稀释的辣根过氧化物标记的羊抗兔 。

41、IgG 抗 体 ( 稀释体积比为 1 5000)( 购自武汉意德生物技术有限公司 )， 室温孵育 1 小时 ； 0121 (10) 洗膜 ： 取出 NC 膜， 用 1TBST 洗膜 3 次， 每次 5 分钟 ； 0122 (11) 洗膜 ： 取出 NC 膜， 用 1TBS 洗膜 3 次， 每次 5 分钟 ； 0123 (12) 显色 ： 将 NC 膜置于新配置的 DAB 显色液中， 待蛋白条带显色后， 用水冲洗以 终止反应。 0124 结核分枝杆菌抗原蛋白的 SDS-PAGE( 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ) 结果见图 6。 0125 结核分枝杆菌抗原蛋白的 western-blot 检测结果见图 7。

42、。 0126 实施例 6 ： 结核分枝杆菌抗原蛋白在结核病诊断中的应用 ( 间接法 ELISA) 0127 本实施例中使用的缓冲液配方如下 ： 0128 包被液 ： 0.05M、 pH9.6 的碳酸盐缓冲液 (Na2CO3： 1.59g ； NaHCO3： 2.93g ； 用蒸馏水 定容到 1L) ； 0129 洗涤液 ： 含 0.05吐温 -20 的 PBS 溶液 (PBS 配方参见 J. 萨姆布鲁克， EF. 弗里 奇， T.曼尼阿蒂斯著， 黄培堂， 王嘉玺等译， 分子克隆实验指南(第三版)， 科学出版社， 2002 年 ) ； 0130 封闭液 ： 含 5脱脂牛奶的洗涤液 ； 0131 。

43、终止液 ： 2M H2SO4； 0132 具体实施步骤 ： 0133 (1) 包被 ： 用包被液将通过实施例 5 纯化得到的结核分枝杆菌抗原蛋白稀释至 500ng/ml， 用微量移液器吸取稀释好的样品加入 ELISA 板内， 每孔 100l， 4过夜 ； 0134 (2) 洗涤 ： 次日从 4取出步骤 (1) 的 ELISA 板， 甩干内容物， 向孔内加入洗涤液， 每孔200l， 静置3分钟， 甩干， 再加洗涤液， 如此泡洗三次， 最后一次甩干后， 将ELISA板朝 下放在滤纸上反复拍打干净 ； 0135 (3) 封闭 ： 向步骤 (2) 的 ELISA 板中加入封闭液， 每孔 200l， 3。

44、7温育 30 分钟 ； 0136 (4) 洗涤 ： 同步骤 (2) 的方法 ； 0137 (5) 加入一抗反应 ： 向步骤 (4) 的 ELISA 板中加入人血清 ( 湖北省武汉市医疗救 治中心惠赠， 96 份临床阳性血清， 24 份临床阴性血清 ) 稀释液 ( 其中稀释液的配方参照洗 涤液的配方， 即含 0.05吐温 -20 的 PBS 溶液， 其中 PBS 配方参见 J. 萨姆布鲁克， EF. 弗里 奇， T.曼尼阿蒂斯著， 黄培堂， 王嘉玺等译， 分子克隆实验指南(第三版)， 科学出版社， 2002 年 ) 稀释体积比 1 50)， 每孔 100l， 37温育 30 分钟 ； 0138 。

45、(6) 洗涤 ： 同步骤 (2) 的方法 ； 0139 (7) 加入二抗反应 ： 向步骤 (6) 的 ELISA 板中加入辣根过氧化物标记的山羊抗人 IgG抗体(购自武汉意德生物技术有限公司)稀释液(稀释体积比15000)， 每孔100l， 37温育 30 分钟 ； 0140 (8) 洗涤 ： 同步骤 (2) 的方法 ； 0141 (9) 显色 ： 向步骤 (8) 的 ELISA 板中加入 TMB 底物显色 ( 购自武汉意德生物技术 有限公司 )， 每孔 100l， 37避光 30 分钟 ； 0142 (10)终止反应 ： 向步骤(9)的ELISA板每孔中加入终止液100l， 终止显色反应 ；。

46、 0143 (11) 结果读取 ： 利用酶标仪读取 OD450的值。 说 明 书 CN 102260328 A CN 102260332 A10/14 页 12 0144 (12) 结果分析 ： 0145 平均值 ： 临床阴性血清 OD450值的平均值 (xi： 第 i 份血清的 OD450值 ) ； 0146 0147 标准差 ： 临床阴性血清 OD450值的标准差 ； 0148 0149 临界值 (cut-off value) 计算 ： 临床阴性血清 OD450值的平均值加上 2 倍的标准 差 ； 0150 临界值平均值 +2 标准差 0151 阳性 ： 临床阳性血清中 OD450值大于临。

47、界值的样本为阳性样本 ； 0152 敏感性 ： 临床阳性血清中 OD450值大于临界值的样本数占临床阳性血清总数的比 例 ； 0153 0154 阴性 ： 临床阴性血清中 OD450值小于临界值的样本为阴性样本 ； 0155 特异性 ： 临床阴性血清中 OD450值小于临界值的样本数占临床阴性血清总数的比 例 ； 0156 0157 准确性 ： 0158 0159 ELISA 检测结果 (OD450值 ) 如表 7 所示。 0160 表 7 结核病检测结果表 0161 说 明 书 CN 102260328 A CN 102260332 A11/14 页 13 0162 说 明 书 CN 102。

48、260328 A CN 102260332 A12/14 页 14 0163 0164 说 明 书 CN 102260328 A CN 102260332 A13/14 页 15 0165 说明 ： 1、 表 7 中第 6 栏 - 第 7 栏中的符号 “+” ，“-” 号分别表示阳性或阴性。 0166 2、 表 7 第 5 栏的 Mutiple-antigen( 混合抗原蛋白 ) 的制备方法见 附图说明 中 图 6 的说明。表 7 结果的统计分析如表 8 所示。 0167 表 8 结核病检测结果统计分析表 0168 0169 实施例 7 ： 用 TB-DOT 试剂盒进行结核病的检测 ( 对比试验 ) 0170 采用上海奥普生物医药有限公司的结核分枝杆菌抗体诊断试剂盒 ( 胶体金法 )， 按照试剂盒的说明书的步骤进行， 具体操作如下 ： 0171 (1) 在反应板的反应孔中间， 加入 2 滴封闭液， 等待薄膜吸入 ； 0172 (2) 取 40l 新鲜的血清标本， 加入反应孔中。