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1、(10)申请公布号 CN 102253143 A (43)申请公布日 2011.11.23 CN 102253143 A *CN102253143A* (21)申请号 201110176717.8 (22)申请日 2011.06.28 G01N 30/02(2006.01) G01N 30/60(2006.01) (71)申请人 南京海赋医药科技有限公司 地址 210003 江苏省南京市鼓楼区虎踞北路 82 号 (72)发明人 赵利民 (54) 发明名称 快速、 简便、 灵敏的氨基葡萄糖盐类药物有关 杂质检测方法 (57) 摘要 本发明涉及一种快速、 简便、 灵敏的氨基葡萄 糖盐类药物有关杂质。
2、检测方法， 其特征在于如下 步骤实现 ： 照中国药典 2010 版中高效液相色谱法 （附录 D） 测定。色谱条件与系统适应性试验， 用 氨基柱为检测柱 ； 以磷酸缓冲液 （取 0.7gKH2PO4， 加水稀释成 1000ml， 用浓氨水溶液调 pH 至 7.5） ， 磷酸缓冲液与乙腈体积比为 35 ： 65 作为流动相 ； 测定波长为 195nm， 流速 ： 1.0ml/min ； 柱温 ： 35。 理论板数按盐酸氨基葡萄糖计算不低于 800。本 方法克服了现有技术中采用薄层检测方法检测， 灵敏度差， 专属性不强等特点。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发。
3、明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 102253149 A1/1 页 2 1. 快速、 简便、 灵敏的氨基葡萄糖盐类药物有关杂质检测方法， 其特征在于如下步骤实 现 ： A、 用氨基柱或 HILIC 柱作为检测色谱柱 ； B、 流动相中磷酸缓冲液为取 0.7g KH2PO4， 加水稀释成 1000ml， 用浓氨水溶液调 pH 至 6.0-8.0 ； C、 流动相中磷酸缓冲液与乙腈的体积比为 40 60 ： 60 40 ； D、 流速为 0.8ml/min 1.2 ml/min ； E、 柱温为 25 45 ； F、 检测波长为 195nm， 200nm 或 20。
4、5nm 波长 ； G、 供试品制备的浓度为 2mg/ml 20 mg/ml ； H、 对照品为水或上述 G 步制备供试品浓度的 2% ； I、 供试品和对照品的进样体积为 1l 100l ； J、 照上述方法检测， 氯离子峰与氨基葡萄糖主峰之间产生的杂质峰面积之和不得超过 总面积的 2.0% 或不得超过 2% 供试品的主峰面积， 其中氯离子峰面积及硫酸根离子峰面积 不计入。 2. 根据权利要求 1 所述的快速、 简便、 灵敏的氨基葡萄糖盐类药物有关杂质检测方 法， ， 其特征在于步骤 B 中 pH 为 7.5。 3. 根据权利要求 1 所述的快速、 简便、 灵敏的氨基葡萄糖盐类药物有关杂质检测。
5、方 法， ， 其特征在于步骤 C 中磷酸缓冲液与乙腈的体积比为 35 ： 65。 4. 根据权利要求 1 所述的快速、 简便、 灵敏的氨基葡萄糖盐类药物有关杂质检测方 法， ， 其特征在于步骤 D 中的流速为 1.0ml/min。 5. 根据权利要求 1 所述的快速、 简便、 灵敏的氨基葡萄糖盐类药物有关杂质检测方 法， ， 其特征在于步骤 E 为柱温为 35。 6. 根据权利要求 1 所述的快速、 简便、 灵敏的氨基葡萄糖盐类药物有关杂质检测方 法， ， 其特征在于步骤 F 中检测波长为 195nm。 7. 根据权利要求 1 所述的快速、 简便、 灵敏的氨基葡萄糖盐类药物有关杂质检测方法， 。
6、其特征在于步骤 G 中供试品制备的浓度为 10 mg/ml。 8. 根据权利要求 1 所述的快速、 简便、 灵敏的氨基葡萄糖盐类药物有关杂质检测方法， 其特征在于步骤 I 中供试品的进样体积为 10l。 9. 根据权利要求 1 所述的快速、 简便、 灵敏的氨基葡萄糖盐类药物有关杂质检测方法， 其特征在于该色谱柱的理论板数按盐酸氨基葡萄糖计算不低于 800。 权 利 要 求 书 CN 102253143 A CN 102253149 A1/5 页 3 快速、 简便、 灵敏的氨基葡萄糖盐类药物有关杂质检测方法 技术领域 0001 本发明涉及对氨基葡萄糖盐类药物中有关杂质的检查方法， 特别涉及快速、。
7、 简便、 灵敏的氨基葡萄糖盐类药物有关杂质检测方法。 背景技术 0002 氨基葡萄糖盐类药物 ( 如盐酸氨基葡萄糖、 硫酸氨基葡萄糖氯化钠和硫酸氨基葡 萄糖氯化钾等 ) 是目前国际上非常流行的一类骨关节营养补充剂， 很多国家已经将其批准 为治疗骨关节病的药物。美国 FDA 早在 1995 年就将之列入药典， 欧盟于 1999 年列入药典， 我国也在 1998 年后逐渐建立了盐酸氨基葡萄糖、 硫酸氨基葡萄糖氯化钠及硫酸氨基葡萄 糖氯化钾的原料药及其制剂标准。 0003 氨基葡萄糖是一种天然的氨基单糖， 存在于人体特别是关节软骨中， 是合成氨基 聚糖的基本物质， 也是关节软骨中蛋白多糖的组成成分。。
8、 它可以特异性地作用于关节软骨， 恢复软骨细胞正常的代谢功能， 刺激软骨细胞产生有正常多聚体结构的蛋白多糖， 维护软 骨基质的形态结构。 还能抑制损伤软骨基质II型胶原的超氧化自由基、 胶原酶和磷脂酶A2 的生成 ； 抑制前列腺素的合成， 保护皮质激素等各种有害物质对软骨细胞的破坏， 从而延缓 骨性关节退变的病理过程和疾病进展， 改善关节活动， 缓解疼痛。 总的趋势表明氨基葡萄糖 可改善骨关节炎的症状， 可促进和加强关节软骨的代谢活动， 使胶原、 糖氨聚糖及其他结构 蛋白的合成代谢增加， 对关节软骨的保护和修复具有十分重要的意义。氨基葡萄糖盐是一 类安全、 有效、 针对性强、 起效晚的治疗关节。
9、炎药物。 0004 据世界卫生组织 (WHO) 统计， 骨关节炎在全球 50 岁以上人口的发病率为 50， 在 55 岁以上人群的发病率为 80， 该病的致残率为 53， 据美国有关机构统计， 骨关节炎 成为继缺血性心脏病后导致工作能力丧失的第二位疾病， 美国 1992 年用于骨关节炎的医 疗费用及带来工作损失高达 650 亿美元。据我国卫生部门统计， 我国现有骨关节炎患者达 1.24 亿人， 每年医疗费用高达 39 亿元。WHO 将骨关节炎与心血管疾病及癌症列为威胁人类 健康的 “三大杀手” 。目前治疗骨关节炎的常见药物有 ： 激素类药、 非甾体类消炎药、 普通镇 痛药等。尽管这些药物对缓解。
10、关节炎疼痛和消除关节炎症由一定疗效， 但这些常用抗骨关 节炎的药物均有各自的副作用。故近二十年来， 氨基葡萄糖盐类制剂已成为治疗骨关节炎 的首选药物， 至 2007 年全球氨基葡萄糖盐制剂总销售额已逾 17 亿美元。 0005 对于使用如此广泛的一种软骨补充药物， 控制其质量特别是其中有关杂质显得尤 为重要。 氨基葡萄糖盐类这类药物制剂在生产或储存过程中， 如果温度、 湿度过高及有氧存 在下， 均会产生一系列杂质， 如文献报道3， 氨基葡萄糖水溶液放在100、 2H产生1a5-( hydroxymethyl)-2-furaldehyde(5-HMF) 和 2a2-(tetrahydroxybu。
11、tyl)-5-(3， 4 -di hydroxy-1 -trans-butenyl)-pyrazine 两种杂质， 而氨基葡萄糖固体制剂在 40， 相对 湿度为 75 10 周， 产生 3a2-(tetrahydroxybutyl)-5-(2， 3， 4 -trihydroxybutyl) pyrazine 和 4a2， 5-bis-(tetrahydroxybutyl)pyrazine(fructosazine) 两种杂质。 0006 说 明 书 CN 102253143 A CN 102253149 A2/5 页 4 0007 文献报道， 人们检测上述四个杂质时， 采用 GC-MS， LC。
12、-MS 1H and 13CNMR 进行检 测， 这些设备花费很大， 不容易普及， 因此很难在实际工作中得到应用。纵观全世界各个国 家质量标准中， 特别是美国及欧洲有关此类药物标准中均未列入此检查项目， 对其有关杂 质的控制方法未见报道。 中国有关企业申报的氨基葡萄糖盐制剂药物标准中有关杂质检查 采用了薄层方法。但经我们研究发现， 薄层检测灵敏度低， 专属性差， 不易检出杂质。而作 为一个药物， 控制其质量， 特别是对其制备工艺产生的杂质及药物上市后稳定性的研究具 有重要意义。 故随着这类药物的广泛使用， 非常迫切需要建立一个简单、 灵敏及易行的方法 对其有关杂质进行控制， 对监控这类药物生产。
13、及使用的安全有着极其重要的意义。 发明内容 0008 发明目的 0009 本发明提供一种新的检测方法， 采用目前广泛使用的 HPLC 方法， 对该产品中有关 杂质进行检测， 通过对其专属性及药物影响因素考察实验研究可知， 样品在碱水溶液中及 固体样品在高湿状态下存放， 均容易产生上述四种杂质， 结果见附图 1。在氯离子峰与氨基 葡萄糖峰之间产生了杂质峰。 通过我们发明的方法， 快速、 定量的检测出氨基葡萄糖盐类药 物产生的杂质。该方法简单、 易行、 灵敏， 其杂质可检测的浓度为 0.1， 对控制产品的质量 提供了比较好的方法。 0010 技术方案 0011 快速、 简便、 灵敏的氨基葡萄糖盐类。
14、药物有关杂质检测方法， 其特征在于如下步骤 实现 ： 0012 A、 用氨基柱或 HILIC 柱作为检测色谱柱 ； 0013 B、 流动相中磷酸缓冲液为取 0.7g KH2PO4， 加水稀释成 1000ml， 用浓氨水溶液调 pH 至 6.0-8.0 ； 0014 C、 流动相中磷酸缓冲液与乙腈的体积比为 40 60 60 40 ； 说 明 书 CN 102253143 A CN 102253149 A3/5 页 5 0015 D、 流速为 0.8ml/min 1.2ml/min ； 0016 E、 柱温为 25 45 ； 0017 F、 检测波长为 195nm， 200nm 或 205nm 。
15、波长 ； 0018 G、 供试品制备的浓度为 2mg/ml 20mg/ml ； 0019 H、 对照品为水或上述 G 步制备供试品浓度的 2 ； 0020 I、 供试品和对照品的进样体积为 1l 100l ； 0021 J、 照上述方法检测， 氯离子峰与氨基葡萄糖主峰之间产生的杂质峰面积之和不得 超过总面积的 2.0 ( 或不得超过 2供试品的主峰面积 )， 其中氯离子峰面积及硫酸根离 子峰面积不计入。 0022 其中可以优选为如下条件 ： 步骤 B 中 pH 为 7.5 ； 步骤 C 中磷酸缓冲液与乙腈的体 积比为 35 65 ； 步骤 D 中的流速为 1.0ml/min ； 步骤 E 为柱。
16、温为 35 ； 步骤 F 中检测波长 为 195nm ； 步骤 G 中供试品制备的浓度为 10mg/ml ； 步骤 H 中供试品的进样体积为 10l。 0023 具体操作方法为 ： 0024 色谱条件与系统适应性试验用氨基柱为检测柱 ； 以磷酸缓冲液 ( 取 0.7gKH2PO4， 加水稀释成 1000ml， 用浓氨水溶液调 pH 至 7.5)- 乙腈 (35 65) 为流动相 ； 测定波长为 195nm。流速 ： 1.0ml/min ； 柱温 ： 35。理论板数按盐酸氨基葡萄糖计算不低于 800。 0025 测定法取供试品适量， 精密称定， 用水溶解并制成每 1ml 中约含 10mg 的溶液。
17、， 用 0.45m 滤膜滤过， 作为供试品溶液 ； 另用水或 2供试品溶液做对照。取精密量取供试品 溶液及对照各 10l 注入液相色谱仪， 调节检测灵敏度， 使主成份色谱峰的峰高约为满量 程的20， 记录色谱图至主成份峰保留时间3倍， 用归一化法计算有关杂质(氯离子及硫酸 根离子不计入 )， 其杂质峰不得超过杂质峰和主峰面积之和的 2.0 ( 或不得超过 2供试 品的主峰面积 )。 0026 有益效果 0027 1、 氨基葡萄糖盐类药物使用人群很大， 每年均有几亿人在享用。氨基葡萄糖盐类 药物特别容易氧化和吸湿。 因此控制产品的质量， 特别是有关杂质的量显得非常重要。 但经 过国内外文献大量的。
18、检索发现， 有关氨基葡萄糖盐类中未见有较好的有关杂质检测方法。 运用本方法， 能很好的监控氨基葡萄糖盐类药物的生产及使用过程中的稳定性， 从而保证 了这类药物使用的安全性。 0028 2、 我国对氨基葡萄糖盐类药物有关杂质检测是采用薄层方法进行检测。 但其检测 灵敏度差 ( 最低检出浓度为 250g/ml)， 专属性不高。运用本法检测灵敏度高 ( 最低检出 浓度为 7.8g/ml) 其杂质可检测的浓度为 0.1， 相当于薄层的 32 倍。专属性强等优点。 0029 3、 国外在研究氨基葡萄糖盐类药物中有关杂质采用 GC-MS， LC-MS 等相关方法， 由 于仪器昂贵， 不易实现常态下质量检测。
19、。 本法采用常规高效液相设备进行， 高效液相设备为 常规设备， 所以一般药厂及检测机构容易实施本品的有关杂质检测。 附图说明 0030 图 1 为实施例 1 的结果 ； 0031 图 2 为实施例 1 的结果 ； 0032 图 3 为实施例 1 的结果 ； 说 明 书 CN 102253143 A CN 102253149 A4/5 页 6 具体实施方式 0033 实施例 1 0034 硫酸氨基葡萄糖氯化钾 ( 由江苏双林海洋生物药业有限公司提供， 批号 ： 20100425) 碱破坏有关杂质检测 0035 色谱条件与系统适应性试验用氨基柱为检测柱 ； 以磷酸缓冲液(取0.7gKH2PO4， 。
20、加 水稀释成1000ml， 用浓氨水溶液调pH至7.0)-乙腈(体积比为3565)为流动相 ； 测定波 长为 195nm。流速 ： 1.0ml/min ； 柱温 ： 35。理论板数按盐酸氨基葡萄糖计算不低于 800。 0036 测定法取经 1N 氢氧化钠碱破坏 30 分钟后经盐酸中和的样品溶液 ( 氨基葡萄糖在 碱性条件下不稳定 )， 用水稀释至每 1ml 中约含 10mg 的溶液， 用 0.45m 滤膜滤过， 作为供 试品溶液 ； 另用相同盐浓度的溶液做空白对照。取精密量取供试品溶液及对照各 10l 注 入液相色谱仪， 调节检测灵敏度， 使主成份色谱峰的峰高约为满量程的 20， 记录色谱图至。
21、 主成份峰保留时间 3 倍， 结果见图 1. 0037 由结果可知， 在色谱图中， 氯离子和主成份氨基葡萄糖峰之间产生了其它杂质峰。 由此可见， 采用本法可以检测出样品的杂质。 0038 实施例 2 0039 盐酸氨基葡萄糖 ( 由江苏双林海洋生物药业有限公司提供， 批号 ： 20100302， 样品 采用双层包装， 内衬聚乙烯塑料袋， 外罩铝箔密闭包装， 存放在阴凉、 干燥处 ) 的有关杂质 检测固体样品在高湿状态下存放。 0040 色谱条件与系统适应性试验用氨基柱为检测柱 ； 以磷酸缓冲液(取0.7gKH2PO4， 加 水稀释成 1000ml， 用浓氨水溶液调 pH 至 7.5)- 乙腈 。
22、( 体积比 35 65) 为流动相 ； 测定波 长为 195nm。流速 ： 1.0ml/min ； 柱温 ： 35。理论板数按盐酸氨基葡萄糖计算不低于 800。 0041 测定法取样品适量， 精密称定， 用水溶解并制成每 1ml 中约含 10mg 的溶液， 用 0.45m 滤膜滤过， 作为供试品溶液 ； 另用水做空白对照。取精密量取供试品溶液及对照 各 10l 注入液相色谱仪， 调节检测灵敏度， 使主成份色谱峰的峰高约为满量程的 20， 记 录色谱图至主成份峰保留时间 3 倍， 用归一化法计算有关杂质 ( 氯离子及硫酸根离子不计 入 )， 结果见图 2. 0042 在色谱图中， 氯离子和主成份。
23、氨基葡萄糖峰之间未见其它杂质峰。 由结果可知， 利 用本法， 可以检测盐酸氨基葡萄糖样品中有关杂质是否合格。 0043 实施例 3 0044 硫酸氨基葡萄糖氯化钾 ( 由江苏双林海洋生物药业有限公司提供， 批号 ： 20101008， 样品采用双层包装， 内衬聚乙烯塑料袋， 外罩铝箔密闭包装， 存放在阴凉、 干燥 处 ) 样品的有关杂质检测 0045 色谱条件与系统适应性试验用氨基柱为检测柱 ； 以磷酸缓冲液(取0.7gKH2PO4， 加 水稀释成 1000ml， 用浓氨水溶液调 pH 至 7.5)- 乙腈 ( 体积比 35 65) 为流动相 ； 测定波 长为 195nm。流速 ： 1.0ml。
24、/min ； 柱温 ： 35。理论板数按盐酸氨基葡萄糖计算不低于 800。 0046 测定法取样品适量， 精密称定， 用水溶解并制成每 1ml 中约含 10mg 的溶液， 用 0.45m 滤膜滤过， 作为供试品溶液 ； 另用水做空白对照。取精密量取供试品溶液及对照 各 10l 注入液相色谱仪， 调节检测灵敏度， 使主成份色谱峰的峰高约为满量程的 20， 记 录色谱图至主成份峰保留时间 3 倍， 用归一化法计算有关杂质 ( 氯离子及硫酸根离子不计 说 明 书 CN 102253143 A CN 102253149 A5/5 页 7 入 )， 结果见图 3. 0047 在色谱图中， 氯离子和主成份氨基葡萄糖峰之间未见其它杂质峰。 由结果可知， 利 用本法， 可以检测硫酸氨基葡萄糖氯化钾样品中有关杂质是否合格。 说 明 书 CN 102253143 A CN 102253149 A1/1 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102253143 A 。