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1、(10)申请公布号 CN 102262056 A (43)申请公布日 2011.11.30 CN 102262056 A *CN102262056A* (21)申请号 201110097211.8 (22)申请日 2011.04.19 G01N 21/27(2006.01) G01N 21/01(2006.01) (71)申请人 山东省科学院中日友好生物技术研 究中心 地址 250014 山东省济南市历下区科院路 19 号 (72)发明人 马耀宏 孟庆军 杨俊慧 杨艳 张利群 史建国 (54) 发明名称 一种用于还原糖浓度测定的补色光度自动滴 定装置 (57) 摘要 本发明涉及一种可以快速准确。
2、测定出各种样 品中还原糖浓度的补色光度滴定装置， 属于生化 分析仪器技术领域。样品中的还原糖与费林试剂 或者还原糖与铁氰化钾 - 氢氧化钠试剂在微沸状 态下发生氧化还原反应， 在添加指示剂次甲基蓝 的反应体系中， 微过量的滴定用还原糖， 会使反应 体系颜色产生变化， 采用与反应溶液体系补色的 光源系统照射反应溶液体系， 采用光电转换装置 检测透射光， 反应终点时接收信号会产生突变， 由 以上方法建立的补色光度滴定装置， 可以用于各 种样品中还原糖浓度的快速测定。补色光度减少 透光率波动， 提升了突变信号的强度， 几乎没有干 扰信号， 因此该方法测定还原糖浓度不受样品颜 色、 浑浊度、 加热气泡。
3、的干扰。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 CN 102262069 A1/1 页 2 1. 还原糖浓度测定的补色光度自动滴定装置有如下体系组成 ： 采用与样品和反应液组成整体颜色体系补色并兼顾终点整体反应液体系透射率变 化大且透射率高的单色光源 ； 采用响应时间短， 稳定性高的光电转换器与组成滴定终点判断补色光度传感器系 统 ； 用于还原糖测定的溶液反应体系采用欧姆加热方式进行加热， 也可采用石英镀导电 膜加热方式加热或者其他加热方式 ； 采用高灵敏度温度传感器与组成反应溶液体系的动态精确温度。
4、控制系统 ； 采用伺服电机驱动的计量泵用于反应试剂的精确计量 ； 采用伺服电机驱动的计量泵用于整个反应的滴定用泵， 并对加入反应体系滴定液精 确计量 ； 采用蠕动泵作为排空反应完成体系废液用排空泵 ； 采用蠕动泵进入蒸馏水， 作为反应体系清洗用排空泵 ； 反应池采用电磁搅拌方式 ； 采用聚四氟乙烯反应池或其他合适材料加工成反应池， 滴定池两侧有入射单色光源 和光电转换器 ； 滴定池侧面有液体进出管道与加热装置及温度传感器 ； 计量泵 连接液体进入管道可以加入试剂 ； 计量泵连接液体进入管道可以加入滴定液进行定量滴 定 ； 蠕动泵连接蒸馏水进入反应池 ； 蠕动泵连接反应池排出废液 ； 电磁搅拌在。
5、反应 池的底部 ； 以上系统有微处理器或计算机编制程序进行控制， 有控制面板， 主板组成控制系 统及打印机或数据输出系统。 2. 根据权利要求 1 反应体系指还原糖测定费林试剂方法， 费林试剂甲液由硫酸铜和次 甲基蓝组成， 费林试剂乙液由氢氧化钠和酒石酸钾钠、 亚铁氰化钾组成。 3. 根据权利要求 1 反应体系或指还原糖测定铁氰化钾法， 铁氰化钾法试剂包括铁氰化 钾溶液、 氢氧化钠溶液和次甲基蓝溶液组成。 4. 根据权利要求 1 所述补色单色光源采用 LED 光源、 激光单色光源或光栅光源。 5. 根据权利要求 1 所述欧姆加热的加热棒采用不锈钢或者铂金材料。加热采用交流 50 赫兹或者高频加。
6、热。 6.根据权利要求1所述高灵敏度温度传感器采用AD590集成电路传感器或其它高灵敏 度温度传感器。 7. 根据权利要求 2、 3 所述的试剂可根据反应体系确立还原糖测定的浓度范围。 8. 本发明的补色光度自动滴定装置可适用于所有滴定终点有颜色变化滴定反应测试。 权 利 要 求 书 CN 102262056 A CN 102262069 A1/6 页 3 一种用于还原糖浓度测定的补色光度自动滴定装置 技术领域 0001 本发明涉及一种可以快速准确测定出各种样品中还原糖浓度的补色光度滴定装 置， 属于生化分析仪器技术领域。 背景技术 0002 还原糖是指分子中含有游离醛基或酮基的具有还原性的糖。
7、。在糖类中， 单糖 ( 葡 萄糖、 果糖 ) 及双糖中的乳糖和麦芽糖等均具有还原基 ( 醛基或酮基 )， 故为还原糖 ； 二糖、 三糖乃至多糖只要有还原端， 亦为还原糖。 因此， 还原糖是指分子中含有游离醛基或酮基的 具有还原性的一类糖的统称。许多糖没有还原端如双糖中的蔗糖、 多糖中糊精、 淀粉、 纤维 素等， 其本身不具有还原性， 属于非还原性糖， 但可以通过水解生成还原性单糖， 测定水解 液的还原糖质量分数即可求得样品中相应糖类的含量。由于糖的分析涉及发酵、 食品、 医 药、 药学、 生物学等各个领域， 所以糖分析技术一直是国内外研究的热点。 0003 食品发酵工业是我国国民经济的重要支柱。
8、产业之一。主要包括酒类、 有机酸、 抗 生素、 酶制剂、 淀粉糖与传统制糖、 氨基酸、 核苷酸、 维生素、 微生物杀虫剂、 单细胞蛋白等产 业。应用领域涉及食品、 医药、 卫生、 轻工、 化工、 农业、 能源、 环保等诸多行业。还原糖 ( 葡 萄糖 ) 作为微生物的主要碳源和能源， 是发酵过程中重要的生化控制参数， 它在培养基中 的含量及在发酵过程中的浓度变化直接影响发酵产品的质量、 收率和生产成本。快速和准 确地检测还原糖的含量对发酵过程控制具有重要的意义。 0004 测定还原糖的方法甚多， 目前国内外常用的主要有滴定分析法、 可见分光光度法、 生物传感分析法、 仪器分析法等。分光光度法也是。
9、一种传统的分析手段， 其特点是操作简 单、 准确度高。国内大部分研究仅限于对试剂配方的改良或操作方法的变动。但分光光度 法对测试样品要求高， 样品的颜色、 浊度常常对测试产生较大干扰。酶传感器法专一性强， 且快速、 准确， 操作方便， 但是易受溶液温度、 离子强度等因素的干扰， 稳定性差， 实际应用 受到限制。红外光谱、 核磁共振 (NMR)、 色谱、 质谱分析等皆可进行糖的定性、 定量及结构分 析， 但目前还没有适合于工业生产中常规、 大批量测定还原糖的仪器产品。 HPLC或GLC常用 于多种糖的分析， 其优点是可以同时测定样品中糖的含量和多种组分， 但是测试周期长， 对 样品的要求严格， 。
10、并且测试成本高， 设备昂贵。 0005 目前， 国内主要靠手工测定法完成， 如费林试剂滴定法、 DNS 比色法等。这些方法 操作繁琐， 较为费时， 有时人为误差较大， 特别是对浑浊样品或颜色较深的样品， 颜色变化 不明显， 无法判断终点。针对以上情况， 我们在原先 “一种不受干扰的光度滴定装置” (ZL 01107845.6)、“还原糖在线自动检测装置” (ZL 03217001.7) 和 “检测还原糖的自动滴定装 置” (ZL 200420038786.8) 的研究基础上， 采用补色技术原理， 根据待测样品与费林试剂在 热滴定过程中的颜色变化特点， 参照滴定终点反应液体颜色状态， 自动选择与。
11、测试样品的 补色光源系统， 提高光透射信号变化率和光透射强度。选择适当的元件， 设计适用的电路， 对整体系统进行优化设计， 建立了还原糖浓度的补色光度滴定装置， 大大增强了系统抗干 扰的能力， 提高了还原糖测定的准确度和稳定性。 说 明 书 CN 102262056 A CN 102262069 A2/6 页 4 发明内容 0006 为了克服现有技术的不足， 本发明提供一种可以不受样品颜色、 浑浊度、 加热气泡 的干扰， 且能简便、 快速、 准确检测出各种样液的还原糖含量的自动滴定装置。本发明解决 其技术问题所采用的技术方案 ： 0007 1、 根据待测样品溶液颜色及反应试剂溶液颜色的特点选择。
12、补色光源的波长范围。 参照终点反应溶液体系的颜色， 以接收的透射光信号最大变化率及透射光光强度为目标， 最终选用的透射光源波长。费林试剂系统的补色光源波长范围在 560-590nm。 0008 2、 以最佳补色光源和光电转换器组成反应终点判断的补色光度传感器滴定控制 系统。光电转换器一般采用硒光电池、 硅光电池或光电管。 0009 3、 用于还原糖测定的溶液反应体系采用欧姆加热方式进行加热， 欧姆加热的电极 棒材采用特定不锈钢或者铂金棒材。 加热方式也可采用石英镀导电膜加热方式或者其他间 接加热方式。采用灵敏度高温度传感器组反应溶液体系的精确温度控制系统。 0010 4、 还原糖测定的反应的基。
13、本原理与费林试剂手工滴定方法相同。 费林试剂甲液由 硫酸铜和次甲基蓝组成， 费林试剂乙液由氢氧化钠和酒石酸钾钠、 亚铁氰化钾组成。 补色还 原糖光度传感器微量热滴定法测定还原糖的机理为 ： 根据经典的费林试剂测定还原糖氧化 还原反应， 该反应是在较高反应温度下， 带有还原基 - 醛基的还原糖 ( 葡萄糖 ) 被费林试剂 氧化。该方法是以次甲基蓝作为颜色指示剂。开始滴定时， 液体呈次甲基蓝的深蓝色 ； 在滴 定过程中， 定量的费林试剂被葡萄糖逐步还原 ； 在接近滴定终点时， 过量的一滴还原糖， 将 指示剂次甲基蓝还原成无色型， 溶液的颜色有蓝色变为无色， 据此确定反应终点。 根据固定 的费林试剂。
14、对应的还原糖当量， 以及标准葡萄糖消耗量， 就可计算出被滴定样品的葡萄糖 含量， 计算出待测样品还原糖浓度。 0011 费林试剂的化学反应过程 ： 0012 费林试剂由甲、 乙液组成。甲液为硫酸铜溶液， 乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶 液。平时甲、 乙液分别贮存， 测定时甲、 乙液等体积混合。混合时， 硫酸铜与氢氧化钠反应， 生成氢氧化铜沉淀 ： 0013 2NaOH+CuSO4 Cu(OH)2 +Na2SO4 公式 1 0014 所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反应， 生成酒石酸钾钠铜络合物， 使氢氧化 铜溶解反应如下 ： 0015 0016 公式 2 0017 酒石酸钾纳铜络合物中二价铜是一。
15、个氧化剂， 能使还原糖中羰基氧化， 而二价铜 被还原生成一价的氧化亚铜沉淀 ： 0018 说 明 书 CN 102262056 A CN 102262069 A3/6 页 5 0019 公式 3 0020 反应生成的氧化亚铜沉淀与费林试剂中的亚铁氰化钾(黄血盐)反应生成可溶性 复盐， 减少溶液混浊， 便于观察颜色变化。 0021 Cu2O+2K4Fe(CN)6+H2O K4Fe(CN)6+H2OK2Cu2Fe(CN)6+2KOH 0022 公式 4 0023 反应终点用次甲基蓝指示剂显示。因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱， 故待二价铜 全部被还原后， 一滴过量还原糖立即使次甲基蓝还原， 溶液蓝色消。
16、失显示终点 ： 0024 0025 公式 5 0026 5、 采用步进电机驱动的计量泵(试剂泵)用于反应试剂的精确试剂的精确计量加 入。采用步进电机驱动的计量泵 ( 滴定泵 ) 用于整个反应的滴定用泵， 并对加入反应体系 滴定液精确计量。采用蠕动泵作为排空反应完成体系废液用排空泵。采用蠕动泵进入蒸馏 水， 作为反应体系清洗用排空泵整个反应体系采用电磁搅拌方式。 0027 6、 采用聚四氟乙烯反应池或其他合适材料加工成反应池， 滴定池两侧有入射单色 光源系统和光电转换器 ； 滴定池侧面有液体进出管道 ； 计量泵 ( 试剂泵 ) 连接液体进入管 道可以加入试剂 ； 计量泵 ( 滴定泵 ) 连接液体。
17、进入管道可以加入滴定液 ； 蠕动泵连接蒸馏 水进入反应池 ； 蠕动泵连接反应池排出废液 ； 电磁搅拌在反应池的底部， 用于滴定液体均 匀混合的 ； 滴定池上部是进样口， 可用微量进样器将被测样品注入滴定池。 0028 7、 自动控制系统包括电源电路、 控制板、 显示面板和微型打印机， 可以用计算机或 者单片机进行控制， 按设定程序控制滴定池液体的进出、 液体加热及温度控制、 搅拌、 光电 信息的收集和转换， 结果计算、 显示、 输出和打印。 0029 综上所述， 一种检测还原糖的自动滴定装置， 补色还原糖光度传感器包括补色光 源系统、 补色光接收光电转换系统、 液体加热与温度控制系统、 滴定计。
18、量系统、 液体流动系 统、 电磁搅拌系统、 试剂计量系统、 操作系统、 显示打印系统等。 以上系统由主板等硬件及软 说 明 书 CN 102262056 A CN 102262069 A4/6 页 6 件的单片机系统测控下组成用于还原糖浓度测定得补色光度滴定装置。 0030 本发明的特点有以下几个方面 ： 0031 1、 操作简单， 滴定时只需用微量进样器将被测样品注入滴定池即可自动完成。 0032 2、 根据滴定需要设定反应系统和液体系统的温度控制。 0033 3、 有与液体颜色补色的单色光系统， 可最大限度减少滴定干扰。 0034 4、 有精密螺杆推进式柱塞计量泵， 试剂计量准确快速。 0。
19、035 5、 结果准确， 重复测定的误差小于手工滴定。 0036 6、 测定速度快， 滴定周期小于 3 分钟， 特别适合于大批量样品的测定。 0037 7、 抗干扰性能强， 不受样品颜色和浊度的影响。 0038 8、 性能稳定， 适用范围广， 可应用于工业生产控制， 分析检验， 科研， 教学等领域， 具有广阔的市场前景和显著的社会经济效益。 附图说明 0039 图 1 还原糖测定装置的系统组成 0040 补色还原糖光度传感器包括补色光源系统、 补色光接收光电转换系统、 液体加热 与温度控制系统、 滴定计量系统、 液体流动系统、 电磁搅拌系统、 试剂计量系统、 操作系统、 显示打印系统等。以上系。
20、统由主板等硬件及软件的单片机系统测控组成测定装置， 实现还 原糖的测定。 0041 图 2 还原糖测定装置工作流程图 0042 还原糖测定装置的工作流程 ： 设定液体流量泵流速和流量， 启动注射泵， 将斐林试 剂工作液A和B液分别泵入管道微量热滴定池样品注入滴定池液体加热至98左右 传感器测定温度， 在到达预定温度后启动滴定泵光电转换器检测电压变化控制系统 自动记录电压信号和滴定液消耗体积滴定终点颜色突变， 输出电压变化明显， 确定滴定 终点滴定泵停止计算和显示被测样品还原糖含量启动排空泵， 将反应池内液体排出 然后进入下一次测定。整个测定过程可按设定程序控制反应液体的进出、 液体温度、 搅拌。
21、、 光电反应信息的收集和转换， 结果计算、 显示和打印。 具体实施方式 0043 实施例 0044 补色光度自动滴定装置主要性能及样品测试 0045 1、 精密度和准确度 0046 (1) 材料与方法 0047 补色还原糖自动滴定装置 0048 开机 ： 按 “开 / 关” 键， 自动启动准备程序。 0049 定标 ： 按定标健， 自动进入定标程序。试剂泵完成后， 用微量注射器将标准品注入 反应池， 完成后仪器自动定标， 并打印 ； 0050 测定 ： 按测定键， 自动进入测定程序。试剂泵完成后， 用微用微量注射器将标准品 注入反应池， 完成后仪器自动定标， 并打印 ； 0051 (2) 结果。
22、与分析 说 明 书 CN 102262056 A CN 102262069 A5/6 页 7 0052 用 1.0葡萄糖标准溶液， 进样量 500l， 连续 10 次测定， 结果见表 1。 0053 表 1 ： 传感器精密度和准确度测试 0054 0055 对上述统计结果处理 ： 0056 N 10， 均值 x 1.001， s 0.0074 0057 准确度 ： (90的置信范围 )1.0010.009 0058 精密度 ： RSD 0.74 0059 2、 线性测试 0060 (1) 方法 0061 方法 ： 分别取 1.0的葡萄糖标准溶 500l、 400l、 300l、 200l、 1。
23、00l、 0l 进行测定， 测定方法同上。 0062 (2) 结果与分析 0063 对不同体积的 1葡萄糖标准液进行测定， 测定结果见表 2 0064 表 2 ： 线性试验结果 0065 0066 对上述结果进行线性回归分析， r 0.9998， 还原糖浓度在 0-1.0范围内线形良 好。 0067 3、 样品测试 0068 取发酵 28 小时谷氨酸发酵液， 利用补色还原糖自动滴定装置测定其还原糖含量， 样品重复 8 次测定， 结果见表 3 发酵液试验结果。 0069 表 3 ： 发酵液试验结果 0070 0071 4、 回收率试验 0072 用补偿法向同一样品发酵液 (28 小时 ) 添加无水葡萄糖标准样品， 用补色还原糖 自动滴定装置对加样样品和未加样样品进行测定， 计算加入葡萄糖的回收率。 0073 表 4 ： 回收率试验结果 0074 说 明 书 CN 102262056 A CN 102262069 A6/6 页 8 0075 由表 4 可知补色还原糖光度滴定装置的回收率为 99.2， 这说明补色还原糖自动 滴定装置分析测定结果可靠性强。 说 明 书 CN 102262056 A CN 102262069 A1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102262056 A 。