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1、(10)申请公布号 CN 102162006 A (43)申请公布日 2011.08.24 CN 102162006 A *CN102162006A* (21)申请号 201010113005.7 (22)申请日 2010.02.20 C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 北京金菩嘉医疗科技有限公司 地址 100176 北京市亦庄经济技术开发区宏 达北路 8 号宏达工业园 (72)发明人 陈忠 程晓蕾 阴层层 吴晓东 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 程泳 (54) 发明名称 用于检测前列腺。
2、癌的检测剂及其用途 (57) 摘要 本发明涉及用于检测前列腺癌的检测剂和试 剂盒。 具体地， 所述检测剂为选自如下的三个探针 组中的至少一个 ： 1)GLPTMPRSS2/ETV1 探针组 ； 2) GLP ERG 探针组 ； 和 3)GLPTMPRSS2/ETV4 探针组。 具体地， 所述试剂盒包括溶解在 TE Buffer 中的 所述检测剂， 其中所包括的探针组的浓度为 50 300ng/l。 本发明还涉及所述检测剂和试剂盒在 检测TMPRSS2基因与ETS家族基因融合中的用途、 以及一种检测 TMPRSS2 基因与 ETS 家族基因融合 的方法。 (51)Int.Cl. (19)中华人民。
3、共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 18 页 序列表（电子公布） 附图 7 页 CN 102162007 A1/3 页 2 1. 用于检测前列腺癌的检测剂， 所述检测剂为选自如下的三个探针组中的至少一个 ： 1)GLP TMPRSS2/ETV1 探针组 包括第一探针、 第二探针、 第三探针、 第四探针、 第五探针、 以及第六探针， 其中 第一探针、 第二探针、 和第三探针都是带有第一荧光标记的核酸序列， 并且这三个探针 各自的核酸序列合起来包含 TMPRSS2 基因的全部核酸序列以及染色体 21q22 上的 TMPRSS2 基因 5 末端以外 70kb 17。
4、0kb 的核酸序列和 / 或 3 末端以外 150kb 250kb 的核酸序 列， 第四探针、 第五探针、 和第六探针都是带有第二荧光标记的核酸序列， 并且这三个探针 各自的核酸序列合起来包含染色体 7p21 上的 ETV1 基因 5 末端以外 100kb 200kb 的核 酸序列和 / 或 3 末端以外 80kb 180kb 的核酸序列， 所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同 ； 2)GLP ERG 探针组 包括第一探针、 第二探针、 第三探针、 第四探针， 其中 第一探针、 第二探针都是带有第一荧光标记的核酸序列， 并且这两个探针各自的核酸 序列合起来包含 ERG 基因的一部分核酸序列。
5、和染色体 21q22 上的 ERG 基因 5 末端以外的 160kb 260kb 的核酸序列， 第三探针、 第四探针都是带有第二荧光标记的核酸序列， 并且这两个探针各自的核酸 序列合起来包含 ERG 基因的一部分核酸序列和染色体 21q22 上的 ERG 基因 3 末端以外的 180kb 280kb 的核酸序列， 并且所述四个探针各自的核酸序列合起来要包含 ERG 基因的全部核酸序列， 所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同 ； 和 3)GLP TMPRSS2/ETV4 探针组 包括第一探针、 第二探针、 第三探针、 第四探针、 第五探针、 第六探针以及第七探针， 其 中 第一探针、 第二探。
6、针、 第三探针、 和第四探针都是带有第一荧光标记的核酸序列， 并 且这四个探针各自的核酸序列合起来 TMPRSS2 基因的全部核酸序列和染色体 21q22 上的 TMPRSS2 基因 5 末端以外 80kb 180kb 的核酸序列和 / 或 3 末端以外的 150kb 250kb 的核酸序列， 第五探针、 第六探针、 和第七探针都是带有第二荧光标记的核酸序列， 并且这三个探针 各自的核酸序列合起来包含 ETV4 基因的全部核酸序列和染色体 17q21 上的 ETV4 基因 5 末端以外 180kb 280kb 的核酸序列和 / 或 3 末端以外 150kb 250kb 的核酸序列， 所述第一荧。
7、光标记与所述第二荧光标记不相同。 2.根据权利要求1所述的检测剂， 其中， 所述探针分别以包含TMPRSS2、 ERG、 ETV1、 ETV1 这 4 个基因的核酸序列的克隆插入片段作为探针制备的模板， 采用随机引物法或切口平移 法进行荧光标记， 优选地， 所述三个探针组中的第一荧光标记都是四甲基罗丹明， 第二荧光 标记都是异硫氰酸。 3. 根据权利要求 2 所述的检测剂， 其为选自如下的三个探针中的至少一个探针组 ： 1)GLP TMPRSS2/ETV1 探针组 第一探针、 第二探针、 和第三探针分别以选自 BAC cloneRP11-814F13、 RP11-671L10、 权 利 要 求。
8、 书 CN 102162006 A CN 102162007 A2/3 页 3 AL773578、 RP11-635F7、 以及 CTD-2337B13 中的 3 个克隆的插入片段作为探针制备的模板， 并且优选地， 这 3 个克隆是 RP11-814F13、 RP11-635F7、 CTD-2337B13 或者 RP11-671L10、 AL773578、 CTD-2337B13， 第四探针、 第五探针、 和第六探针分别以选自 BAC cloneRP11-79G16、 RP11-692G10、 RP4-685A2、 CTD-2134C13、 AC004909、 RP11-313C20 中的 3。
9、 个克隆的插入片段作为探针 制备的模板， 并且优选地， 这 3 个克隆是 ： RP11-79G16、 RP4-685A2、 RP11-313C20 或者 RP11-692G10、 CTD-2134C13、 AC004909 ； 2)GLP ERG 探针组 第一探针、 第二探针分别选自以 BAC clone RP11-476D17、 CTD-3244I3、 CTD-2341O18 中的 2 个克隆的插入片段作为探针制备的模板， 并且优选地， 这 2 个克隆是 ： RP11-476D17、 CTD-2341O18 或者 RP11-476D17、 CTD-3244I3， 第三探针、 第四探针分别选自。
10、以 BAC clone RP11-95I21、 CTD-2506J13、 RP11-259A4 中的 2 个克隆的插入片段作为探针制备的模板， 并且优选地， 这 2 个克隆是 ： RP11-95I21、 RP11-259A4 或者 RP11-95I21、 CTD-2506J13 ； 3)GLP TMPRSS2/ETV4 探针组 第一探针、 第二探针、 第三探针、 第四探选自以 BAC cloneRP11-814F13、 RP11-671L10、 AL773578、 RP11-635F7、 CTD-2337B13 以及 CTD-3095D11 中的 4 个克隆的插入片段作为 探针制备的模板， 并。
11、且优选地， 这 4 个克隆是 ： RP11-814F13、 RP11-635F7、 CTD-2337B13、 CTD-3095D11 或者 RP11-671L10、 AL773578、 CTD-2337B13、 CTD-3095D11， 第五探针、 第六探针、 和第七探针分别选自以 BAC cloneCTD-2326M16、 CTD-2321N2、 AC087650、 CTD-3215I16、 CTC-420I11、 AC068675、 RP11-147C10 中的 3 个克隆的插入片段作 为探针制备的模板， 并且优选地， 这 3 个克隆是 ： CTD-2326M16、 CTD-3215I16。
12、、 CTC-420I11 或 者 CTD-2321N2、 AC087650、 RP11-147C10。 4.用于检测前列腺癌的试剂盒， 所述试剂盒包括溶解在TEBuffer中的权利要求1-3中 任一项所述的检测剂， 并且所述检测剂中的探针组的浓度为 50 300ng/l。 5. 根据权利要求 4 所述试剂盒， 其还包括 GLP 杂交缓冲液 ； 优选地， 所述试剂盒还包 括 ： 缓冲液的储存液、 缓冲液、 变性液、 乙醇溶液、 甲酰胺洗涤液、 洗涤液、 快洗洗涤液、 30 (w/v) 酸性亚硫酸钠溶液、 蛋白酶 K 储存液、 蛋白酶 K 工作液、 以及甲醛固定液。 6. 权利要求 1-3 中任一。
13、项所述的检测剂、 或者权利要求 4 或 5 所述的试剂盒在检测 TMPRSS2 基因与 ETS 家族基因融合中的用途。 7. 一种检测 TMPRSS2 基因与 ETS 家族基因融合的方法 ： 使用权利要求 1-3 中任一项所述的检测剂、 或者权利要求 4 或 5 所述的试剂盒， 通过荧 光原位杂交检测 TMPRSS2 基因与 ETS 家族基因的融合状况。 8. 根据权利要求 7 所述的方法， 其中， 所用检测样本为选自如下的任一种 ： 前列腺石蜡包埋组织切片、 穿刺、 冰冻石蜡组织切片、 前列腺分泌液。 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 还包含如下步骤 ： 收集 20 位正常人的组织样本与。
14、探针组杂交， 分别分析 100 个细胞， 计算显示异常信号 细胞的百分比的平均值及标准差， 将平均值 +3 倍标准差定义为异常阈值 ； 权 利 要 求 书 CN 102162006 A CN 102162007 A3/3 页 4 观察待测样本杂交后的整张玻片， 确定看到异常细胞区域， 分别分析 100 个细胞， 计算 显示异常信号细胞的百分比， 并与异常阈值相比较， 当该百分比大于所述阈值时， 样本为阳 性 ； 反之样本为阴性。 10. 根据权利要求 9 所述的方法， 还包含如下步骤 ： 对于如下的情形不要进行分析 ： 1) 细胞核轮廓不清或有重叠的计数细胞 ； 2) 杂交不均匀的区域 ； 3。
15、) 背景深影响信号判断的区域 ； 4) 超过 25的细胞核内信号太弱的区域 ； 5) 超过 10的细胞质内有信号的区域。 权 利 要 求 书 CN 102162006 A CN 102162007 A1/18 页 5 用于检测前列腺癌的检测剂及其用途 技术领域 0001 本发明涉及用于检测前列腺癌的检测剂和试剂盒、 所述检测剂和试剂盒在检测 TMPRSS2基因与ETS家族基因融合中的用途、 以及一种检测TMPRSS2基因与ETS家族基因融 合的方法。 背景技术 0002 前列腺癌 (prostate cancer， 下文简称为 “PCa” ) 是一种常见的老年男性泌尿生 殖系统恶性肿瘤。在欧美。
16、国家， 前列腺癌居男性恶性肿瘤的第二位 (Jemal A， Murray T， Samuels A， et a1.CancerstatisticsJ.CA Cancer J， 2003， 53(1) ： 5-26.)， 病死率仅次于 肺癌。在我国， 前列腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势， 已高居泌尿系肿瘤的第三位， 并且发病年龄也日趋年轻化。 0003 早期 PCa 主要表现为组织结构的改变， 细胞病理学的改变并不典型， 诊断易受病 理检查者的主观影响。目前， PSA 筛查、 直肠指诊、 经直肠超声引导穿刺活检是前列腺癌诊 断的标准方法。但这三种方法都有其不足。 0004 关于 PSA 筛查。
17、方法， 当 PSA 10ng/ml 时患癌的几率在 50以上 ； 当 PSA 为 4 10ng/ml， 考虑穿刺活检进一步证实， 仅能发现 20-40的 PCa 患者， 漏诊率高 ； 当 PSA 4ng/ml， 不主张做穿刺活检， 但近年来发现当 PSA 为 2 4ng/ml 时， 20 30的患者也 发现有 PCa。PSA 作为 PCa 血清学标记不能有效地区分早期 PCa 和前列腺增生， 特别是当 PSA 为 2 10ng/ml 时有必要研究新的早期 PCa 诊断方法， 有效地筛查出 PSA 在 2 10ng/ ml 范围内的 PCa。 0005 而 DRE 的诊断价值稍低， DRE 发现。
18、的前列腺癌只有 33被证实为早期局限性前 列腺癌 (Thompson IM， Emst JJ， Gangai MP， et a1.Adenocarcinoma of the prostate ： results of routine urologicalscreeningJ.J Urol， 1984， 132(4) ： 690-692.)， 该诊断 方法也会造成患者的生理不适。 0006 经直肠超声引导穿刺活检是目前临床术前确诊前列腺癌的常用手段， 但是比较容 易出现一些并发症， 例如， 出血 ( 如血尿、 血便、 血精 )、 疼痛、 感染等， 并且当检测点数较低 时， 常出现漏诊的情况。 0。
19、007 很多遗传病和一些类型的癌症都与染色体发生易位有关。 染色体易位是指两条染 色体发生断裂后相互交换无着丝粒断片， 形成两条新的衍生染色体的现象。易位是比较常 见的染色体结构畸变， 在各号染色体间都可发生。染色体易位是由 2 个没有在正常的基因 组里共现的基因相互融合而引起的。 某些与染色体异位有关的情况经常发生在相同位置或 该位置附近。经常发生断裂的染色体区域称为断裂区。 0008 现已知， 大约有 80的前列腺癌患者存在 TMPRSS2 基因 (Genbank 登录号为 ： 7113) 与 ETS 基因家族的融合， 包括与 ERG(21q22)(Genbank 登录号为 ： 2078)。
20、、 ETV1(7p21) (Genbank 登录号为 ： 2115)、 ETV4(17q21)(Genbank 登录号为 ： 2118) 基因的融合改变， 发 生机理为 ： 发生断裂的 TMPRSS2 基因与发生断裂的 ETV1 基因相互融合， 导致 21 号染色体 说 明 书 CN 102162006 A CN 102162007 A2/18 页 6 与 7 号染色体发生相互易位 ； 位于 21 号染色体的 ERG 基因发生断裂， 与 TMPRSS2 基因发生 融合， 形成 21 号染色体重组 ； 发生断裂的 TMPRSS2 基因与发生断裂的 ETV4 基因相互融合， 导致 21 号染色体与。
21、 17 号染色体发生相互易位 (Recurrent Fusion of TMPRSS2 and ETS Transcription FactorGenes in Prostate Cancer Scott A.Tomlins Daniel R.Rhodes SvenPerner Science 310， 644(2005) ； 以及 Maisa Yoshimoto， Anthony M.Joshua， Susan Chilton-MacNeill， et al Neoplasia， June 2006， 8(6) ： 465-469 Three-Color FISH Analysis of T。
22、MPRSS2-ERG Fusions inProstate Cancer)。在上述三种基因融合中， TMPRSS2 与 ERG 融合基因可能还可以预测 PCa 的进展， 有报道， 缺乏 ERG 基因改变的 PCa 患 者的 8 年生存率达 90。 0009 荧光原位杂交技术是一种检测遗传学改变的分子细胞技术， 能够在细胞核、 染色 体水平上显示基因数量、 结构的变异。 荧光原位杂交技术用荧光染料标记的核酸作为探针， 按照碱基互补的原则， 与待检材料中目的核酸进行特异性结合， 形成可被检测的杂交双链 核酸， 在荧光显微镜下观察并记录结果。 0010 荧光原位杂交技术具有操作简单， 重复性好、 灵。
23、敏性及特异性高的特点 ； 比传统 方法可更早发现细胞异常， 能大幅度降低漏诊率 ； FISH 检测前列腺癌的临床检测敏感性达 到 80以上， 特异性近 100 (Tomlins SA， Mehra R， Rhodes DR， et alTMPRSS2 ： ETV4 genefusions define a third molecular subtype of prostate cancer.CancerRes.， 2006)， 能够为临床提供相比 PSA 筛查和穿刺活检更为准确、 客观的诊断指标， 这对于前列 腺癌的早期诊断及预后判断有着极其重要的意义。 0011 针对现有技术的上述不足， 本。
24、发明人通过创造性的构思和不懈的实验努力完成了 本发明。本发明通过使包含 TMPRSS2、 ERG、 ETV1、 ETV4 基因的 DNA 序列带有荧光标记， 成为 荧光原位杂交探针， 通过与从患者身上取得的组织样本等进行杂交， 带有荧光标记的原位 杂交探针与样本的 TMPRSS2、 ERG、 ETV1、 ETV4 基因区依次按照碱基互补的原理结合， 从而将 患者的 TMPRSS2、 ERG、 ETV1、 ETV4 基因结构变异以荧光信号改变的方式显示。 0012 本发明的荧光原位杂交探针组的临床检测灵敏度在 80以上， 特异性都近 100， 并具有取材方便等优势， 比起传统的前列腺癌检测技术更。
25、具有先进性。 发明内容 0013 本发明的一个方面是提供用于检测前列腺癌的检测剂， 所述检测剂为选自如下的 三个探针组 (GLP TMPRSS2/ETV1 探针组、 GLPERG 探针组、 GLP TMPRSS2/ETV4 探针组 ) 中的 至少一个 ： 0014 1)GLP TMPRSS2/ETV1 探针组 0015 包括第一探针、 第二探针、 第三探针、 第四探针、 第五探针、 以及第六探针， 其中 0016 第一探针、 第二探针、 和第三探针都是带有第一荧光标记的核酸序列， 并且这三个 探针各自的核酸序列合起来包含TMPRSS2基因(SEQ ID NO ： 1)的全部核酸序列以及染色体 。
26、21q22上的TMPRSS2基因5 末端以外70kb170kb的核酸序列和/或3 末端以外150kb 250kb 的核酸序列， 0017 第四探针、 第五探针、 和第六探针都是带有第二荧光标记的核酸序列， 并且这三个 探针各自的核酸序列合起来包含ETV1基因(SEQID NO ： 2)的全部核酸序列以及染色体7p21 说 明 书 CN 102162006 A CN 102162007 A3/18 页 7 上的 ETV1 基因 5 末端以外 100kb 200kb 的核酸序列和 / 或 3 末端以外 80kb 180kb 的核酸序列， 0018 所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同。 001。
27、9 在本发明的一个实施方案中， 第一探针、 第二探针、 和第三探针合起来的核酸序列 ( 参见附图 1A) 为大约 370kb， 这些探针的序列选自购买的 BAC clone( 购自 Children s Hospital of Oakland ResearchInstitute(CHORI) 或 invitrogen)RP11-814F13( 其 插 入片断起止位置 ： chr21 ： 41704419-41876631， SEQ ID NO ： 5)、 RP11-671L10( 其插入片断 起止位置 ： chr21 ： 41709062-41876646， SEQ ID NO ： 6)、 A。
28、L773578( 其插入片断起止位置 ： chr21 ： 41559315-41716976， SEQID NO ： 7)、 RP11-635F7( 其插入片断起止位置 ： chr21 ： 41570022-41735879， SEQ ID NO ： 8)、 以及 CTD-2337B13( 其插入片断起止位置 ： chr21 ： 41896060-41939772， SEQ ID NO ： 9) 中的 3 个克隆的插入片段， 并且优选如下的 2 组 ： RP11-814F13、 RP11-635F7、 CTD-2337B13 或者 RP11-671L10、 AL773578、 CTD-2337。
29、B13， 这 2 组探针各自的核酸序列合起来约370kb， 包含TMPRSS2基因的全部核酸序列和染色体21q22 上的 TMPRSS2 基因 5 和 / 或 3 末端以外的部分序列。 0020 在本发明的一个实施方案中， 第四探针、 第五探针、 和第六探针合起来的核酸序列 ( 参见附图 1B) 为大约 350kb， 这些探针的序列选自购买的 BAC clone( 购自 Children s Hospital of Oakland ResearchInstitute(CHORI) 或 invitrogen)RP11-79G16( 其插 入 片 断 起 止 位 置 ： chr7 ： 137857。
30、85-13935899， SEQ ID NO ： 10)、 RP11-692G10( 其 插 入 片 断 起 止 位 置 ： chr7 ： 13782597-13947348， SEQ ID NO ： 11)、 RP4-685A2( 其 插 入 片 断 起 止 位 置 ： chr7 ： 13887063-13996421， SEQ IDNO ： 12)、 CTD-2134C13( 其 插 入 片 断 起 止 位 置 ： chr7 ： 13915125-13973529， SEQ ID NO ： 13)、 AC004909( 其 插 入 片 断 起 止 位 置 ： chr7 ： 13996222。
31、-14128271， SEQ ID NO ： 14)、 RP11-313C20( 其插入片断起止位置 ： chr7 ： 13975267-14159425， SEQ ID NO ： 15) 中的 3 个克隆的插入片段， 并且优选如下的 2 组 ： RP11-79G16、 RP4-685A2、 RP11-313C20 或者 RP11-692G10、 CTD-2134C13、 AC004909， 这两组 探针各自的核酸序列合起来约 350kb， 包含 ETV1 基因的全部核酸序列和染色体 7p21 上的 ETV1 基因 5 和 / 或 3 末端以外的部分序列。 0021 在本发明的一个实施方案中，。
32、 第一探针、 第二探针、 和第三探针用红色荧光标记， 第四探针、 第五探针、 和第六探针用绿色荧光标记， 用于检测 TMPRSS2/ETV1 基因融合， 相对 于现有技术， 本发明的探针组覆盖范围更大， 在荧光显微镜下的肉眼检测效果更为显著， 并 且由于调换标记的颜色， 使用更多克隆的插入片段， 能够使探针的信号得到显著增强， 更有 利于观察结果。 0022 2)GLP ERG 探针组 0023 包括第一探针、 第二探针、 第三探针、 第四探针， 其中 0024 第一探针、 第二探针都是带有第一荧光标记的核酸序列， 并且这两个探针各自的 核酸序列合起来包含 ERG 基因 (SEQ ID NO 。
33、： 3) 的一部分核酸序列和染色体 21q22 上的 ERG 基因 5 末端以外的 160kb 260kb 的核酸序列， 0025 第三探针、 第四探针都是带有第二荧光标记的核酸序列， 并且这两个探针各自的 核酸序列合起来包含 ERG 基因的一部分核酸序列和染色体 21q22 上的 ERG 基因 3 末端以 外的 180kb 280kb 的核酸序列， 说 明 书 CN 102162006 A CN 102162007 A4/18 页 8 0026 并且所述四个探针各自的核酸序列合起来要包含 ERG 基因的全部核酸序列， 0027 所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同。 0028 在本发明的。
34、一个实施方案中， 第一探针和第二探针合起来的核酸序列 ( 参见附 图 2) 为大约 320kb， 这些探针的序列选自购买的 BACclone( 购自 Children s Hospital of Oakland Research Institute(CHORI) 或 invitrogen) 中的 3 个克隆 RP11-476D17( 其 插入片断起止位置 ： chr21 ： 38604838-38785541， SEQ ID NO ： 16)、 CTD-3244I3( 其插入片 断起止位置 ： chr21 ： 38468179-38608049， SEQ ID NO ： 17)、 CTD-23。
35、41O18( 其插入片断起 止位置 ： chr21 ： 38465658-38646411， SEQ ID NO ： 18) 的插入片段， 其中优选如下的 2 组， RP11-476D17、 CTD-2341O18 或者 RP11-476D17、 CTD-3244I3， 这组探针各自的核酸序列合起 来为大约320kb， 包含ERG基因的一部分核酸序列和染色体21q22上的ERG基因靠近着丝粒 端的部分序列。 0029 在本发明的一个实施方案中， 第三探针和第四探针合起来的核酸序列 ( 参见附 图 2) 为大约 320kb， 这些探针的序列选自购买的 BACclone( 购自 Children 。
36、s Hospital of Oakland Research Institute(CHORI) 或 invitrogen) 中的 3 个克隆 RP11-95I21( 其 插入片断起止位置 ： chr21 ： 38821491-39010973， SEQ ID NO ： 19)、 CTD-2506J13( 其插入 片断起止位置 ： chr21 ： 38999889-39191869， SEQ ID NO ： 20)、 RP11-259A4( 其插入片断起 止位置 ： chr21 ： 39012507-39144422， SEQ ID NO ： 21) 的插入片段， 并且优选如下的 2 组 ： R。
37、P11-95I21、 RP11-259A4 或者 RP11-95I21、 CTD-2506J13， 这两组探针各自的核酸序列合起 来为大约320kb， 包含ERG基因的一部分核酸序列和染色体21q22上的ERG基因靠近端粒端 的部分序列。 0030 在本发明的一个实施方案中， 这4个探针将ERG基因分成两段， 靠近着丝粒端的第 一探针和第二探针用绿色荧光标记， 靠近端粒端的第三探针和第四探针用红色荧光标记， 用于检测 ERG 基因断裂的克隆插入片段覆盖范围大于现有技术， 且在仅选用双色标记的情 况下， 可以检测到更多的范围， 不光包括 ERG 基因与 TMPRSS2 基因的融合， 更包括 ER。
38、G 基因 与非 TMPRSS2 基因融合的情况， 用更容易在荧光显微镜下判断的简单的双色搭配， 检测更 多的异常类型是本探针设计的优势。 0031 3)GLP TMPRSS2/ETV4 探针组 0032 包括第一探针、 第二探针、 第三探针、 第四探针、 第五探针、 第六探针以及第七探 针， 其中 0033 第一探针、 第二探针、 第三探针、 和第四探针都是带有第一荧光标记的核酸序列， 并且这四个探针各自的核酸序列合起来TMPRSS2基因的全部核酸序列和染色体21q22上的 TMPRSS2 基因 5 末端以外 80kb 180kb 的核酸序列和 / 或 3 末端以外的 150kb 250kb 。
39、的核酸序列， 0034 第五探针、 第六探针、 和第七探针都是带有第二荧光标记的核酸序列， 并且这三个 探针各自的核酸序列合起来包含 ETV4 基因 (SEQID NO ： 4) 的全部核酸序列和染色体 17q21 上的 ETV4 基因 5 末端以外 180kb 280kb 的核酸序列和 / 或 3 末端以外 150kb 250kb 的核酸序列， 0035 所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同。 0036 在本发明的一个实施方案中， 第一探针、 第二探针、 第三探针、 第四探针合起来 说 明 书 CN 102162006 A CN 102162007 A5/18 页 9 的核酸序列 ( 参。
40、见附图 3A) 为大约 380kb， 这些探针的序列选自购买的 BAC clone( 购 自 Children s Hospital of OaklandResearch Institute(CHORI) 或 invitrogen) RP11-814F13、 RP11-671L10、 AL773578、 RP11-635F7、 CTD-2337B13 以 及 CTD-3095D11( 其 插入片断起止位置 ： chr21 ： 41924082-41952283， SEQ ID NO ： 22) 中的 4 个克隆的插入片 段， 其中优选如下的 2 组 ： RP11-814F13、 RP11-63。
41、5F7、 CTD-2337B13、 CTD-3095D11 或者 RP11-671L10、 AL773578、 CTD-2337B13、 CTD-3095D11， 这 2 组探针各自的核酸序列合起来为 大约 380kb， 包含 TMPRSS2 基因的全部核酸序列和染色体 21q22 上的 TMPRSS2 基因 5 和 / 或 3 末端以外的部分序列。 0037 在本发明的一个实施方案中， 第五探针、 第六探针和第七探针合起来的核酸序列 为大约 350kb( 参见附图 3B)， 这些探针的序列选自购买的 BAC clone( 购自 Children s Hospital of Oakland R。
42、esearchInstitute(CHORI) 或 invitrogen)CTD-2326M16( 其 插 入 片 断 起 止 位 置 ： chr17 ： 38879789-38997637， SEQ ID NO ： 23)、 CTD-2321N2( 其 插 入 片 断 起 止 位 置 ： chr17 ： 38899792-38997630， SEQ ID NO ： 24)、 AC087650( 其 插 入 片 断 起 止 位 置 ： chr17 ： 38762437-38932045， SEQ ID NO ： 25)、 CTD-3215I16( 其 插 入 片 断 起 止 位 置 ： chr。
43、17 ： 38799094-38869021， SEQ ID NO ： 26)、 CTC-420I11( 其 插 入 片 断 起 止 位 置 ： chr17 ： 38997631-39134026， SEQ ID NO ： 27)、 AC068675( 其 插 入 片 断 起 止 位 置 ： chr17 ： 38926965-39091575， SEQ ID NO ： 28)、 RP11-147C10( 其插入片断起止位置 ： chr17 ： 39020689-39205553， SEQID NO ： 29) 中的 3 个克隆的插入片段， 并且优选为如下 的 2 组 ： CTD-2326M16。
44、、 CTD-3215I16、 CTC-420I11 或者 CTD-2321N2、 AC087650、 AC068675、 RP11-147C10， 这两组探针各自的核酸序列合起来为大约 350kb， 包含 ETV4 基因的全部核酸 序列和染色体 17q21 上的 ETV4 基因 5 和 / 或 3 末端以外的部分序列。 0038 需要说明的是， 用于检测 TMPRSS2/ETV4 基因融合的克隆插入片段的覆盖范围超 出现有技术， 在荧光显微镜下的肉眼检测效果更为显著， 使用更多的克隆能够使探针的信 号得到显著增强， 更有利于观察结果。 0039 在本发明的一个实施方案中， 探针组中的探针序列为。
45、上述 3 个探针组中的探针的 互补序列， 或者选自如下的变体 ： 0040 1) 在高等严紧条件下与上述 3 个探针组中的探针的核苷酸序列杂交的核苷酸序 列， 0041 2) 对上述 3 个探针组中的探针的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、 缺失、 添加修饰的核苷酸序列， 0042 3) 与上述 3 个探针组中的探针的核苷酸序列具有至少 90的序列同一性的核苷 酸序列。 0043 典型地，“杂交条件” 根据测量杂交时所用条件的 “严紧性” 程度来分类。严紧性 程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度 (Tm) 为依据。例如，“最大严紧性” 典 型地发生在约 Tm-5 ( 低于探针 Tm 。
46、5 ) ；“高等严紧性” 发生在 Tm 以下约 5-10；“中等 严紧性” 发生在探针 Tm 以下约 10-20 ；“低严紧性” 发生在 Tm 以下约 20-25。作为替 代， 或者进一步地， 杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和 / 或一或多次的严紧性洗 涤为依据。例如， 6SSC 极低严紧性 ； 3SSC 低至中等严紧性 ； 1SSC 中等严紧性 ； 0.5SSC 高等严紧性。从功能上说， 可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一 说 明 书 CN 102162006 A CN 102162007 A6/18 页 10 或近严紧同一的核酸序列 ； 而采用高等严紧性条件确定与该探针有约。
47、 80或更多序列同 一性的核酸序列。 0044 对于要求高选择性的应用， 典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体， 例如， 选择相对低的盐和 / 或高温度条件。Sambrook 等 (Sambrook， J. 等 (1989) 分子克隆， 实验 室手册， Cold Spring HarborPress， Plainview， N.Y.) 提供了包括中等严紧性和高等严紧 性在内的杂交条件。 0045 为便于说明， 用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧 条件包括 ： 用 5SSC、 0.5 SDS、 1.0mM EDTA(pH8.0) 溶液预洗 ； 在 50-65下在 5S。
48、SC 中 杂交过夜 ； 随后用含 0.1 SDS 的 2、 0.5 和 0.2SSC 在 65下各洗涤两次 20 分钟。 本领域技术人员应当理解， 能容易地操作杂交严紧性， 如改变杂交溶液的含盐量和 / 或杂 交温度。例如， 在另一个实施方案中， 合适的高度严紧杂交条件包括上述条件， 不同之处在 于杂交温度升高到例如 60-65或 65-70。 0046 在本发明中， 所述对上述 3 个探针组中的探针的核苷酸序列进行一个或多个碱基 的取代、 缺失、 添加修饰的核苷酸序列， 是指分别或同时在所述核苷酸序列的5 端和/或3 端， 和 / 或序列内部进行例如不超过 2-45 个， 或者不超过 2-3。
49、0 个， 或者不超过 3-20 个， 或 者不超过 4-15 个， 或者不超过 5-10 个， 或者不超过 6-8 个的分别用逐个连续整数表示的碱 基的取代、 缺失、 添加修饰。 0047 通过一种多核苷酸进行说明， 其所具有的核苷酸序列例如与上述 3 个探针组中的 探针的核苷酸序列至少具95的 “同一性” 是指 ： 在上述3个探针组中的探针的核苷酸序列 之每100个核苷酸中， 该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外， 该多核 苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说， 为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至 少 95相同的多核苷酸， 参考序列中多达 5的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代 ； 或 可将一些核苷酸插入参考序列中， 其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的 5； 或 在一些核苷酸中， 存在删除、。