牵涉血红素结合蛋白1的方法和用途本发明涉及一种筛选内皮NO合酶(eNOS)表达的调控剂的方法、一种在
受试者中诊断心血管疾病的方法、HEBP-1用于鉴定用于预防和/或治疗牵涉
eNOS功能异常的疾病(特别是心血管疾病)的药物的用途、HEBP-1用于检
测eNOS信号转导的成分的用途、及HEBP1用于调节eNOS启动子活性的用
途。
氧化氮合酶(EC 1.14.13.39；NOS)于1998年被发现，并且在那一时期，不
知道其产物氧化氮(NO)的生理学重要性，氧化氮(NO)是哺乳动物中最小的生
物活性分子。同时，发现NO是调节心血管系统中的血管紧张度方面的一种
重要的信使，在中枢神经系统中作为第二信使和作为针对细菌和肿瘤细胞的
防御机制。在1989年，诺贝尔医学奖授予Robert Furchgott、Ferid Murad和Luis
J.Ignaro，他们将NO鉴定为哺乳动物细胞的信使。
NOS是由不同基因编码的相关酶的一个家族的成员。NOS是生物学中最
受调节的酶之一。有三种已知的同等型，两种是组成性的(cNOS)，而第三种
是诱导型的(iNOS)。NOS酶的克隆指明cNOS包括脑组成性(NOS1、nNOS
或神经元NOS)和内皮组成性(NOS3、eNOS、cNOS或内皮NOS)基因两
者，第三种是诱导型(NOS2、iNOS或诱导型NOS)基因。
在脑中，nNOS是一种具有161kDa分子量的可溶性酶，并且代表最大的
NOS同等型。此同等型主要在神经元细胞中和在脑中组成性表达，而且仅生
成低量的NO。对酶活性的调节经由钙调蛋白受Ca2+介导。然而，其酶活性还
经由Ca2+钙调蛋白依赖性蛋白激酶2及蛋白激酶A、C和G受磷酸化影响。在
脑中，NO对于调节突触处的信号处理(transaction)是重要的。外周血管和平
滑肌细胞常常受释放NO并对交感神经系统起拮抗作用的神经神经支配。另
外，在骨骼肌中检测出大量的nNOS，其中NO控制肌肉收缩性和局部血流。
诱导型NOS在巨噬细胞中表达，但是也在细菌LPS或细胞因子诱导后在
其它细胞中表达。与nNOS一样，iNOS是一种具有131kDa分子量的大部分可
溶的蛋白质，其释放巨量的NO。iNOS在转录方面受多种刺激调节。诱导其
表达后，NO释放起巨噬细胞的细胞毒性原理作用，其通过破坏微生物和寄
生物及肿瘤细胞来实现。然而，NO也可以攻击健康体细胞，而且诱导对周
围组织的损害。大多数炎性和自身免疫性疾病特征在于巨量活化的巨噬细胞
和嗜中性粒细胞的存在。此外，iNOS在感染性休克的病理学中也是重要的，
所述感染性休克特征在于大面积动脉血管舒张、低血压和微血管损伤。
最后，内皮NOS负责大部分血管生成的NO，其针对动脉硬化和血栓形
成提供保护。完整的eNOS在血管稳态的生理学维持中构成中枢关键，而且
在心血管系统的病理生理学中发挥关键作用。血管内皮中的eNOS释放NO在
基础条件由一系列受体激动剂诸如缓激肽、乙酰胆碱和组胺的刺激及流动血
液的剪应力介导。NO通过刺激可溶性鸟苷酸环化酶并提高平滑肌细胞中的
cGMP浓度来导致所有类型的血管扩张。因而，来自内皮细胞的NO是交感神
经系统或肾素-血管紧张素系统进行血管收缩的一种重要的内源血管扩张对
应物。
在其血管扩张特性外，内皮NO具有一系列的血管保护和抗硬化特性。
向血管腔释放的NO是血小板聚集和粘附于管壁的一种有力的抑制剂。除了
针对血栓形成提供保护外，抑制生长因子自血小板的释放，这可以刺激平滑
肌细胞的增殖。在家兔和小鼠中，显示了对eNOS的遗传或药理学抑制导致
进行性动脉硬化。此外，内皮NO可以调控牵涉动脉生成的基因的表达。这
特别适用于来自单核细胞的趋化性蛋白质(MCP1)、表面分子诸如
CD11/CD18、P-选择蛋白、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)和胞内粘附分子
(ICAM)1。因而，阻止脂细胞在管壁中的粘附和浸润，由此针对动脉生成的
早期阶段提供保护。此外，NO抑制血管平滑肌细胞的增殖、有丝分裂发生
和DNA合成。假定抗增殖效果是由cGMP介导的。此外，NO可以通过蛋白质
的S-亚硝基化而具有直接效果，诸如通过胱天蛋白酶3的亚硝基化实现的内
皮细胞中的抗凋亡效果。
已经将一系列心血管疾病与由于NO的合成降低和/或降解增加所致的生
物可用性NO缺乏联系起来。其它经典的症状和疾病包括低胆固醇血、糖尿
病、高血压和由吸烟介导的不利影响。如上文所详述的，不同心血管疾病的
病理学通常基于由于内皮功能异常所致的NO缺乏。NO生物活性可以是由于
eNOS的表达和/或活性降低、eNOS解耦、NO降解增加或NO效应器系统的响
应性降低。
用有机硝酸盐进行的保守疗法由于释放巨量的NO而与多种缺点有关。
特别在永久性药疗上，观察到硝酸盐效果的显著降低，这称为“硝酸盐耐受”。
6-8小时的无硝酸盐时段是必要的，以获得硝酸盐的全部效果。另外，典型
的不利影响是硝酸盐头痛、皮肤变红(“潮红”)和伴有反射性心动过速的血
压强烈降低的风险。因而，鉴定用于永久疗法的新药物(其可以诱导功能性
eNOS的表达，而且与硝酸盐形成对比，其可以永久性提高生物可用性NO的
量)是一种令人感兴趣的且有价值的研究目标。由于其在动物(包括人)身
体中的重要生理学和病理生理学功能，检测调控eNOS活性的新方式是重要
的。
因而，本发明的一个目的是检测调控eNOS活性的备选机制。
令人惊讶的是，发现血红素结合蛋白1(HEBP1)牵涉eNOS表达的激活。
具体地，发现在通过RNA技术关闭HEBP1时，eNOS启动子的活性显著降低。
因而，可以使用与HEBP1相互作用的手段和方法以调节或改变eNOS启
动子活性和/或eNOS表达。
因此，在第一个方面，本发明涉及一种筛选内皮NO合酶(eNOS)表达的
调控剂的方法，该方法包括：
-提供包含血红素结合蛋白1(HEBP1)或其功能活性变体的测试系统，
-使所述测试系统与药剂接触，并
-检测所述药剂对所述测试系统的影响，由此将所述药剂鉴定为eNOS表
达的调控剂。
如上文所详述的，eNOS(又称为氧化氮合酶3(NOS3))在血管中生成
NO，而且牵涉调节血管功能。它特异性地在不同动脉和静脉内皮细胞类型
中表达。然而，还可以显示，eNOS在人胎盘、肾小管肾上皮细胞和家兔的
结肠细胞中表达，而且还在大鼠海马和其它脑区的神经元中检测出eNOS免
疫反应。与iNOS相比，eNOS是组成性表达的，并且释放低量的NO。
酶eNOS以同二聚体存在，其中每个单体由数个亚基构成(iNOS的示意
图显示于Forstermann和Monzen，2006，Circulation 113：1708-1714)。C端还原
酶域结合烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、黄素单核苷酸(FMN)和黄素
腺嘌呤二核苷酸(FAD)，而且与钙调蛋白结合域及加氧酶域连接。加氧酶域
具有前列腺血红素基团，并且结合6(R)-5，6，7，8-四氢生物蝶呤(BH4)、分子氧
和L-精氨酸。单体的还原酶域与第二个单体的N端加氧酶域连接。所有NOS
同工酶催化黄素介导的自C端结合的NADPH至N端域的血红素的电子转移。
通过钙诱导的自钙调蛋白结合NOS来增加还原酶域中自NADPH至黄素以及
自还原酶域至加氧酶域的血红素的电子转移。在血红素基团上，电子用于还
原和活化分子氧。L-精氨酸氧化成L-瓜氨酸经由生成Nω-羟基-L-精氨酸
(NOHLA)作为中间体的两个连续的单氧合反应发生，由此生成NO。
如上文所详述的，内皮NO合酶(eNOS)功能异常牵涉一系列疾病。可以
证明，eNOS表达在多种疾病中是降低的，所述疾病包括心血管疾病诸如心
力衰竭和心肌梗死。令人惊讶的是，已经发现了血红素结合蛋白1(HEBP1)
是一种特别通过与eNOS启动子相互作用来调控eNOS表达的因子。可以使用
此实情以检测eNOS表达的调控剂，其形成潜在的用于治疗以eNOS表达改变
为特征的疾病的治疗剂。
所要求保护的筛选调控剂的方法包括提供包含HEBP1的测试系统。如本
发明的上下文中所显示的，HEBP1是一种与eNOS启动子相互作用，并且由
此改变eNOS表达的蛋白质。HEBP1也称作血红素结合蛋白1、HBP、HEBP
或p22HBP。假定HEBP1可以在结合可存在于细胞中的游离卟啉原中起作用，
并且如此促进这些潜在地毒性化合物的除去。它以高亲和力结合一分子的血
红素或卟啉，其中它对金属卟啉、游离的卟啉和N-甲基原卟啉具有相似的亲
和力。
人蛋白质的氨基酸序列由189个氨基酸组成，并且于PubMed以登录号
NP_057071可获得。然而，HEBP1蛋白也可以自任何其它物种衍生，而且已
经发表了其它物种的HEBP1蛋白序列。例子包括小鼠(musculus)(登录号
NP_038574，称为Hebp1)、黑猩猩(pan troglodytes)(登录号XP_528742，称
为LOC473371)、原鸡(Gallus gallus)(登录号NP_001025925，称为
RCJMB04_2k3)、家犬(Canis familiaris)(登录号XP_534884，称为
NOC477690)和褐鼠(Rattus norwegicus)(登录号XP_342776，称为HEBP1_
预测)。
在任何天然存在的HEBP1变体诸如物种变体或剪接变体外，也可以使用
经修饰的HEBP1蛋白。应当注意到，经修饰的HEBP1蛋白或HEBP1变体是功
能活性变体，因为变体维持其与eNOS启动子相互作用并调控eNOS表达的生
物学功能。优选地，生物学功能的维持(例如调节eNOS表达)定义为具有
天然存在的HEBP1的调控剂活性的至少50％，优选地至少60％，更优选地至
少70％、80％或90％，还更优选地95％。可以如实施例，特别是实施例1、2、
3或4中所描述的那样测定生物学活性(例如通过使用eNOS启动子报告细胞
系诸如EA.crs03或经生物素标记的转录增强剂诸如A012或A013或用于测定
mRNA水平诸如eNOS mRNA的RT-PCR或猝灭色氨酸荧光或荧光偏振或动
物模型来进行)。
变体可以是具有构成天然存在的HEBP1蛋白的域和至少一种别的构件
的分子。例如，蛋白质可以与标志物诸如用于纯化目的的标签(例如6 His
(或6xHis)标签、Strep标签、HA标签、c-myc标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)
标签)偶联。如果例如应当需要高度纯化的HEBP1蛋白或变体，那么可以使
用双重或多重标志物(例如上述标志物或标签的组合)。在此情况中，在两
个或更多个分开的层析步骤中纯化蛋白质，在每种情况中，利用第一标签的
亲和力，然后利用第二标签的亲和力来进行。此类双重或串联标签的例子是
GST-His标签(与多组氨酸标签融合的谷胱甘肽-S-转移酶)、6xHis-Strep标签
(与Strep标签融合的6个组氨酸残基)、6xHis-tag100-标签(与哺乳动物MAP
激酶2的12个氨基酸的蛋白质融合的6个组氨酸残基)、8xHis-HA标签(与血
细胞凝集素表位标签融合的8个组氨酸残基)、His-MBP(与麦芽糖结合蛋白
融合的His标签)、FLAG-HA标签(与血细胞凝集素表位标签融合的FLAG标
签)、和FLAG-Strep标签。可以使用标志物以检测加有标签的蛋白质，其中
可以使用特定抗体。合适的抗体包括抗HA(诸如12CA5或3F10)、抗6 His、
抗c-myc和抗GST。此外，HEBP1蛋白可以与不同种类的标志物诸如荧光标
志物或放射性标志物(其容许检测HEBP1)连接。在又一个实施方案中，
HEBP1可以是融合蛋白的一部分，其中可以使用第二部分来检测，诸如具有
酶活性的蛋白质构件。
在本发明的另一个实施方案中，HEBP1变体可以是HEBP片段，其中该
片段仍能够与eNOS启动子相互作用，并调节eNOS表达。这可以包括具有短
的C-和/或N端删除(例如至多20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、
10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸的删除)的HEBP1蛋白。另外，
可以进一步修饰HEBP1片段，如上文对HEBP1蛋白所详述的。
或者/另外，如上文所描述的HEBP1蛋白或其变体可以包含一处或多处
氨基酸替代，特别在不牵涉与eNOS启动子相互作用并调节eNOS表达的区域
中。然而，优选保守氨基酸替代，其中将氨基酸用化学上相关的氨基酸替换。
典型的保守替代在脂肪族氨基酸间、在具有脂肪族羟基侧链的氨基酸间、在
具有酸性残基的氨基酸间、在酰胺衍生物间、在具有碱性残基的氨基酸间、
或具有芳香族残基的氨基酸间发生。可以修饰具有替代的HEBP1蛋白或片段
或变体，如上文对HEBP1蛋白或片段或变体所详述的。除非另有规定，在本
发明的以下描述中，关于HEBP1蛋白给出的所有详情也涉及其功能活性变
体。
然而，最优选地，HEBP1蛋白是天然存在的HEBP1蛋白，还更优选地，
天然存在的人HEBP1蛋白。
如上文所详述的，测试系统包含HEBP1蛋白或其功能活性变体。测试系
统还可以包含别的元件诸如用于检测调控剂对测试系统的影响以将药剂鉴
定为eNOS表达的调控剂的手段。适合于检测调控剂影响的手段遍及本说明
书详述。测试系统可以在细胞系统或无细胞系统中，在占优势的条件下视情
况而定。
对于本发明的方法，使包含HEBP1或其功能活性变体的测试系统与药剂
接触。用本发明的方法测试的药剂可以是具有任何化学性质的任何测试物质
或测试化合物。它可以已经被认为是用于疾病的药物或药剂。或者，它可以
是在另一个实施方案中尚不知道具有治疗效果的已知化学化合物，并且化合
物可以是新的或迄今未知的化学化合物。药剂也可以是测试物质或测试化合
物的混合物。
在本发明的筛选方法的一个实施方案中，以化学化合物文库形式提供测
试物质。化学化合物文库包括多种化学化合物，而且已经从多种来源(包括
化学合成的分子或天然产物)之任一种装配，或者已经通过组合化学技术来
生成。它们尤其适合于高通量筛选，并且可以由特定结构的化学化合物或特
定生物体诸如植物的化合物组成。在本发明的上下文中，优选地，化学化合
物文库是包含蛋白质和多肽或小有机分子的文库。优选地，小有机分子在大
小上小于500道尔顿，特别是可溶性非寡聚体有机化合物。
在本发明的上下文中，使测试系统与药剂接触，其时间和条件适合于调
控eNOS表达并对其检测。合适的条件包括合适的温度和溶液以避免例如所
牵涉的蛋白质变性或者以维持活细胞(若存在的话)。合适的条件会取决于
选择的具体测试系统，并且技术人员基于其一般知识会能够对其选择。
使测试系统与药剂接触后，检测药剂对测试系统的影响。在下文中，会
更为详细地描述一系列不同检测系统。然而，应当理解，这些是例示性的，
并且其它测试系统也可以是合适的。
若药剂对测试系统具有特定的且显著的影响，则将药剂鉴定为eNOS表
达的调控剂。在本发明的上下文中，eNOS表达调控剂意指改变，即提高或
降低eNOS表达的药剂。优选地，提高eNOS表达。在本发明的上下文中，若
与调控剂接触的合适细胞中的eNOS表达分别显著低于或高于对照(即没有
与调控剂接触的相同细胞)的eNOS表达的话，eNOS表达与对照相比得到修
饰，即降低或优选地提高，。本领域技术人员知道用于评估两个数值是否彼
此显著不同的统计学规程诸如Student氏t检验或卡方检验。
在一个优选的实施方案中，eNOS表达相当于对照的至少110％、优选地
至少125％、更优选地至少150％、160％、170％、180％或190％，还更优选地
至少200％，且最优选地至少300％。
然而，本发明的方法不要求在所述方法内测定调控剂对eNOS表达的影
响。注意到，筛选方法可以涵盖或不涵盖测量eNOS表达的步骤。或者，为
了测量eNOS表达，可以使用指明调控eNOS表达的检测方法。尤其对于高通
量筛选，使用非常容易且有力的检测系统可以是优选的，所述系统包含尽可
能少的成分。在本发明的一个实施方案中，测试系统可以仅包含HEBP1蛋白
(或其功能活性变体)和在没有牵涉HEBP1和eNOS的信号转导的别的成分
的情况中检测药剂/调控剂结合蛋白质的手段。例如，此类系统可以是如下的
系统，其中将要测试的药剂或HEBP1蛋白或其功能活性变体固定化于载体
上。可以检测药剂对HEBP1蛋白或其功能活性变体的结合，由此用可检测标
志物标记未固定化的结合配偶。可以将固定化的成分固定化于单一材料上或
多种不同材料上，所述材料能够基于其物理特征结合一种生物分子或多种生
物分子。此类材料包括但不限于阴离子交换材料、阳离子交换材料、金属螯
合剂、肽、抗体、聚合物(合成的或天然的)、纸等。
可以使固定化的成分与可移动的(即未固定化的)潜在的结合配偶接触，
其中在足以容许结合的时间后除去未结合的可移动结合配偶。可以检测可移
动的和固定化的成分的结合，这是由于在固定化的配偶的固定化位置处存在
可移动结合配偶的标志物。例如，可以将一系列不同药剂诸如蛋白质固定化
于多孔板中，并可以与经标记的HEBP1蛋白一起温育。在那些检测出标志物
的孔中，发生药剂与HEBP1蛋白之间的结合。可以将相应的药剂鉴定为潜在
的eNOS表达调控剂。
可以以多种方式标记成分，特别是蛋白质以容许充分的检测或纯化。可
以使用常见的标记方法来标记成分表面上的一种或多种功能基团。对于蛋白
质，这些可以是例如伯氨基团，其存在于每条多肽链的N端和赖氨酸残基的
侧链；巯基基团，其存在于通过用还原剂处理二硫键或者通过用诸如SATA
等试剂修饰赖氨酸残基可获得的半胱氨酸残基上；或碳水化合物基团，其通
常存在于抗体的Fc区中，所述碳水化合物基团可以氧化以创建供偶联用的活
性醛。可以用一系列不同试剂，诸如生物素(对于亲合素-生物素化学)、酶、
用于标记胺、巯基或其它功能基团的活化的荧光染料例如FITC、荧光素、罗
丹明、Cy染料或A1exa fluos来标记成分或蛋白质。也可以使用放射性标记物
诸如3H、32P、35S、125I或14C及常见的酶标记物，包括青霉素酶、辣根过氧化
物酶和碱性磷酸酶。
对于本发明的方法，可以使用任何合适的检测。可以根据要测试的药剂
和测试系统的特征来选择合适的方法。如上文所详述的，HEBP1牵涉eNOS
表达的信号转导。因而，可以测定药剂与HEBP1(或其变体)或HEBP1信号
转导中的上游成分的相互作用。可以直接或间接测定相互作用。“直接地”
意味着测定药剂对HEBP1的结合(例如，使用标记的标志物以检测HEBP1/
药剂复合物来进行)。“间接地”意味着测定信号转导中的下游HEBP1的影响
(例如eNOS启动子的活性、eNOS mRNA水平或eNOS蛋白的量)。合适的方
法在例如实施例中详述。
在第一种情况中，测量药剂蛋白质相互作用。一系列测试是本领域中已
知的，其中可以使用测试系统，并可以使测试系统适合所述测试。这可以是
异质或同质测定法。如本文中所使用的，异质测定法是包括一次或多次清洗
步骤的测定法，而在同质测定法中，此类清洗步骤不是必需的。仅将试剂和
化合物混合并测量。
在一个实施方案中，测定法是ELISA(酶联免疫吸附测定法)、DELFIA
(解离增强镧系元素荧光免疫测定法)、SPA(闪烁亲近测定法)、Flashplate
测定法、FRET(荧光共振能量转移)测定法、TR-FRET(时间分辨荧光共
振能量转移)测定法、FP(荧光偏振)测定法、ALPHA(放大发光亲近同
质测定法)、EFC(酶片段互补)测定法、双杂交测定法或共免疫沉淀测定
法。
多家公司提供基于ELISA(酶联免疫吸附测定法)的测定法。它是一种
用于检测样品中的抗体或抗原存在的生物化学技术。实施ELISA牵涉至少一
种对特定抗原(例如第一或第二蛋白质的区段)具有特异性的抗体。一般地，
将样品中未知量的抗原固定化于表面上。然后，用特定抗体清洗表面。此抗
体与生成可检测信号诸如颜色变化或荧光的酶连接。例如，将具有未知量的
抗原的样品非特异性(经由对表面的吸附)或特异性(经由对相同抗原特异
性的另一种抗体的捕获，在“三明治式”ELISA中)固定化于固体支持物(通
常为微量滴定板)上。将抗原固定化后，添加检测抗体，与抗原形成复合物。
检测抗体可以与酶共价连接，或者自身可以通过经由生物偶联与酶连接的二
抗检测。每个步骤之间，通常用温和的去污剂溶液清洗平板以除去任何非特
异性结合的蛋白质或抗体。最终的清洗步骤后，通过添加酶底物来使平板显
色以产生可见信号，其指明样品中的抗原数量。较老的ELISA利用生色底物，
虽然较新的测定法采用具有高得多的灵敏度的荧光底物。
基于DELFIA(解离增强镧系元素荧光免疫测定法)的测定法是固相测
定法。通常用铕或另一种镧系元素标记抗体，并在洗去未结合的经铕标记的
抗体后检测铕荧光。
SPA(闪烁亲近测定法)和Flashplate测定法通常利用生物素/亲合素相互
作用来捕获经放射性标记的底物。一般地，反应混合物包括激酶、生物素化
的肽底物和γ-[33P]ATP。反应后，通过链霉亲合素捕捉生物素化的肽。在SPA
检测中，将链霉亲合素在含有闪烁体的珠上结合，而在Flashplate检测中，将
链霉亲合素结合至含有闪烁体的微板的孔内部。一旦固定化，经放射性标记
的底物与闪烁体接近得足以激发光的发射。
荧光共振能量转移(FRET)描述了两个生色团之间的放射-自由能转移。
处于其激发状态的供体生色团可以通过非放射性远程偶极子-偶极子耦合机
制将能量转移至极其接近(通常＜10nm)的受体荧光团。因为这两种分子是
荧光性的，所以能量转移经常称为“荧光共振能量转移”，尽管能量实际上
不通过荧光转移。FRET是一种检测和量化蛋白质-药剂相互作用、蛋白质-
蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用、和蛋白质-构象变化的有用工具。
为了监测蛋白质与药剂、一种蛋白质与另一种或蛋白质与DNA的结合，用供
体标记分子之一，并用受体标记另一个，并混合这些经荧光团标记的分子。
在它们以未结合状态存在时，在供体激发后检测到供体发射。在分子结合后，
使供体和受体接近，并主要观察到受体发射，这是由于从供体至受体的分子
间FRET。适合于FRET的邻居是本领域中已知的，而且熟练从业人员会能够
选择适合于两种抗体的标记物组合。如本文中关于供体和相应的受体所使用
的，“相应的”指具有与供体的激发光谱交叠的发射光谱的受体荧光模块。
然而，这两种信号彼此应当可分开。因而，受体的发射光谱的波长最大值应
当比供体的激发光谱的波长最大值大优选至少30nm，更优选地至少50nm，
诸如至少80nm，至少100nm或至少150nm(还可参见实施例3.1)。
可以在FRET技术中与各种受体荧光模块一起使用的代表性供体荧光模
块包括荧光素、萤光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、萤光黄VS、4-乙
酰氨基-4’-异硫氰酸芪-2，2’-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰苯基)-4-甲基
香豆素、琥珀酰亚氨基1-芘丁酸酯、和4-乙酰氨基-4’-异硫氰酸芪-2，2’-二磺
酸衍生物。代表性受体荧光模块(取决于所使用的供体荧光模块)包括LC-Red
610、LC-Red 640、LC-Red 670、LC-Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明
B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明x异硫氰酸酯、赤藓红异硫氰酸
酯、荧光素、二乙烯三胺五乙酸酯或镧系元素离子(例如铕或铽)的其它螯
合物。供体和受体荧光模块可以获自例如Molecular Probes(Junction City，OR)
或Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。
或者，可以对本发明的测试系统使用时间分辨荧光共振能量转移
(TR-FRET)。TR-FRET联合TRF(时间分辨荧光)和FRET原理。此组合将TRF
的低背景优点与FRET的同质测定法形式组合。虽然已经在上文描述了
FRET，TRF利用镧系元素或具有长半衰期的任何其它供体的独特特性。适合
于TR-FRET的供体包括镧系元素螯合物(穴状化合物)和一些其它金属配体
复合物(其可以具有在微秒至毫秒时间范围中的荧光半衰期，并且因此其还
容许能量转移在微秒至毫秒量度中发生)等。在20世纪70年代后期已经使用
荧光镧系元素螯合物作为能量供体。常用的镧系元素包括钐(Sm)、铕(Eu)、
铽(Tb)和镝(Dy)。由于其特定的光物理和光谱特性，镧系元素复合物在生物
学中在荧光应用上具有主要的兴趣。具体地，在与更传统的荧光团相比时，
它们具有较大的斯托克(Stroke)氏位移和极常长的发射半衰期(微秒至毫秒)。
通常，使用有机生色团作为受体。这些包括别藻蓝蛋白(APC)。关于
TR-FRET及受体的合适的详情记载于WO 98/15830。
基于荧光偏振(FP)的测定法是使用偏振光来激发溶液中的荧光底物肽的
测定法。这些荧光肽在溶液中是游离的，并翻转，引起发射光变为消偏振。
在底物肽结合较大分子时，其翻转速率大大降低，而且发射光保持高度偏振
(还可参见实施例4.3)。
在本发明的又一个实施方案中，为放大发光亲近同质测定法(ALPHA)
改编本发明的测试系统。ALPHA是一种基于溶液的测定法，其最初由Packard
BioScience开发。ALPHA是一种基于发光的亲近测定法，其中将一个相互作
用配偶附着至供体珠，而将另一个与受体珠偶联，这两者都具有仅约250nm
的直径。将光敏剂化合物包埋入供体珠中。凭借此化合物，在用约680nm波
长的激光照射后，将周围的氧转化成能量丰富的、短寿命单线态氧。在无受
体珠接近时，单线态氧在不产生信号的情况中衰变。若供体和受体珠通过附
着的生物分子的生物学相互作用而聚集(约250nm)，则由供体珠释放的单线
态氧在邻近的受体珠中启动发光/荧光级联，导致520-620nm范围中的高度放
大信号。在合适的阅读器中检测发光信号。关于ALPHA技术的更多详情，
参见Ullman等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 91，5426-5430。
特别地，可以使用基于EFC(酶片段互补)的测定法或等同测定法来高
通量筛选化合物。EFC测定法基于经工程化改造的β-半乳糖苷酶酶，其由两
种片段，即酶受体(EA)和酶供体(ED)组成。在片段分开时，没有β-半乳糖苷
酶活性，但是在片段在一起时，它们结合(互补)以形成活性酶。EFC测定
法利用ED-分析物偶联物，其中分析物可以由特异性结合蛋白诸如抗体或受
体识别。在没有特异性结合蛋白的情况中，ED-分析物偶联物能够互补EA以
形成活性β-半乳糖苷酶，这产生阳性发光信号。若ED-分析物偶联物被特异
性结合蛋白结合，则阻止与EA的互补，而且没有信号。若(在样品中)提
供游离的分析物，则它会与ED-分析物偶联物竞争与特异性结合蛋白的结合。
游离的分析物会释放ED-分析物偶联物以与EA互补，产生信号，信号取决于
样品中存在的游离分析物的量。
双杂交筛选是一种用于通过测试两个蛋白质间的物理相互作用(诸如结
合)来发现蛋白质-蛋白质相互作用的分子生物学技术。该测试后面的前提
是通过转录因子结合至上游激活序列上来激活下游报告基因。出于双杂交筛
选的目的，将转录因子分成两个分开的片段，称作结合域(BD)和激活域(AD)。
BD是负责结合UAS的域，而AD是负责激活转录的域。
共免疫沉淀可以用于通过沉淀认为在复合物中的一种蛋白质来鉴定蛋
白质复合物，也将复合物的别的成员捕获，并且可以对其鉴定。一旦结合特
异性抗体，通过用附着至固体支持物诸如琼脂糖珠的抗体结合蛋白捕捉来从
大量溶液取出蛋白质复合物。这些抗体结合蛋白(蛋白A、蛋白G、蛋白L)
最初自细菌分离，而且识别极其多种抗体。蛋白质或蛋白质复合物的初始捕
获后，将固体支持物清洗数次以除去未经由抗体特异性且紧密结合的任何蛋
白质。清洗后，将沉淀的蛋白质洗脱，并使用凝胶电泳、质谱术、Western
印迹、或许多用于鉴定复合物中的成分的其它方法来分析。如此，共免疫沉
淀是一种用于评估蛋白质-蛋白质相互作用的标准方法。牵涉共免疫沉淀的
合适的测试系统记载于实施例1中。
在本发明的另一个优选的实施方案中，可以改编用于检测第一和第二蛋
白质之间的相互作用的手段以测量信号级联中HEBP1下游的一种或多种成
分。测量可以包括测定eNOS mRNA或eNOS蛋白或报告蛋白或mRNA的浓
度。可以测量响应潜在调控剂的浓度，如上文所描述的。用于测定一种或多
种核酸或蛋白质浓度的手段和方法是技术人员公知的，包括此类牵涉
RT-PCR、质谱术或FRET的(还可参见实施例)。
例示性的测试系统及其用途记载于实施例1至4。
优选地，方法改编用于高通量筛选。在此方法中，在无细胞或全细胞测
定法中对许多化合物筛选药剂。通常，这些筛选在96孔板中使用基于自动化
机器人站的技术或者以较高密度的阵列(“芯片”)形式实施。
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的测试系统进一步包含：
-eNOS启动子和/或
-eNOS启动子的一种或多种转录因子。
eNOS启动子是容许基因转录的eNOS基因调节区。如同许多其它组成性
表达基因一样，eNOS启动子缺乏经典的TATA框。然而，可以鉴定Sp1、Ets、
GATA、NF-1、AP-1、剪应力和固醇的一系列保守顺式元件。已知的eNOS
转录刺激物是例如经由流动血液的剪应力、缺氧和诸如雌激素和溶血磷脂酰
胆碱等药剂。eNOS转录可以由于氧合低密度脂蛋白(oxLDL)和肿瘤坏死因子
α而降低。
人eNOS基因中的转录因子结合位点的示意图由Searles(Searles，2006，
Am.J.Physiol.Cell Physiol.291：C803-C860)显示。根据对人eNOS基因的近端
共启动子(co-promoter)的详细分析，相对于转录起始，分别在位置-104/-95
和-144/-115处鉴定出两种正调节域(PRDI和II)。Ets家族的成员、Sp1、Sp3变
体、MAZ和YY1鉴定为此区内的调节转录因子。在PRDI和II内，可以检测出
就eNOS转录而言正的蛋白质DNA和蛋白质-蛋白质相互作用，这指明eNOS
转录受转录因子的复合物相互作用精确调节。此外，GATA结合位点位于位
置-230/-227，这对于基础eNOS转录是重要的。在这些顺式元件外，鉴定出
在转录起始上游4.9kB的269NT增强子序列，其功能受核蛋白复合物中的
AP2-、MAZ-、Sp1-和Ets-相关因子调节。然而，上文所描述的转录因子大多
是遍在表达性蛋白质，其不适合于选择性eNOS调节或控制。
可以通过顺式作用RNA元件、钙调蛋白和充当NO合成激活剂的胞内
Ca2+来调节转录后eNOS。此外，通过例如由组胺、VEGF或剪应力诱导的热
休克蛋白90的变构结合，也可以激活eNOS。eNOS活性也可以通过丝氨酸或
苏氨酸残基的磷酸化来调控。所牵涉的蛋白质激酶是例如蛋白质激酶A、蛋
白质激酶C、一磷酸腺苷激活的蛋白质激酶、Ca2+/CaM依赖性蛋白质激酶和
丝氨酸/苏氨酸激酶AKT。Ser1177的磷酸化可以通过剪应力、VEGF和雌二醇
来诱导，而且提高eNOS活性。然而，Thr497的磷酸化招致活性的降低。脱
磷酸化过程由磷酸酶PPA2和PP1介导。
此外，显示了可以通过蛋白质-蛋白质相互作用，例如经由结合G蛋白偶
联受体(例如缓激肽B2受体)的C端域来负影响eNOS活性。在酵母双杂交测
定法中，鉴定出34kDA蛋白质，并将其称为NOSIP(eNOS相互作用蛋白)。
NOSIP结合eNOS的氧域，而且促进酶自胞膜窖(calveolae)移位入胞内区中，
导致NO生成降低。使用eNOS的氧域作为诱饵以鉴定eNOS-相互作用蛋白
NOSTRIN(eNOS运输诱导物)。NOSTRIN的过表达导致eNOS自质膜移位至
血管结构，而且导致降低的NO释放。可以显示，NOSTRIN与eNOS和窖蛋白
-1形成三重复合物。此外，它负责募集介导物蛋白质诸如发动蛋白-2。
已经克隆了人、牛、鼠和猪的内皮细胞eNOS启动子，而且它们显示出
高度序列同源性。eNOS基因由26个外显子组成，并且涵盖染色体7Q35-36上
大约21kB基因组DNA。4052NT eNOS-mRNA在内皮细胞中组成性表达，而
且非常稳定。
在HEBP1外，可以存在eNOS启动子的一种或多种转录因子和/或一种或
多种实现转录需要的上述因子。
本发明的测试系统可以包含细胞，特别是哺乳动物细胞，尤其是人细胞。
合适细胞的例子包括内皮细胞。这些细胞可以是例如原代细胞诸如人脐静脉
内皮细胞(HUVEC)(参见实施例1)或细胞系诸如EA.hy926细胞(参见实施
例1)。然而，可以使用任何其它细胞或细胞系，任选地经过遗传修饰以包含
HEBP1蛋白或效果检测需要的成分。
在本发明的一个优选的方法中，通过荧光来测定效果。合适的方法在上
文详述，并且可以牵涉荧光标志物、FRET、荧光偏振，如本文中所详述的。
在本发明的另一个优选的实施方案中，使用方法来筛选用于预防和/或治
疗牵涉eNOS功能异常的疾病，特别是心血管疾病诸如心肌梗死和/或心力衰
竭的药物。
上文详述了牵涉eNOS功能异常的例示性疾病。然而，心血管疾病，尤
其是心肌梗死和/或心力衰竭是优选的。依照本发明，术语“预防疾病”指降
低形成流行病的风险，而术语“治疗疾病”指改善流行病状况的症状，减缓
病程等。预防或预防性措施是一种首先用于避免损伤、不适、或疾病的方式。
处理或治愈在医学问题已经开始后应用。处理治疗健康问题，而且可以导致
其治愈，但是处理更经常仅仅改善问题，只要继续处理。治愈是完全反转疾
病或永久终止医学问题的处理子集。
本发明的另一个目的涉及一种在受试者中诊断心血管疾病的方法，该方
法包括：
-测定自受试者获得的样品中的HEBP1 mRNA或HEBP1蛋白水平，
其中HEBP1 mRNA或HEBP1蛋白水平相对于对照升高或降低指明心血
管疾病。
如实施例中所显示的，改变的HEBP1蛋白水平与心血管疾病，特别是心
力衰竭和/或心肌梗死有关。因而，可以测定自受试者获得的样品中的HEBP1
mRNA或HEBP1蛋白水平以检测与对照水平(例如来自健康受试者或者在健
康受试者组测定的)不同的水平，其指明上述疾病。
术语“来自受试者的样品”和“测试样品”指自任何给定的受试者，特
别是人分离的所有生物学流体和排泄物。在本发明的上下文中，此类样品包
括但不限于血液、血清、血浆、乳头吸出物、尿液、精液、精液流体、精液
浆、前列腺液、排泄物、泪液、唾液、汗液、活组织检查、腹水、脑脊液、
乳、淋巴、支气管和其它灌洗样品、或组织提取物样品。通常，血液或心血
管组织样品是本发明上下文中使用的优选测试样品。
可以通过一系列方法来测定HEBP1 mRNA或HEBP1蛋白水平，所述方法
包括本文中所描述的，特别是也在本发明筛选方法的上下文中和实施例中所
描述的。
或者，可以使用质谱术。术语“质谱术”指使用电离源来从表面上的样
品生成气相离子，并用质谱仪检测气相离子。术语“激光解吸质谱术”指使
用激光作为电离源来从表面上的样品生成气相离子，并用质谱仪检测气相离
子。用于生物分子诸如HEBP1的质谱术的一种优选方法是基质辅助激光解吸
/电离质谱术或MALDI。在MALDI中，分析物通常与基质材料混合，所述基
质材料在干燥后与分析物共结晶。基质材料自能量来源吸收能量，否则所述
能量来源会碎裂不稳定的生物分子或分析物。另一种优选的方法是表面增强
激光解吸/电离质谱术或SELDI。在SELDI中，分析物应用的表面在分析物捕
捉和/或解吸中发挥积极作用。在本发明的上下文中，样品包括可以已经经历
层析或其它化学加工的生物学样品和合适的基质底物。
在质谱术中，“表观分子量”指检测离子的分子量(按道尔顿计)比电
荷值，即m/z。表观分子量如何推导取决于所使用的质谱仪类型。凭借飞行
时间质谱仪，表观分子量是自电离至检测的时间的函数。术语“信号”指由
所调查的生物分子产生的任何响应。例如，术语信号指由撞击质谱仪检测器
的生物分子所产生的响应。信号强度与生物分子的量或浓度相关联。信号以
两种数值定义：如所描述的那样产生的表观分子量数值和强度数值。质量值
是生物分子的基本特征，而强度数值与具有相应表观分子量数值的生物分子
的某种量或浓度一致。如此，“信号”总是指生物分子的特性。
或者，可以使用本领域技术人员已知的常规技术来获得并量化HEBP1
在测试样品中的存在和量。例如，用于量化测试样品中的抗原或抗体的方法
是本领域技术人员公知的。例如，可以使用免疫测定法来测定HEPB1在测试
样品中的存在和量化。免疫测定法通常包括：(a)提供特异性结合生物标志的
抗体(或抗原)；(b)使测试样品与抗体或抗原接触；并(c)检测与测试样品中
的抗原结合的抗体的复合物或与测试样品中的抗体结合的抗原的复合物的
存在。实施例中描述了例示性的抗体。然而，可以依照熟练从业人员已知的
方法来生成备选的抗体。
提供抗体后，可以使用许多公认的免疫学结合测定法之任一种来检测和
/或量化HEBP1。可以在本发明中使用的测定法包括例如酶联免疫吸附测定
法(ELISA)(其又称为“三明治式测定法”)、酶免疫测定法(EIA)、放射性免
疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)、化学发光免疫测定法(CLIA)、计数
免疫测定法(CIA)、过滤介质酶免疫测定法(filter media enzyme immunoassay，
MEIA)、荧光联接免疫吸附测定法(fluorescence-linked immunosorbent assay，
FLISA)、凝集免疫测定法和多重荧光免疫测定法(multiplex fluorescent
immunoassay)(诸如LuminexTM LabMAP)等。关于通用免疫测定法的综述，
还可参见Methods in Cell Biology：Antibodies in Cell Biology，第37卷(Asai编
1993)；Basic and Clinical Immunology(Stites和Terr编，第7版1991)。
一般地，可以使自受试者获得的测试样品与特异性结合抗原的抗体接
触。任选地，可以将抗体固定至固体支持物，之后使抗体与测试样品接触以
便于清洗和随后分离复合物。固体支持物的例子包括例如微量滴定板、玻璃
显微镜载玻片或盖片、棒(stick)、珠、微珠形式的玻璃或塑料。
将样品与抗体一起温育后，清洗混合物，并可以检测形成的抗体-抗原
复合物。这可以通过将清洗的混合物与检测试剂一起温育来实现。此检测试
剂可以是例如用可检测标记物标记的二抗。就可检测标记物而言，可以使用
本领域中已知的任何可检测标记物。例如，可检测标记物可以是放射性标记
物(诸如例如3H、125I、35S、14C、32P、和33P)、酶标记物(诸如例如辣根过
氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光标记物(诸如
例如，吖啶酯(acridinium ester)、吖啶硫酯、吖啶磺酰胺、菲啶酯
(phenanthridinium ester)、鲁米那(luminal)、异鲁米诺(isoluminol)等)、荧光标
记物(诸如例如荧光素(例如，5-荧光素、6-羧基荧光素、3’6-羧基荧光素、
5(6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、
罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、量子点(例如，硫化锌加帽的硒化镉)、
测温标记物、或免疫聚合酶链式反应标记物。
贯穿整个测定法，试剂的每次组合后，可以需要温育和/或清洗步骤。温
育步骤可以自约5秒变化至数小时，优选地自约5分钟至约24小时。然而，温
育时间会取决于测定形式、生物标志(抗原)、溶液体积、浓度等。通常，
会在环境温度实施测定法，尽管它们可以在温度范围诸如10℃至40℃里进
行。
优选地，自受试者获得的样品中的HEBP1 mRNA或HEBP1蛋白水平相对
于对照是降低的。
样品可以是适合于检测HEBP1 mRNA或HEBP1蛋白水平变化的任何样
品。然而，优选地，在心血管样品诸如内皮细胞，特别是心血管系统的内皮
细胞，或心细胞中测定水平。
如本文中所详述的，eNOS功能异常和HEBP1变化在心血管疾病方面是
特别相关的。优选地，心血管疾病是心力衰竭和/或心肌梗死。
依照本发明，可以使用HEBP1来鉴定用于预防和/或治疗牵涉eNOS功能
异常的疾病，特别是心血管疾病的药物。因此，本发明的另一个主题涉及
HEBP-1用于鉴定用于预防和/或治疗牵涉eNOS功能异常的疾病，特别是心血
管疾病的药物的用途。
然而，由于内皮细胞中的氧化氮减少所致的内皮功能异常是血管疾病的
主要机制之一，而且经常导致动脉粥样硬化。这在糖尿病、高血压或其它慢
性病理生理学状况患者中是非常常见的。因而，可以在预防或治疗与内皮功
能异常有关的慢性病理生理学状况诸如糖尿病或高血压的副作用中使用调
控剂。
优选地，药物改变，优选地提高eNOS表达。
还是依照本发明，可以使用HEBP1来检测eNOS信号转导的成分。因此，
本发明的又一个主题涉及HEBP-1用于检测eNOS信号转导成分的用途。可以
使用实施例中所描述的方法诸如使用HEBP1作为诱饵、蛋白质微阵列、
siRNA、报告系统、质谱术、亲和纯化、SDS PAGE等来实施别的成分的检
测(特别参见实施例1和2，其中要使用HEBP1作为诱饵)。在这些方法中，
优选地，HEBP1是人HEBP1。可以使用HEBP1以检测尚不知晓的结合配偶和
/或上游或下游信号转导的成分。根据成分，可以使用上文在本发明筛选方法
的背景中描述的方法以量化或检测要检测成分的效果。
本发明的又一个主题涉及HEBP1用于调节eNOS启动子活性的用途。依
照本发明，可以使用HEBP1以调节eNOS启动子活性。调节包括提高、促进
降低、抑制、和阻断eNOS启动子活性。可以使用eNOS启动子活性的调节以
调节细胞、组织或器官中的eNOS表达。任选地，别的成分可以牵涉调节诸
如特异性调节HEBP-1或eNOS启动子的化合物诸如AVE3085、AVE9488或物
质9257(参见实施例)。然而，eNOS启动子也可以与不同基因(例如报告基
因或任何其它基因)可操作连接(例如通过遗传工程化改造进行)以通过
eNOS启动子和HEBP1来调节所述基因的表达。这可以进行使用以为了研究
目的、医学目的或任何其它目的而模拟心血管(特别是内皮)细胞中的eNOS
表达。例如，可以在心血管疾病的模型中使用此构建体以研究eNOS表达或
eNOS启动子活性及其调节。可以使用eNOS启动子和HEBP1作为具有基础活
性的诱导型或组织特异性启动子，如熟练从业人员已知的。
本发明不限于本文中所描述的具体方法、方案、和试剂，因为它们可以
有所变化。此外，本文中所使用的术语仅为了描述具体的实施方案，而并不
意图限制本发明的范围。如本文中和所附权利要求书所使用的，单数形式“一
个”、“一种”、和“所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。类
似地，词语“包含”、“含有”和“涵盖”应当包含性而非排他性解释。
除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语和任何首字母缩略
词与本发明领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然可以在本
发明的实践中使用与本文中所描述的方法和材料相似或等同的任何方法和
材料，但是本文中描述了优选的方法和材料。
本发明通过以下附图和实施例进一步例示，尽管应当理解附图和实施例
仅为了例示而包括在内，而且并不意图限制本发明的范围，除非另有具体指
明。
附图简述
图1显示了在mRNA水平验证不同HEBP1-siRNA。EA.csr03细胞(96孔
形式，n＝4)转染后24小时通过定量RT-PCR用特异性探针来测定相
对于GAPDH标准化的相对HEBP1表达(*p＜0.05对siLV2-对照)。siRNA
HEBP125能够抑制HEBP1基因转录。
图2显示了使用siRNA关闭HEBP1和随后测量AVE3085的启动子激活。以
96孔形式(n＝4)实施此实验。相对于总细胞蛋白质含量标准化测量的化学发
光。siRNAHEBP125能够抑制eNOS启动子激活。
图3显示了通过色氨酸猝灭进行的氯高铁血红素和PPIX对人
6xhis-HEBP1的结合研究。以30nM至10μM的浓度向0.5μM HEBP1溶液添加
血红素和PPIX。10分钟温育后，测量色氨酸荧光(λ激发＝295nm/λ发射＝340nm)。
显示了6次实验的均值±SD，*p＜0.05对30nM氯化高铁血红素/PPIX。血红素
和PPIX能够以剂量依赖性方式猝灭人6xhis-HEBP1的色氨酸荧光。
图4显示了来自色氨酸猝灭测量的eNOS转录增强剂9257对氯化高铁血
红素结合6xHis-huHEBP1的影响。将0.5μM HEBP1溶液与9257(10μM)一起
在冰上预温育10分钟。以不同浓度添加血红素后，测量色氨酸荧光(λ激发
＝295nm/λ发射＝340nm)。显示了6次实验的均值±SD，*p＜0.05对DMSO对照。
9257影响血红素对6xhis-HEBP1的结合。
图5显示了通过荧光偏振测量调查A300对HEBP1的特异性结合。于室温
将物质A300(30nM)与多个浓度的6xhis-HEBP1或BSA一起温育10分钟。随
后，测量荧光偏振(λ激发＝530nm/λ发射＝585nm)。显示了5次实验的均值±SD，*
p＜0.05对没有蛋白质的DMSO对照。eNOS物质A300特异性结合
6xhis-HEBP1。
图6显示了心肌梗死后患有慢性心力衰竭的大鼠的心脏组织中的
HEBP1预测表达。将大鼠分成三组。对一组进行假手术(组1)，而在组2
和组3中，通过心肌梗死诱导慢性心力衰竭。仅后一组用AVE3085(10mg/(kg
天))处理9周。随后，在心脏组织中测量mRNA表达(HEBP1与GAPDH相比)。
显示了7次实验的均值±SD，*p＜0.05对假手术的。此实验提示了HEBP1牵涉
慢性心力衰竭的发病机制。
实施例
实施例1
使用亲和层析纯化潜在的eNOS靶物
以如下方式进行潜在靶蛋白的亲和纯化的原理，其中依赖化学偶联(所
谓的接头)将要纯化其靶蛋白的药效团在基质上固定化。若将来自细胞培养
物的蛋白质溶胞物添加至特定的亲和材料，则药效团充当一种“诱饵”，并
“钓出”对药效团具有亲和力的蛋白质。在本工作中使用此方法来纯化/扩增
靶分子。使用药效团的活性和无活性构象的特定柱材料(参见下文)。使用3
x107个EA.csr03细胞(参见下文)来进行亲和层析，并于-70℃以细胞沉淀物
贮存。为了溶胞，将沉淀物在具有0.5％Tween 20的DPBS缓冲液(1ml/100mg
细胞沉淀物)中重悬，并超声破坏(3x30秒，脉冲5，强度20％)。通过显
微术实现细胞溶胞的控制。通过两个离心步骤(首先以1000xg/4℃的10分
钟，然后以70000xg/4℃的30分钟)来分开细胞碎片。通过BCA方法来测定
上清液中的蛋白质浓度。自3x107个获得大约5mg蛋白质。
随后在特异性、Sepharose偶联的柱材料上用EA.csr03细胞溶胞物实施制
备亲和层析，并通过质谱术鉴定结合的蛋白质。数个清洗步骤后，通过添加
SDS来洗脱结合的蛋白质，并使用聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离。凝胶的银染
色后，将所有洗脱蛋白质的全部痕迹切成大约60块凝胶。将这些单独地用胰
蛋白酶消化成蛋白质片段，在C18-柱上分离，并使用MS-MS/MS来鉴定。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是一种可以依照其分子量分离各
种蛋白质的凝胶电泳方法。此可能性源自将阴离子型表面活性剂十二烷基硫
酸钠(SDS)添加至要分离的蛋白质混合物。SDS附着至蛋白质，并掩盖蛋白
质的固有电荷。形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，具有大约1.4g SDS/g蛋
白质(约1分子SDS/3个氨基酸)的恒定荷质比。经由再加热样品，破坏蛋白
质的二级和三级结构。另外，将还原剂(例如β-巯基乙醇和DTT)添加至样
品以切割二硫桥。SDS-PAGE中所使用的分离介质是聚丙烯酰胺的凝胶基质，
其源自丙烯酰胺与亚甲基双丙烯酰胺的交联。在应用电场后，SDS-蛋白质复
合物迁移通过分离基质，并经由所谓的“分子筛效应”依照其大小分离。
为了生成不同细胞样品来进行凝胶电泳，用DPBS(37℃)小心地清洗细
胞两次，然后用1x SDS样品缓冲液(50mM Trizma碱(pH 6.8)、1.6％(w/v)
SDS；4％(w/v)甘油、0.01％(w/v)溴酚蓝、5％(v/v)β-巯基乙醇、325U
蛋白质抑制剂和至10ml的水)裂解。然后，添加酶
并于37℃摇动样品15分钟。是一种经遗传工程化改造的内切核酸
酶，其降解细胞溶胞物中的RNA和DNA，如此相当大地降低样品的粘度，而
且确保蛋白质混合物在电泳中更好的分离。然后，通过于70℃加热20分钟来
使蛋白质样品变性。将样品直接在电泳中使用或者于-20℃贮存，直至使用。
在关于MAP激酶的磷酸化状态的实验中，另外将比率1∶100的磷酸酶抑制剂
(混合物1和2)添加至DPBS和样品缓冲液。采用来自Invitrogen(Karlsruhe，
德国)的Midi凝胶系统来进行凝胶电泳。凭借此现成的凝胶系统，有
可能应用每块凝胶多至26个样品。另外，在相关的XCell4 SureLockTM Midi-
细胞室中，多至四块凝胶可以同时进行电泳。使用具有26个样品袋的4-12％
Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶。它们是所谓的“梯度凝胶”，即聚丙烯酰胺浓度随
着分离路径增加而升高，并且如此容许同时分离小的和大的蛋白质。在所有
实验中，还运行合适的蛋白质标准品以评估所调查的蛋白质的分子量。根据
要求的分离范围，在MES-SDS与MOPS-SIDES运行缓冲液间进行选择。另外，
将每块凝胶435μl抗氧化剂添加至上部室的运行缓冲液。然后以
200V的恒定电压实施凝胶电泳，在MES-SIDES运行缓冲液的情况中持续40
分钟，而在MOPS-SIDES运行缓冲液的情况中持续55分钟。
对于蛋白质凝胶的银染色，用银溶液对蛋白质染色典型地基于如下原
理，即Ag+离子与谷氨酸、天冬氨酸、和半胱氨酸残基形成复合物。Ag+离子
的还原给出元素银，生成蛋白质条带的呈褐色的染色。银染色相对于其它方
法(例如考马斯染色)的优点在于方法的高灵敏度。如此，即使自5ng蛋白
质/0.5cm条带开始的蛋白质量也可以被显现，这尤其对于定性研究是相当大
的优点。为了在聚丙烯酰胺凝胶中定性分析蛋白质，使用来自公司Pierce
(Rockford，USA)的染料试剂盒II遵循制造商的标准指令来实施
银染色。此规程的原理基于依靠乙醇乙酸溶液(30％(v/v)乙醇，10％(v/v)
乙酸)固定凝胶中的蛋白质。这之后与银盐溶液一起温育，并将银离子还原
成元素银，其对蛋白质条带染色。
“Western印迹”意指在凝胶电泳中分离后将蛋白质转移至聚合物支持物
层。因此，使蛋白质对于随后免疫检测中的抗体而言更容易接近。基本上，
多种聚合物作为支持物材料是合适的，例如尼龙、PVDF和硝酸纤维素。垂
直应用于凝胶和膜的电压引起蛋白质自凝胶迁移至膜。在此过程中保留前述
分离的条带样式。在用硝酸纤维素作为支持物材料的所使用的印迹方法中，
蛋白质与膜的结合基于疏水性。为了制备供凝胶电泳后的印迹用的凝胶，将
其在2x转移缓冲液(50ml 20x转移缓冲液、50ml甲醇、500μl
抗氧化剂和至500ml的水)中平衡20分钟。将硝酸纤维素膜用水短
暂清洗，并与2x转移缓冲液中的每块凝胶的6片滤纸一起温育。转移自身在
“半干印迹仪(Semi-Dry-Blotter)”(Biostep，Jahnsdorf，德国)中实施。按“三
明治式原理”将凝胶和膜在上方和下方的浸渍滤纸之间包埋，并将20V的恒
定电压应用60分钟。
在先前的研究中，两种具有相关结构的小分子量化合物以浓度依赖性方
式增强eNOS启动子活性：
AVE9488：4-氟-N-茚满-2-基-苯甲酰胺；CAS NO.：291756-32-6
AVE3085：2，2-二氟-苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-羧酸茚满-2-基酰胺；CAS
NO.：450348-85-3
使用AVE3085作为“诱饵”来鉴定潜在的靶物。使用亲和层析来合成用
于富集潜在靶物的4种不同柱材料(表1)。对于合成，将药效团与N-羟基琥
珀酰亚胺酯(NHS)活化的Sepharose起反应，并经由醚桥的形成来共价结合。
通过与乙醇胺的反应来使尚未饱和的NHS-Sepharose结合位点饱和。
表1：用于自细胞溶胞物富集eNOS转录增强剂的潜在靶物的亲和材料
符号●表示Sepharose颗粒
物质A095是在接头上没有药效团作为“诱饵”的柱材料。此对照的目的
是鉴定并排除潜在靶分子列表中非特异性结合柱材料的蛋白质。
在其它柱材料中，经由接头将药效团与Sepharose颗粒共价偶联。如此，
物质A093是一种经由具有三个聚酰胺连接的接头偶联药效团与基质的材料。
在材料A092和A094的情况中，此接头稍微长些，因为它具有额外的醚连接。
此外，药效团在物质A092中处于活性构象，而在A094中处于无活性构象。
用所有四种柱材料来实施自EA.csr03细胞的全细胞溶胞物亲和纯化潜在
的靶蛋白，并在胰蛋白酶裂解后，依靠质谱术鉴定如此富集的蛋白质。另外，
然而，还测定EA.hy926细胞和HUVEC中的表达。
EA.csr03细胞是稳定的eNOS-启动子萤光素酶细胞系的细胞。它通过用
萤火虫萤光素酶报告构建体(其中添加3.5kb eNOS启动子片段)转染
EA.hy926细胞来获得。用具有补充有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10％
FCS和0.4mg/ml遗传霉素作为选择抗生素的GlutaMAXTM I的IMDM实施这些
细胞的培养。EA.hy926细胞是稳定的人细胞系，其通过融合HUVEC与人杂
交瘤细胞系A549获得。此细胞系以表达特定的内皮细胞标志物，例如
“van-Willebrand因子”为特征。所使用的细胞是传代32的Cora Jean Edgell
的初始培养物。将细胞在具有补充有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、HAT
Hybri-MaxTM培养基添加剂(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)和Biotect保护介
质的GlutaMAXTM I的IMDM中培养。
潜在的靶分子的列表包括下列蛋白质：
-其明确鉴定为具有至少四个蛋白质片段；
-其不结合没有作为“诱饵”提供的任何药效团的柱材料；
-其优先结合具有活性构象的药效团的柱材料。
表2显示了如此获得的潜在靶物的整理过的列表。对于每种鉴定的蛋白
质，此表显示了UniProtKB/Swiss-Prot数据库的唯一登录号、理论分子量和其
鉴定出的蛋白质片段数目。
表2：通过亲和层析，接着为质谱术鉴定的eNOS转录增强剂的潜在靶物
除血红素结合蛋白1(HEBPl)外，所列出的蛋白质是专门结合柱材料的
活性构象的蛋白质。HEBP1也以单一蛋白质结合柱材料的无活性构象。然而，
在此实验中，相对于活性构象上的18，其仅可以鉴定为具有两个蛋白质片段。
实施例2
使用蛋白质微阵列鉴定潜在的靶蛋白
使用v3.0(Invitrogen，Karlsruhe，德国)来实施蛋白质-
微阵列实验。这些是经硝酸纤维素包被的玻璃板，其上固定化有一式两份的
大约5000种重组人蛋白质。
为了使用所述微阵列调查eNOS化合物的亲和力，使用经生物素标记的
eNOS转录增强剂A012(活性构象)和A012(无活性构象)，并使用经
680标记的链霉亲合素通过荧光测量来检测并量化这些物质对蛋白
质的结合。
在第一步中，于4℃将微阵列与具有0.1％(v/v)Igepal和1％(w/v)BSA的
MOPS封闭缓冲液一起温育1小时。然后，于4℃在不进行摇动的情况中在多
种测试条件中在具有1％(v/v)Igepal和1％(w/v)BSA的MOPS样品缓冲液中
将阵列与经生物素标记的eNOS转录增强剂A012和A013一起(有时在存在未
标记的物质9257的情况中)的温育90分钟。
物质9257
在冰上用纯MOPS样品缓冲液清洗三次(每种情况中持续1分钟)后，也
在冰上远离光地将它们与在MOPS样品缓冲液中稀释1/1000的经680
标记的链霉亲合素一起温育30分钟。专门使用经680和800标
记的二抗(其识别一抗的恒定Fc部分)来免疫检测某些蛋白质。本文所使用
的荧光标记拥有在用激光激发后以近红外(波长λ＝700-800nm)发射的特性。
此波长范围的优点是由于低固有荧光所得的非常好的信噪比。检测采用来自
LI-COR Biosciences(Bad Homburg，德国)的ODYSSEYTM。凭借此仪器，
有可能同时检测一张膜上的两种发射波长。经由同时检测靶蛋白和参照蛋
白，个别样品的标准化在仅一步中是有可能的。用含0.1％(v/v)Igepal的PBS
再进行三次清洗步骤(每次1分钟)，接着用ODYSSEYTM(LI-COR
Biosciences，Bad Homburg，德国)检测。
转移后，将膜在用PBS进行1∶1稀释的ODYSSEY封闭缓冲液中封闭1小
时。此步骤的目的是使膜上的任何剩余的游离蛋白质结合位点饱和，并且因
此阻止非特异性抗体结合。于4℃将膜与抗体结合缓冲液(ODYSSEY封闭缓
冲液(用PBS进行1∶1稀释)、0.25％(v/v)Tween 20、0.02％(w/v)叠氮化钠)
中的1-2种一抗一起温育过夜。用PBST(具有0.1％ Tween 20的PBS)清洗膜
(4x5分钟)以除去未结合的抗体，接着与二抗一起温育。与抗体结合缓冲
液中的二抗一起温育1小时(避光，室温)后，用PBST将膜再清洗4x5分钟，
接着进行检测。
为了能够使用这些微阵列来调查eNOS化合物的亲和力，这些化合物必
须直接标记，或者必须有可能间接标记它们。在我们的实验中，以活性(A012)
和无活性构象(A013)使用经生物素标记的eNOS转录增强剂(表3)。这些可
以经由经680标记的链霉亲合素与物质的生物素残基的高亲和力结
合得到的荧光检测。
表3：在蛋白质-微阵列实验中使用的经生物素标记的eNOS转录增强剂的
结构式
为了能够在蛋白质-微阵列实验中使用经生物素标记的eNOS物质A012
和A013，有必要确保生物素残基不干扰药效团的作用，而且有足够的活性。
出于此目的，实施eNOS转录测试中的物质的细胞确认。比较物质A012与参
照物质AVE9488，明显的是，尽管引入具有生物标记的接头，A012
(EC50＝1.2μM)甚至比参照AVE9488(EC50＝3.0μM)略更具细胞活性。经生物素
标记的物质A013(无活性构象)现在几乎没有任何显著的细胞活性(细胞
EC50＞10μM)。如此，两种物质A012和A013适合于在蛋白质-微阵列标记实验
中使用。
在蛋白质-微阵列实验中，将每种情况中的一个阵列在三种不同条件中
温育：A有活性的经生物素标记的eNOS物质A012(100μM)、B在存在有活性
的未标记的物质9257(25μM)情况中的A012(100μM)、和C无活性的经生物素
标记的物质A013(100μM)。
用有活性的经生物素标记的物质A012标记三种不同蛋白质重复(A：编
号1-3)是容易辨别的。用物质9257(B)检查相关竞争实验显示了A012的结合
明显较弱，因为它已经被9257自结合替换。在将微阵列与无活性的经生物素
标记的物质A013一起温育时，没有该物质与先前已经用有活性的生物素-物
质标记的蛋白质(C)的结合。
通过量化荧光信号来评估这些标记(A)和竞争测试(B)。竞争可以得到证
明的蛋白质作为潜在的靶物包含在列表中(表4)：
表4：来自蛋白质-微阵列实验的潜在的靶蛋白
因为所调查的蛋白质是专门通过重组技术生成的，没有可能证实其功能
性。因为专门通过结合亲和力鉴定这些蛋白质，它们需要作为可能的靶蛋白
的功能验证。
实施例3
来自亲和层析和蛋白质-微阵列实验的潜在靶物的验证
1.内皮细胞中来自亲和层析的潜在靶物的表达谱
在多种类型的内皮细胞中在mRNA水平构建所有潜在靶物的全面表达
谱，以容许更好地评估亲和层析中富集的蛋白质的相关性。此调查基于如下
的想法，即与细胞中大量存在的蛋白质相比，表达较差的蛋白质在柱材料上
的富集可以指明更高的结合特异性。出于此目的，使用定量RT-PCR和特异
性探针来测定所有潜在靶蛋白的表达。
TaqMan探针的概述
TaqMan探针获自Applied Biosystems(Darmstadt，德国)。供应商指明探
针杂交的序列，而非所披露的引物的序列。
在定量逆转录酶实时PCR(定量RT-PCR)中，在反应设置中相继实施逆
转录和实时PCR。将两种逆转录酶(Omniscript/Sensiscript逆转录酶)和
HOTStarTaq DNA聚合酶的酶混合物添加至此。在反应开始时，DNA聚合酶
仍处于无活性形式，并且mRNA向cDNA的逆转录仅于50℃发生。然后，使
逆转录酶失活，并于95℃将DNA聚合酶热激活，接着为cDNA扩增步骤。
依靠序列特异性引物对和经荧光标记的寡核苷酸探针(所谓的
探针)来量化实时扩增的cDNA。这在两种引物间的扩增过程中附着至DNA。
用荧光染料在一端标记探针，而在另一端用猝灭剂标记。在PCR开
始时不能检测出基于荧光共振能量转移(FRET)的荧光。然而，若在扩增过程
中，Taq聚合酶接近探针，则这在双链上展现出5’→3’外切核酸酶活性。将探
针切割，因此，分开荧光团与猝灭剂。此过程导致可检测的荧光，其与所形
成的PCR产物成比例升高。
96孔形式中的典型20μl反应设置一般由10μl 2x Quantitect RT
Mastermix、1μl 20x测定混合物(来自Applied Biosystems的TaqMan探针和引
物)、0.2μl RT混合物、5μl RNA和3.8μl无核酸酶的水组成。在来自
BioRad-Laboratories(Munich，德国)的PCR检测系统中依照以下扩
增方案实施反应：
通过相对于未调节基因GAPDH(“持家基因”)的mRNA量的标准化和
ΔΔct方法计算来实施靶mRNA的量化。此方法基于荧光阈值(ct)相对于开始时
间(此时仍没有PCR产物存在)时的背景荧光的计算。因此，如下计算限定
的靶基因对相对于GAPDH标准化的未刺激对照的相对表达：
Δct＝ct靶基因-ctGAPDH
ΔΔct＝ct样品-ct对照
2-ΔΔct＝x-倍数表达
所使用的细胞样品主要是来自未处理的EA.csr03细胞的RNA制备物，所
述未处理的EA.csr03细胞的溶胞物也已经在亲和层析中使用。比较表达谱与
EA.hy926和原代HUVEC的表达谱。通过标准方法为每次实验新鲜制备原代
人脐带内皮细胞(HUVEC)，并且仅使用多至传代3。这些细胞的生长培养基
由具有GlutaMAXTM I(其补充有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和20％
FCS)的IMDM组成。在经胶原I包被的细胞培养材料上于37℃和5％ CO2实
施培养。
将对潜在靶物找到的表达放入三种种类中(表5)。
表5：来自亲和层析的潜在靶物的表达谱
三种不同种类中的分类基于与GAPDH相比的个别靶物的表达：高表达
＞0.015，中等表达为0.005-0.015，而低表达＜0.005。
就层析中所使用的EA.csr03细胞系而言，对所调查的IDH3A、PPP2CA、
GLO1、HTATIP2和HEBP1基因找到高表达。还对PIR、PDXK、LGALS3、
MAPK3和ADK注意到中等表达水平，并且仅对PTCD1和PCBP3获得非常低
的表达。
若我们比较个别基因在报告细胞系EA.csr03、其亲本细胞系EA.hy926和
原代HUVEC间的表达水平，则一般没有找到差别。仅对于PIR和MAPK3，
在细胞系中找到与原代HUVEC相比较低的表达。
2.内皮细胞中来自蛋白质-微阵列实验的潜在靶蛋白的表达谱
蛋白质-微阵列上的蛋白质(参见上文)专门是重组蛋白。因此，验证
它们中的哪些在内皮细胞中表达是重要的。出于此目的，相对于来自未处理
的EA.csr03细胞、EA.hy926细胞和原代HUVEC的RNA制备物中的GAPDH，
通过定量RT-PCR测定潜在靶物的相对表达。表6中呈现了结果。
表6：来自蛋白质-微阵列实验的潜在靶物的表达谱
三种不同种类中的分类基于与GAPDH相比的个别靶物的表达：高表达
＞0.015，中等表达为0.005-0.015，而低表达＜0.005。
大多数潜在靶物的表达在所调查的内皮细胞类型中是低的(TBPL1、
TFEB、MAPK7、PSAT1)。仅对PRKAA1找到中等表达，而对CMAS找到高
表达。
在此实验中，除了一个例外(PSAT1)，细胞系与原代HUVEC间的个别靶
物的表达水平没有差别。
3.使用siRNA技术验证潜在靶物
亲和层析和蛋白质-微阵列实验产生总共18种潜在靶蛋白的整理过的列
表。这些蛋白质的鉴定基于在无细胞系统中对多种eNOS转录增强剂的亲和
力。出于此原因，所有候选物进行进一步的细胞验证。
RNA干扰(RNAi)指对动物和植物中的一些基因的序列特异性、转录后抑
制，其由与靶基因同源的双链RNA(dsRNA)启动。在秀丽隐杆线虫
(Caenorhabditis elegans)和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中，胞质RNA
酶III样蛋白“Dicer”对长的序列特异性dsRNA的分解可以鉴定为RNAi基于
的机制。存在有具有19-25nt长度的短片段(所谓的“小干扰RNA(siRNA)”)
的形成。然后，将所得的siRNA掺入称作“RNA诱导的沉默复合物”(RISC)
的RNA-蛋白质复合物中，并起随后RNA降解的介导物的作用。两条siRNA
链的分开产生RISC的活化。活化的复合物现在能结合同源mRNA，并在离
siRNA的3’端大约12个核苷酸处将其切割。
在本工作中，RNAi技术代表一种用于验证eNOS转录增强剂的潜在靶分
子对eNOS启动子的影响的关键技术。siRNA分子的转移采用阳离子脂质体配
制剂，对于HUVEC为而对于EA.hy926或EA.csr03为
LipofectamineTM2000。这些拥有在其带正电荷的表面上复合带负电荷的核酸
的特性。由于脂质体的脂质样性质，这些能够与细胞膜相互作用，而且将复
合的核酸转移入细胞中。
为了内皮细胞中的siRNA的脂质体转染，在96孔板中在100μl生长培养基
的体积中以每孔50000个细胞的密度接种EA.hy926或EA.csr03细胞。在培养
箱中温育24小时后，用无菌DPBS清洗细胞，并在每种情况中用100μl/孔无血
清且无抗生素的特殊培养基Opti-I覆盖。然后，依照制造商的指令将
所使用的siRNA(参见下文)与LipofectamineTM 2000一起预温育，最后将50μl/
孔的转染混合物添加至细胞。除非另有规定，以100nM终浓度使用siRNA。
先前的优化后，使用每孔0.8μl LipofectamineTM 2000来转染EA.hy926细胞，
而对于EA.csr03细胞为0.5μl。将细胞在培养箱中温育了6小时后，用正常的
生长培养基替换转染培养基，并在转染后24-72小时的时帧中实施下一实验
步骤。在经胶原I包被的6孔板中以每孔100000个细胞接种原代HUVEC，并
将其在正常的生长培养基中培养，直至60-70％汇合。转染前，用无菌DPBS
清洗细胞，并在每种情况中用800μl/孔无血清且无抗生素的特殊培养基
Opti-I覆盖。每孔使用6μl终浓度100nM的和siRNA。依照
制造商的指令来实施siRNA和关于HUVEC的预温育。将200μl/孔
转染配制剂添加至细胞后，在培养箱中实施温育达6小时。然后，用正常的
生长培养基替换转染培养基。在转染后24和72小时之间实施随后的实验步
骤。
siRNA的概述
在eNOS启动子报告细胞系EA.csr03中使用siRNA技术来确认所有潜在
靶蛋白的功能相关性。为了在eNOS转录测试中成功使用此技术，对每种靶
候选物使用具有不同靶序列的3-4种商品化siRNA(它们在其在关闭其靶蛋白
的效率方面非常显著地不同)。
为了鉴定最好的siRNA，将这些在EA.hy926细胞中转染(终浓度100nM，
除非另有规定)，并在24小时后，将RNA分离并纯化。与GAPDH相比，在
RT-PCR中定量测定各种靶物的RNA的剩余量。若存在针对候选蛋白质的良
好抗体，则在siRNA转染后48小时在不同设置中通过用SDS样品缓冲液溶解
细胞和随后的Western印迹与GAPDH比较分析蛋白质表达。
样品生成的时间点的选择基于先前进行的多种siRNA的动力学调查(数
据未显示)，其中关闭在转染后24小时在mRNA水平上达到其峰值，并在48
小时后由于随后的翻译而在蛋白质水平达到其峰值。
为每种潜在的靶物鉴定最有效的siRNA后，然后在eNOS转录测试中在
EA.csr03细胞中使用它。如此，有可能的是，经由几乎完全关闭这些蛋白质
来调查其在物质诱导的eNOS转录增强中的作用。若所调查的蛋白质在诱导
的eNOS转录增强中具有关键功能，则AVE3085应当不再能够激活eNOS启动
子。
4.所有经验证的siRNA的一般性综述和eNOS转录测试中最有效的
siRNA的确认
测试针对靶蛋白的不同siRNA的效率调查。转染人内皮细胞
(EA.hy926/EA.csr03)后24小时，通过定量RT-PCR来测定各种残留的mRNA。
接着，选择最有效的siRNA，并在eNOS转录测试中使用。转染后48小时用
AVE3085(5μM)将EA.csr03细胞再处理18小时。细胞溶解后，测定萤光素酶
活性和总细胞蛋白质含量。
因为所有siRNA的确认需要使用数块96孔细胞培养板，所以相对于
DMSO对照萤光素酶活性测定AVE3085诱导的报告基因活性。经由关闭
HEBP1，与siLV2对照的2.4倍相比，eNOS启动子现在仅可以显著激活1.6倍。
因此，HEBP1蛋白在AVE3085介导的eNOS转录增强中似乎发挥作用。
在eNOS转录测试中调查并评估所有其它siRNA。表7中汇总了观察到的
对启动子的基础激活状态的影响和对AVE3085诱导的启动子激活的影响。
表7：eNOS转录测试中最有效的siRNA的结果汇总
(*p＜0.05对siLV2对照)
通过siRNA关闭后，仅HEBP1展现出AVE3085的eNOS启动子激活显著降
低，相对于siLV2对照的64％。因此，它是唯一的可以在AVE3085介导的转录
增强方面发挥作为靶物作用的候选蛋白质。
5.有效siRNA的选择及在eNOS转录测试中的用途，以血红素结合蛋白1
(HEBP1)为例
如已经提及的，HEBP1是唯一的在经由siRNA关闭后eNOS启动子不再可
以以与siLV2对照相同的程度激活的蛋白质。因此，应当再次采用HEBP1作
为AVE3085的eNOS转录增强的候选物的例子。
对于eNOS启动子激活的转录测试，在白色96孔细胞培养板中接种每孔
20000个细胞的报告细胞系EA.csr03。24小时后，自DMSO储备溶液开始制
备物质在细胞培养基中的各种稀释，并在水浴上于37℃预温育10分钟。然后，
将这些温育培养基(100μl/孔)添加至细胞。温育18小时后，用DPBS(100μl/
孔)将细胞清洗两次，并添加萤光素酶溶解缓冲液(50μl/孔)。10分钟后，
将溶解的萤光素酶-底物萤光素(100μl/孔)添加至细胞溶胞物。在萤光素酶
催化的萤光素氧化成氧化萤光素的过程中，有化学发光的释放。发射光是萤
光素酶活性的测量，并且因此间接是eNOS启动子激活的测量。在来自Tecan
Deutschland(Crailsheim，德国)的Genios微板读板仪中测量所释放的光单位。
在测量萤光素酶活性前用多种siRNA处理EA.csr03细胞的实验中，有时
由于毒性效应而有细胞数目的略微变化。因此，为了标准化萤光素酶活性，
有必要测定细胞溶胞物的总蛋白质含量。对此，处理后，用100μl/孔DPBS
将细胞清洗两次，并在60μl/孔的具有HEPES(20mM，pH 7.4)、氯化钠(150mM)
和1.1％ CHAPS的CHAPS溶解缓冲液中溶解，并于室温摇动20分钟。对于每
种样品，将15μl此溶胞物取出，转移至蛋白质测定板，并用135μl水以比率1∶10
稀释。用Micro BCA蛋白质测定测试依照制造商的指令来测定总蛋白质含量。
在每种情况中，将45μl浓缩两倍的萤光素酶细胞溶解试剂添加至剩余的45μl
细胞溶胞物/孔，并测定萤光素酶活性，如先前所描述的。
使用GraphPad Prism 4.03软件来实施实验结果的统计学分析。所有结果
以均值+标准偏差呈现。用“Student t检验”来评估结果的显著性。在p值＜0.05
时，认为数据是显著的，并且在图中用“*”或“#”标示。
如在先前所显示的多种siRNA的验证中的，使用定量RT-PCR在mRNA水
平鉴定最有效的HEBP1-siRNA(图1)。在用siHEBP112和siHEBP120处理的
细胞的情况中，在转染后24小时仍可以分别检测出69％和40％
HEBP1-mRNA。比较而言，用siHEBP125处理细胞后，相对于siLV2对照为
10％的残留量的HEBP1-mRNA是非常小的。如此，siHEBP1 25提供了一种对
于在细胞背景中关闭HEBP1非常有效的siRNA，而且非常适合于在eNOS转录
测试中进一步使用。在蛋白质水平验证对于此潜在的靶物而言是不可能的，
因为不可获得功能性抗体。
接着，在eNOS转录测试中采用所使用的测试条件(图2)。在经siLV2处
理的对照细胞中，相对于DMSO对照，AVE3085诱导eNOS启动子2.4倍是有
可能的。然而，若使用siHEBP1 25关闭HEBP1，则相对于siLV2，启动子仅
显著可诱导1.6倍。根据此结果，HEBP1可能是一种在AVE3085介导的eNOS
转录增强中具有中枢作用的蛋白质。
实施例4
血红素结合蛋白1(HEBP1)作为eNOS转录增强的潜在靶物的生物化学验证
血红素结合蛋白1(HEBP1)是唯一的在通过siRNA技术关闭蛋白质后
AVE3085对eNOS启动子的激活降低的候选蛋白质。
用于HEBP1的进一步生物化学验证工作的开始情况是不简单的。在此时
间点商品化的唯一抗体(Abnova GmbH，Heidelberg，德国，产品目录编号
H00050865-A01)在Western印迹中显示相当大的非特异性(数据未显示)。
重组人蛋白质也不是商品化的。因此，进一步验证工作的初始关键是人
HEBP1的重组表达和纯化。
1.人血红素结合蛋白1的表达和纯化
为了改善纯化，给HEBP1提供在N端的6xhis亲和标记，并使用先前克隆
的表达质粒通过重组技术在大肠杆菌(E.coli)中表达。对每次纯化运行使用来
自总共4升大肠杆菌培养物的细胞沉淀物。使用6xhis结合亲和材料
(TALONTM Superflow金属亲和柱)如下文所描述的那样纯化6xHis-HEBP1。
因为人血红素结合蛋白1(HEBP1)是未商品化的，但是作为潜在靶物用
于此蛋白质作为潜在靶物的进一步验证是需要的，所以通过重组技术将其在
大肠杆菌中表达，然后将其分离。为了克隆大肠杆菌的人6xhis-HEBP1的表
达载体，使用PhusionTM热启动高保真度DNA聚合酶依靠可用的哺乳动物表
达载体“huHEBP1-pcDNA3.1”在PCR中扩增人HEBP1基因。经由引物设计
给人HEBP1基因提供在5’端的ecoR1切割位点。所使用的引物是：
正向-EcoR1：
5’-CGTGAATTCGATCAAGAACTCGCTGTTCG-3’ SEQ ID NO：24
反向：
5’-TAAACGGGCCCTCTAGACTC-3’ SEQ ID NO：25
用QIAquick PCR纯化系统分离所获得的PCR产物，并通过定向连接经由
基础载体ChampionTM pET302/NT-His的“多克隆位点”(MCS)中的EcoRI和
XhoI切割位点插入。所使用的基础载体已经在MCS的5’端携带用于6xhis亲和
标记和将想要的蛋白质附着至N端的遗传密码。
将所获得的载体转化入感受态JM109大肠杆菌细胞中，在那里扩增，并
用PureYieldTM质粒制备系统来纯化质粒-DNA。最后，使用
ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies，Wilmington，USA)在2μl体积中
测定DNA的浓度和纯度。
使用6xhis-HEBP1的表达载体来实施人蛋白质6xhis-HEBP1的表达，如所
描述的。为了在大肠杆菌中实现最高的有可能的蛋白质表达，选择化学感受
态菌株BL21StarTM(DE3)。此菌株特征在于RNA酶基因中的一处突变，所述
RNA酶主要负责降解mRNA转录物。由于所得的RNA酶缺陷，积累较大量的
mRNA，如此导致较高的蛋白质产量。对于蛋白质表达，在冰上融化每个转
化批次50μl等分试样的感受态大肠杆菌细胞，并添加5μl体积中的10ng质粒
-DNA。在冰上温育30分钟，接着在水浴上于42℃热休克30秒。然后，立即
将细胞放在冰上，添加250μl S.O.C.转化培养基，于37℃摇动1小时。然后，
在每种情况中，将100μl在氨苄青霉素琼脂平板上铺板，以经由表达质粒上
存在的氨苄青霉素抗性基因来选择经转化的细胞。于37℃将琼脂平板温育过
夜，然后将四个不同克隆在5ml具有羧苄青霉素(50μg/ml)的Luria Bertani培养
基(10g胰蛋白胨；5g酵母提取物；10g氯化钠和至1000ml的水)中接种，并
再培养过夜。在每种情况中，将甘油添加至1ml这些培养物，并将这作为储
用培养物于-70℃贮存。将剩余的4ml预培养物在100ml具有羧苄青霉素
(50μg/ml)的LB培养基中培养，直至于波长λ＝600nm(OD600)光密度为0.6，并
添加1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，即大肠杆菌中的lac操纵
子的一种诱导物。IPTG与阻抑物LacR相互作用，并且因此阻止其结合操纵
子。激活相关基因的转录。IPTG诱导蛋白质表达后，将细胞再培养4小时。
为了收获细胞，于3000xg/4℃将细胞悬浮液分数个部分离心15分钟，除去
培养基，并将沉淀物于-20℃贮存，直至进一步使用。
使用“纯化仪”(GE Healthcare Europe，Freiburg，德国)层析纯
化先前在大肠杆菌中表达的6xhis-HEBP1。用于亲和纯化的柱材料是
TALONTM Superflow金属亲和柱(Clontech Laboratories，Mountain View，
USA)。这是一种如下的亲和材料，在其表面上具有通过螯合剂固定于
Sepharose珠的带正电荷的钴离子。经由组氨酸残基与钴离子的高特异性相互
作用，将提供6xhis标记的重组蛋白可逆地结合至柱材料，并且因此将其富集。
此原理称作“固定化金属亲和层析”(IMAC)。用与组氨酸残基竞争对钴离子
的结合的咪唑洗脱天然的蛋白质。
在每种情况中，使用每克细胞沉淀物20mlxTractor缓冲液来溶
解大肠杆菌细胞。将细胞小心地重悬，并以12000xg/4℃离心20分钟以使溶
胞物澄清。将上清液取出，并流过0.2μM无菌滤器以完全除去所有颗粒。
为了纯化6xhis-HEBP1，将细胞溶胞物应用于TALON柱，预先用磷酸钠
(50mM)和氯化钠(300mM)的平衡缓冲液(pH 7.0)以0.5ml/分钟的流速冲洗。用
10-20个柱体积的平衡缓冲液再清洗该柱，并用含有咪唑的洗脱缓冲液pH 7.0
自柱清洗结合的经6xhis标记的HEBP1，所述洗脱缓冲液pH 7.0由磷酸钠
(50mM)、氯化钠(300mM)和咪唑(150mM)组成。在级分收集器中以2ml部分
收集洗脱物。凭借与柱连接的具有可变波长的UV检测仪，有可能监测细胞
溶胞物的应用和6xhis-HEBP1的洗脱二者。
通过在具有排阻大小10kDa的Amicon管中以4000xg离心来浓缩所获得
的流过物和级分，将它们在每种情况中成对组合。通过在每种情况中用
HEPES(20mM)和氯化钠(100mM)的8ml透析缓冲液pH 7.4冲洗和额外的离心
步骤，另外，实施样品的缓冲液交换，最后浓缩至大约0.5ml的终体积。采
集少量的浓缩物，并制备SDS样品，以通过SDS-PAGE和银染色或Western印
迹来分析。将剩余物立即在随后的实验中使用或者在液氮中快速冷冻，并于
-20℃贮存，直至进一步使用。
为了观察洗脱过程，于波长λ＝280nm和λ＝405nm测量吸收。于λ＝280nm
的吸收是蛋白质的一种通用测量。含有血红素的蛋白质显示额外的于
λ＝405nm的吸收。
仅在某个保留时间后发生添加咪唑后的6xhis-HEBP1洗脱。自级分10开
始，级分的蛋白质和血红素含量有急剧的增加。可以监测主要比例的蛋白质
的洗脱，直至级分16，之后蛋白质含量有连续的降低。自此级分开始，层析
谱于λ＝280nm处显示一种“肩”，其高度继续降低，并且到级分30时几乎已
经回到基础水平。
将所有级分成对组合，然后用20mM HEPES(pH 7.4)和100mM氯化钠实
施缓冲液交换以除去仍存在的任何咪唑。将样品浓缩，并取出少量以生成
SDS样品，剩余物在随后的实验中使用。
将自级分生成的SDS样品进行凝胶电泳。出于对照目的，还应用未结合
蛋白质的柱流过物的样品。然后，平行实施凝胶中的蛋白质的银染色或
Western印迹中的HEBP1的6xhis标记的免疫检测。
在银染色中，相当大量的大约23kDa蛋白质在级分12-28中是可辨别的，
而从级分16看，它处于几乎完全纯的形式。观察到的分子量与HEBP1的21kDa
理论数值一致性良好。具有大小大约40kDa的第二蛋白质条带可辨别为这些
级分中的略微“污染”，并且这可以是HEBP1的二聚物。
在Western印迹中的6xhis-亲和标记的免疫学检测中确认来自银染色的结
果。在级分12至28中检测出非常大量的具有分子量约23kDa的经6xhis标记的
HEBP1。再一次，也用针对6xhis标记的抗体在大约40kDa处检测出略微的“污
染”，这可以进一步指明二聚物的存在。在流过物中，没有6xhis-HEBP1被抗
体识别，即定量发生蛋白质对柱材料的结合。
基于来自银染色和Western印迹的结果，在随后的测试中使用具有
HEBP1纯度＞95％的级分16-28。使用BCA方法来测定个别级分的蛋白质含
量。一般地，从一次纯化获得总共8mg纯化的人6xhis-HEBP1。
2.通过猝灭色氨酸荧光进行的关于6xHis-huHEBP1的结合研究
为了实施与人HEBP1的结合研究，有可能利用色氨酸残基于λ＝340nm的
固有荧光，其使用λ＝295nm的激发波长进行。可以通过空间上接近色氨酸残
基的卟啉的结合来“猝灭”所得的荧光。这导致固有荧光的降低，因此这为
配体结合提供了一种测量。为了优化用于这些猝灭测量的实验条件，首先有
必要评估重组6xhis-HEBP1的光谱学特性。
2.16xhis-HEBP1的光谱学表征
使用光度计得到的HEBP1(35μM)吸收光谱显示了于
λ＝290nm的强烈的主要吸收(数据未显示)。基于此结果，接着，以λ＝290nm
的波长激发HEBP1(0.5μM)的HEPES缓冲溶液，并在多个波长测定所得的发
射。
发射光谱的测量显示了于λ＝340nm波长的最大值。为了构建激发光谱，
在多个波长实施激发，并以λ＝340nm的恒定波长测量发射。此光谱显示了于
λ＝295nm的激发最大值。
人6xhis-HEBP1的光谱学表征与随后于λ激发＝295nm和λ发射＝340nm的色氨
酸荧光测量一致性良好。
2.2氯高铁血红素和原卟啉IX对6xhis-HEBP1的结合
接着，在存在eNOS转录增强剂的情况中通过色氨酸猝灭实施氯高铁血
红素和原卟啉IX(PPIX)结合人6xhis-HEBP1的研究。使用含有的色氨酸残基
的固有荧光来实施与人HEBP1的结合研究。可以经由接近色氨酸残基的卟啉
的结合来“猝灭”用波长λ＝295nm激发后于λ＝340nm发生的荧光。测量的荧
光作为配体浓度的函数降低。使用非线性回归，有可能计算结合参数。
将30nM至10μM浓度的氯高铁血红素和PPIX添加至缓冲HEBP1溶液
(500nM)，并在温育10分钟后，测量色氨酸荧光(图3)。由于在水性系统中
的低溶解度，使用较高卟啉浓度是不可能的。
对氯高铁血红素和PPIX都观察到浓度依赖性荧光降低。数值的非线性回
归给出对于氯高铁血红素的3μM和对于PPIX的13μM的IC50数值。因此，氯高
铁血红素证明为比PPIX有力10倍，并在随后的实验中使用。
2.3eNOS转录增强剂对氯高铁血红素对人6xhis-HEBP1的结合的影响
接着调查eNOS转录增强剂对氯高铁血红素的色氨酸猝灭的影响。在实
验中，将500nM浓度的重组人HEBP1与HEPES(20mM)、氯化钠(100mM)和
DTT(1mM)的结合缓冲液(pH 7.4)中的eNOS物质9257对DMSO对照一起在冰
上预温育30分钟。使用黑色的96孔板作为反应容器。然后，经由添加200倍
浓缩的DMSO储备溶液以不同浓度添加氯高铁血红素或原卟啉IX，并于室温
温育10分钟。最后，先前以λ激发＝295nm和λ发射＝340nm优化后在Safire2微板读
板仪(Tecan Deutschland，Crailsheim，德国)中测量色氨酸荧光。
所使用的原型是物质9257，因为相对于AVE9488和AVE3085，其拥有更
高的效力和水溶解度，并且因此在此测试中导致更少的干扰。
首先，我们调查了物质9257是否能猝灭HEBP1的色氨酸荧光。未能测量
到荧光降低(数据未显示)。因此，经由与氯高铁血红素竞争间接调查9257
的结合。对此，将HEBP1(500nM)与9257(10μM)对DMSO对照一起在冰上预
温育。30分钟后，以0.1-10μM的不同浓度添加氯高铁血红素，并将其于室温
再温育10分钟，之后测量色氨酸荧光(图4)。
图4显示了在与9257一起预温育过程中氯高铁血红素结合曲线向右移
动。通过非线性回归计算这两种曲线的IC50数值给出对于9257的3.4μM对在
DMSO对照情况中的1.1μM。经由9257的存在将IC50数值提高3.1倍。eNOS转
录增强剂9257自结合袋替换氯高铁血红素，而自身不猝灭色氨酸荧光。
色氨酸荧光测试未证明非常适合于更详细的且广泛的调查。因此，我们
接着建立了一种实施eNOS转录增强剂对人HEBP1的结合实验的备选方法。
3.通过测量荧光偏振进行的eNOS转录增强剂对人6xhis-HEBP1的结合
实验
使用荧光偏振方法来实施eNOS转录增强剂对人HEBP1的结合的进一步
研究。出于此目的使用物质A300，并对其共价提供经由接头的罗丹明标记。
若荧光团用线偏振光激发，则它们一般也发射线偏振光。然而，此荧光
偏振的偏转取决于荧光团可以在激发和发射时间间旋转的程度。若荧光团可
以在空间上旋转，并且不固定于结合配偶，则其经由多个角度的固有旋转来
发射“各向同性”线偏振光。然而，若荧光团被固定，并且不再能够旋转，
则其以减小的角度(“各向异性”)发射线偏振光。可以利用此现象来测量经
荧光标记的分子对蛋白质的结合。凭借此测量原理，在测量仪器中激发前，
通过起偏器使入射光线性偏振。在相对于第一起偏器的两个位置(平行的和
垂直的)的第二起偏器(所谓的“检偏器”)中测量发射光的荧光强度I。偏
振P以如下等式限定：
P：偏振
I平行：在起偏器和检偏器彼此平行时测量的荧光强度
I垂直：在起偏器和检偏器彼此垂直时测量的荧光强度
G：加权因子(对于仪器而言特定的因子)
所获得的偏振P是无量纲量，其经常以mP(＝毫偏振单位)表述。
在本工作中，使用荧光偏振方法来进行经罗丹明标记的eNOS物质A300
对重组人6xhis-HEBP1的结合实验。对于样品制备，将HEPES(20mM)、氯化
钠(100mM)和DTT(1mM)的结合缓冲液(pH 7.4)中的多种浓度的物质A300及
6xhis-HEBP1或BSA放在冰上。于室温温育10分钟后，在Safire2微板读板仪
(Tecan Deutschland，Crailsheim，德国)中以激发波长λ＝530nm和发射波长
λ＝585nm测量偏振。对于本文所实施的实验，专门使用具有玻璃底部的黑色
96孔微量滴定板，因为它们的特征在于特别低的背景荧光。
3.1经罗丹明标记的物质A300在eNOS转录测试中的活性
在实际的生物化学实验前，相对于AVE3085作为参照，通过测定测试物
质的浓度效应曲线来对物质A300测试eNOS转录测试中的细胞活性。使用非
线性回归计算出A300的160nM和AVE3085的400nM的EC50值。因此，经罗丹
明标记的eNOS物质A300比参照具有高2.5倍的细胞活性，而且非常适合于在
使用荧光偏振方法的结合实验中使用。
3.2经罗丹明标记的eNOS-物质A300的光谱学表征
首先，在缓冲溶液中记录物质A300(100nM)的吸收光谱，其中以555nm
的波长检测到吸收最大值。
Safire2微板读板仪的技术局限性在于仅四种限定的激发波长可用于测量
荧光偏振。然而，发射的测量在任何想要的波长是可能的。
最接近A300的激发最大值且在Safire2中可用的激发波长是λ＝530nm。出
于此原因，为了后续测量的验证和质量控制，用λ＝530nm激发再次记录发射
光谱。
从记录的光谱看明显的是，即使这不是完全最佳的激发波长，可以以高
灵敏度测量585nm发射。因此，可以使用此系统来实施使用荧光偏振方法的
eNOS物质对人6xhis-HEBP1的结合测试。
3.3通过荧光偏振方法进行的经罗丹明标记的eNOS-物质A300对人
HEBP1的结合研究
在结合研究中，以恒定浓度30nM使用A300作为荧光样品，向其添加增
加浓度的HEBP1。为了通过通用蛋白质结合测定非特异性部分，用相等浓度
的牛血清清蛋白(BSA)来实施平行实验。可以自A300对HEBP1的结合和对
BSA的非特异性结合的差异评估特异性结合的比例(图5)。
A300对HEBP1的结合曲线是一种典型的饱和曲线，随着蛋白质浓度增加
而达到平台。比较而言，对于A300对BSA的结合，获得线性曲线，指明不被
饱和的结合。通过寻找A300对HEBP1或BSA结合的偏振数值的差异，可以计
算曲线，用其可以评估特异性结合的比例。使用非线性回归，可以对A300
对人6xhis-HEBP1的特异性结合计算出11.7μM的KD值。
4.病理学动物模型中的HEBP1表达的初步研究
在另一种背景中，进行动物研究，其中大鼠在诱发心肌梗死后形成慢性
心力衰竭。从来自心脏组织的可用RNA样品，有可能在mRNA水平测定
HEBP1_预测的表达。尚未在大鼠中确认HEBP1基因的序列，是通过与其它
物种的序列比对而鉴定的，因此仍使用名称HEBP1_预测(NM_001108651)。
使用迷你分离方法来实施自所使用的细胞类型分离RNA。在第
一步中，将含有硫氰酸胍和β-巯基乙醇的缓冲液(RLT缓冲液)添加至细胞，
其非常有效地使蛋白质变性，而且特别使RNA酶失活。在每种情况中，将6
孔形式中的细胞样品在600μl溶解缓冲液中溶解，并通过在QIAshredder柱中
以14000xg离心2分钟来降低粘性。通过添加70％(v/v)乙醇，将任何存在的
RNA沉淀，并结合迷你柱的硅土膜。用多种缓冲液进行数次清洗步
骤，接着用50μl无核酸酶的水洗脱纯化的总RNA。在每种情况中，将96孔形
式中的细胞样品用140μl溶解缓冲液溶解，然后在来自Qiagen(Hilden，德国)
的BIOROBOT 8000中依照制造商的指令通过迷你分离方法来将其
分离。使用ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies Inc.，
Wilmington，USA)来测定制备的RNA的浓度和纯度。在这点中，自总体积2μl，
于针对核酸的波长λ＝260nm(A260)测量样品的吸收。根据朗伯-比尔定律
(Lambert-Beer law)依靠消光系数40ng x cm-1 x μl-1来实施测量的吸收向RNA
溶液浓度的转化。通过于波长λ＝280nm(A280)的别的吸收测量来获得关于
RNA纯度的结论，蛋白质、酚或其它杂种吸收所述波长λ＝280nm(A280)。
A260/A280比率应当尽可能接近“纯的”RNA的数值2。然后以比率1∶5稀释
所获得RNA，并立即在定量RT-PCR中使用或者于-80℃贮存，用于进一步使
用。
可以在不除去仍存在的基因组DNA的情况中在定量RT-PCR中直接使用
大多数RNA制备物，因为可用的探针一般在外显子-内含子连接处杂交，并
且因此仅识别所得的cDNA。在不满足此要求的探针的情况中，依照制造商
的指令，用迷你柱上设置的RNase-DNA酶与RNA分离一起实
施DNA酶消化。
对各具有7只动物的三个不同组调查HEBP1_预测表达：一组是假手术
的，即仅打开腹腔，而不诱导心肌梗死。14只动物(各为7只动物的两组)
在诱发心肌梗死后形成慢性心力衰竭。用eNOS转录增强剂AVE3085以
10mg/kg/天的剂量对安慰剂处理一组达9周。
自心脏分离总RNA，并通过定量RT-PCR来测定与GAPDH相比HEBP1-
预测的相对表达(图6)。表达数据显示了在比较在心肌梗死后形成心力衰竭
的动物与经历假手术的组时，HEBP1_预测的表达升高2倍。比较而言，用
AVE3085处理根本不显示对HEBP1_预测表达的任何影响。HEBP1_预测表现
为在此模型的病理学中发挥作用，因为表达被改变。