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1、(10)申请公布号 CN 102253210 A (43)申请公布日 2011.11.23 CN 102253210 A *CN102253210A* (21)申请号 201110151009.9 (22)申请日 2011.06.07 201010191857.8 2010.06.04 CN G01N 33/577(2006.01) G01N 33/531(2006.01) (71)申请人 北京庄笛浩禾生物医学科技有限公 司 地址 100043 北京市石景山区古城西街 33 号 (72)发明人 刘明 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王加岭 张庆敏 (5。
2、4) 发明名称 一种肠道病毒71型 （EV71） IgM抗体检测试纸 条 (57) 摘要 本发明提供了一种用于检测肠道病毒 71 型 (EV71)IgM 抗体的快速检测试纸条。它是在硝酸 纤维膜(NC膜)上包被EV71基因抗原(VAP1)和抗 鼠 IgG， 结合胶体金标记的抗人 IgM 单克隆抗体， 应用膜层析捕获法， 检测感染人标本中 EV71 特异 性 IgM 抗体。应用本发明试纸条检测， 操作简单、 方便、 快速、 简捷， 不需特殊仪器设备， 不需专业 培训， 结果清晰易辨， 操作简单， 易于推广， 适合基 层， 适合于现场检测和早期诊断， 对 EV71 感染诊 断起到辅助作用。 (66。
3、)本国优先权数据 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 CN 102253216 A1/1 页 2 1. 一种检测试纸条， 其特征在于， 它包含 ： (1) 包被 EV71 病毒抗原 VP1 和抗鼠 IgG 两个条带的反应膜 ； (2) 含有胶体金标记的抗人 IgM 单克隆抗体的结合物释放垫。 2. 如权利要求 1 所述的检测试纸条， 其特征在于， 所述反应膜为硝酸纤维素膜。 3. 如权利要求 1 所述的检测试纸条， 其特征在于， 所述结合物释放垫为玻璃纤维膜。 4. 如权利要求 1 或 2 任一项。
4、所述试纸条， 其特征在于， 所述的二抗 IgG 为抗鼠 IgG。 5. 一种制备权利要求 1 4 任一项所述试纸条的方法， 其包括如下步骤 ： 1) 将 EV71 病毒抗原 VP1 以及二抗 IgG 在反应膜上分别形成检测带和质控带， 备用 ； 2) 用胶体金标记抗人 IgM 单克隆抗体， 包被到结合物释放垫中 ； 3) 将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、 吸水垫和反应支持物组装成试纸 条。 6.EV71 病毒抗原 VP1 在胶体金检测试剂中的应用。 7. 权利要求 1-4 之任一所述试纸条在检测 EV71 特异性 IgM 抗体中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102253210 。
5、A CN 102253216 A1/3 页 3 一种肠道病毒 71 型 (EV71)IgM 抗体检测试纸条 技术领域 0001 本发明属于生物检测领域， 具体涉及一种肠道病毒71型(EV71)IgM抗体检测试纸 条及其应用。 背景技术 0002 肠道病毒 71 型 (EV71) 属于肠病毒属 A 型， 是克萨奇病毒 A16(CA16) 的近亲， EV71 的感染可以导致手足口病 (hand， foot and mouth disease， HFMD)、 脑 (encephalitis)、 无 菌性脑膜炎 (asepicmeningitis) 和脊髓灰质炎样麻痹 (poliomyelitis-l。
6、ike paralysis) 等多种与神经系统相关的疾病。目前， 人类是 EV71 病毒唯一已知的自然宿主， 病毒主要通 过人群间的密切接触传播。根据核苷酸序列的差异， 可将 EV71 分为 A、 B、 C 等 3 个基因型， B 型和 C 型又可进一步分为 B1、 B2、 B3、 B4 以及 C1 和 C2 亚型。中国大陆已发现的 7 株 EV71 病毒 (SHZH03、 SHZH98、 SH2F1、 SH2F2、 SH2H25、 SH2H26 和 CHN287) 与 EV71 病毒 C 基因型代 表株比较， 同源性在 89.3 94.6之间， 较为接近， 而与 A、 B 基因型代表株比较，。
7、 则同源 性在 81.3 84.0之间。说明中国大陆的 10 株 EV71 病毒皆属于 EV71 病毒 C 基因型。 0003 EV71 的病毒颗粒为球形结构， 无包膜和突起， 病毒粒子的衣壳组成非常复杂， 首先 由 EV71 病毒基因组编码 4 个外壳蛋白， VP1、 VP2、 VP3 暴露在病毒的表面， 通过拼装成原聚 体和亚单位， 最终形成病毒外壳。蛋白 VP4 则包埋在病毒外壳内侧起连接作用。 0004 VP1、 VP2和VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面， 其抗原表位主要集中于VP1、 VP2 和 VP3 上。VP1 不但具有显著的基因多态性， 而且集中了中和抗原决定簇， 直接影响病。
8、毒的 抗原性。 VP1基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据， 并可作为小RNA病 毒科内不同属的分类参考， 因此 VP1 基因是 EV71 分子流行病学主要的研究内容。 0005 外壳蛋白 VP1 由 891 个核苷酸组成， 存在着 EV71 主要中和抗原表位。因此通过基 因工程获得该抗原的表达蛋白， 并用其作为抗原检测 EV71 的特异性 IgM 抗体。 0006 目前， 手足口病的诊断， 除了依据临床症状外， 实验室诊断是不可缺如的环节。实 验室的诊断标准如下 ： 0007 1) 血液检查的细胞总数一般正常或偏高， 分类时淋巴细胞较高， 中性粒细胞较低。 2) 有中枢神经系统。
9、并发症时， 脑脊液细胞数可增多， 蛋白升高。3) 发病后从粪便、 咽喉漱口 液分离或检测到相关病毒。4) 从脑脊液或疱疹液分离或检测到相关病毒。5) 从早期血清 中检测出相关病毒 IgM 抗体。6) 恢复期血清中和抗体比急性期有 4 倍的增长。 0008 然而到目前为止， 还没有一种能够方便、 快捷检测 EV71 特异性 IgM 抗体的试纸条 的报道。 发明内容 0009 ( 一 )、 要解决的技术问题 0010 发明的目的是提供一种使用方便、 快捷， 用于检测EV71特异性IgM抗体的试纸条， 检测感染患者标本中 EV71 特异性 IgM 抗体， 用于人 EV71 感染的辅助诊断。 说 明 。
10、书 CN 102253210 A CN 102253216 A2/3 页 4 0011 ( 二 )、 技术方案 0012 本发明提供了一种检测试纸条， 它包含以下成分 ： 0013 (1) 包被 EV71 病毒抗原 VP1 和二抗 IgG 两个条带的反应膜 ； 0014 (2) 含有胶体金标记的抗人 IgM 单克隆抗体的结合物释放垫。 0015 上述二抗可以是抗鼠 IgG 二抗， 所述反应膜可以是硝酸纤维素膜， 所述结合物释 放垫可以是玻璃纤维膜。 0016 本发明还提供制备上述试纸条的方法， 其包括如下步骤 ： 0017 1) 将 EV71 病毒抗原 VP1 以及二抗 IgG 在反应膜上分别。
11、形成检测带和质控带， 备 用 ； 0018 2) 用胶体金标记抗人 IgM 单克隆抗体， 包被到结合物释放垫中 ； 0019 3) 将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、 吸水垫和反应支持物组装成试 纸条。 0020 本发明还公开了所述试纸条在检测 EV71 特异性 IgM 抗体的应用。 0021 本发明方案是 ： 采用高纯度的纯化的EV71基因工程抗原VP1和抗鼠IgG分别固相 于硝酸纤维膜上 (NC 膜 )， 结合胶体金标记的抗人 IgM 单克隆抗体， 应用膜层析捕获法的原 理检测人标本中的 EV71 特异性 IgM 抗体。 0022 ( 三 )、 有益效果 0023 本发明的试纸条利。
12、用胶体金标记技术和膜层析技术， 用于快速定性检测样本中可 能存在的 EV71 特异性 IgM 抗体， 达到快速筛检病人， 及时诊断治疗的目的。可节省大量人 力物力， 方便、 快速、 简捷， 不需特殊仪器设备， 不需专业培训， 结果清晰易辨， 操作简单， 易 于推广， 适合基层， 适合于现场检测和早期诊断， 对 EV71 的感染诊断起到辅助作用。 附图说明 0024 图 1 ： A 本发明试纸条的正面示意图 ； B 本发明试纸条的侧面示意图。其中， 1 ： 吸 水垫 ； 2 ： 硝酸纤维膜 (T ： EV71 基因工程抗原 VP1 ； C ： 包被抗鼠 IgG 的质控条带 ) ； 3 ： 含有胶。
13、 体金标记的抗人 IgM 单克隆抗体的玻璃纤维膜 ； 4 ： 金标抗体保护膜 ； 5 ： 反应支持物。 0025 图 2 ： 检测结果示意图。其中， 从左至右依次为 ： T、 C 两条线阳性 ； C 一条线阴性 ； T、 C 两条线阴性或仅有 T 线阳性， 无效。 具体实施方式 0026 以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明 的范围。 0027 若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0028 实施例 1 ： EV71 特异性 IgM 抗。
14、体检测试纸条 ( 胶体金法 )( 参见图 1) 0029 EV71 基因工程抗原 VP1 购于北京安波特基因技术有限公司。 0030 反 应 支 持 物 为 6.5cm0.4cm PCV 板 ； 吸 水 垫 为 2cm0.4cm 的 滤 油 纸 ； 2.0cm0.4cm 的硝酸纤维膜依次包被抗鼠 IgG(2mg/ml)， EV71 抗原 VP1(1.5mg/ml)， 含有 0.4cm0.4cm 胶体金标记的抗人 IgM( 标记量 25g/ml) 的单克隆抗体聚酯膜 ； 样品垫 说 明 书 CN 102253210 A CN 102253216 A3/3 页 5 2.7cm0.4cm 的玻璃纤维。
15、 ； 即组成了肠道病毒 71 型 (EV71)IgM 抗体检测试纸条 ( 胶体金 法 )。 0031 实施例 2 检测方法 ( 参见图 2) 0032 将患者全血、 血浆或血清标本 100-150l 直接滴加入实施例 1 试纸条 “4” 处， 样 品液沿膜上行， 10-15 分钟判读结果。 0033 结果 ： 0034 如检测样本中含有 EV71 的 IgM 抗体， 则与试纸条上胶体金标记的抗人 IgM 单克隆 抗体形成相应的复合物， 上行与包被在硝酸纤维膜上的 EV71 特异性抗原 VP1 结合， 形成红 色线条， 即在 T 处形成红色条带。 0035 无论标本中是否含有相应的抗体， 胶体金标记的抗人 IgM 单克隆抗体继续向上爬 行与包被在膜上的抗鼠 IgG 形成红色沉淀线， 即在 “C” 处形成红色条带。此线是质控线， 如 胶体金失效， 此线就不会出现， 说明试纸条失效。 说 明 书 CN 102253210 A CN 102253216 A1/1 页 6 图 1A 图 1B 图 2 说 明 书 附 图 CN 102253210 A 。