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1、(10)申请公布号 CN 102181379 A (43)申请公布日 2011.09.14 CN 102181379 A *CN102181379A* (21)申请号 201110020431.0 (22)申请日 2011.01.18 CGMCC NO.4476 2010.12.15 C12N 1/20(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/025(2006.01) (71)申请人 云南大学 地址 650091 云南省昆明市翠湖北路 2 号 (72)发明人 黄晓玮 乔敏 王纪爱 周薇 张克勤 (74)专利代理机构 昆明今威专利代理有限公司 53115 代理人 杨。
2、宏珍 (54) 发明名称 一株氧化木糖无色杆菌 MG1 及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一株氧化木糖无色杆菌 MG1 及其 应用， 属微生物环境应用领域。 本发明通过常规的 方法从从印染污水中分离到的细菌中筛选到， 氧 化木糖无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans) MG1 菌株， 已于 2010 年 12 月 15 日保存于中国微 生物菌种保藏委员会普通微生物中心， 保藏号 ： CGMCC NO.4476。 本发明的氧化木糖无色杆菌菌株 MG1， 对三苯甲烷类染料中的孔雀绿具有超强的脱 色高效性， 在孔雀绿的浓度高达2000mg/L时， 1小 时对其脱色率可高达 。
3、861。此外， MG1 菌株对 结晶紫也有较好的脱色的作用， 能够作为制备生 物脱色剂的应用本发明具有能扩宽降解染料的菌 种范围， 使得环境中的孔雀绿、 结晶紫多了一条人 工降解的途径， 降低环境污染治理成本的优点。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 CN 102181381 A1/1 页 2 1. 一株氧化木糖无色杆菌 MG1 菌株， 从印染污水中分离到的细菌中筛选到， 其特征在 于 ： 氧化木糖无色杆菌 (Achromobacter xylosoxidans)MG1 菌。
4、株， 已于 2010 年 12 月 15 日 保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心， 保藏号 ： CGMCC NO.4476。 2. 权利要求 1 所述的氧化木糖无色杆菌 MG1 菌株， 其特征在于 ： 该菌株从自然界分离 后， 经纯化、 培养、 驯化后， 对三苯甲烷类染料孔雀绿具有超强的脱色活性， 且对结晶紫亦有 较好的脱色的作用， 能够作为制备生物脱色剂的应用。 权 利 要 求 书 CN 102181379 A CN 102181381 A1/4 页 3 一株氧化木糖无色杆菌 MG1 及其应用 技术领域 ： 0001 本发明涉及一株氧化木糖无色杆菌 MG1 及其应用， 属微生物环境。
5、应用领域。 背景技术 ： 0002 随着科技的发展， 合成染料被广泛应用于纺织、 皮革、 食品、 日用化工等行业中。 但 这些染料通常含有复杂的芳香环结构、 化学稳定性高、 环境可降解性低， 且多数染料及其代 谢中间产物具有致突变性、 致癌性和其他毒性， 这也使得染料成为重要的环境污染物之一。 作为污染源， 染料的首先特点就是污染量大。据统计， 目前世界染料年产量约为 80 90 万 吨， 我国染料年产量达 15 万吨， 位居世界前列。在染料的使用过程中大约有 10 15被 直接排放到污水处理系统或环境中。 其废水治理率不足30， 治理合格率仅57.6。 因此， 仅从废水治理方面来看， 染料行。
6、业的环境保护任务也是相当艰巨的。 0003 其中的三苯甲烷类染料是以三苯甲烷为母体的一类染料， 其分子结构是中心碳原 子上连有三个苯环， 不同的侧链基团决定了不同染料结构和一些相应的特性。这类染料具 有着色力强、 色泽鲜艳等特点， 因而被广泛用于纺织、 造纸、 医药、 食品和化妆品等领域。较 常见的有 ： 孔雀绿、 结晶紫、 及碱性品红。此外， 它们还被广泛用做治疗皮肤病的药剂。但体 外试验表明， 这些化合物具有有丝分裂毒性。孔雀绿在浓度低至 0.1mg/L 时， 对哺乳动物细 胞都是高毒性的， 能促进肝脏肿瘤的形成以及导致小白兔和鱼的异常增殖。 因此， 必须采取 有效的措施来将染料的危害降到。
7、最低。 0004 对于染料处理， 目前各国主要有 ： 物理、 化学和生物的方法。但物化法的运行成本 通常较高， 效率较差， 且容易产生二次污染。 生物降解染料废水具有成本低， 无二次污染， 生 态恢复性好等优点， 已成为国内外学者研究的热点。生物降解处理是一种急待开发的新技 术， 因而筛选高效广谱的染料脱色菌株具有重要的理论和实用价值。 0005 氧化木糖无色杆菌 (Achromobacter xylosoxidans) 是一类广泛存在于环境中的 杆状革兰氏阴性细菌。 Achromobacter xylosoxidans MGl是我们实验室从印染污水中分离 筛选， 并经过驯化得到的一株高效降解。
8、孔雀绿的菌株。关于其脱色活性和相关机理尚未见 报道。 发明内容 ： 0006 本发明的目的在于提供一株氧化木糖无色杆菌 MG1 及其应用， 通过对一株氧化木 糖无色杆菌 MG1 的研究， 开发生物脱色剂。 0007 本发明人在开展染料脱色机理的研究中， 从印染污水分离到的细菌中筛选到氧化 木糖无色杆菌 (Achromobacter xylosoxidans)MG1 菌株， MG1 菌株已于 2010 年 12 月 15 日 保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心， 保藏号 ： CGMCC NO.4476， 保藏单位地 址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号。 0008 本发明筛选。
9、到的一株氧化木糖无色杆菌 MG1， 其特征为 ： 短杆状或圆棒状， 多以散 在形式存在， 革兰氏阴性。在 LB 平板培上菌落小呈圆形， 乳白色， 凸起， 不透明， 表面湿润， 说 明 书 CN 102181379 A CN 102181381 A2/4 页 4 边缘较整齐。同时我们的研究还发现， 该菌株具有高效的降解三苯甲烷类染料孔雀绿和结 晶紫的活性， 其所具有的脱色功能主要源于胞内酶、 及胞外小分子化合物成份。巢式 PCR 结 果显示， 该菌含有降解三苯甲烷类染料的基因tmr。 甲吡酮抑制实验表明， 细胞色素P450不 参与胞内的染料降解过程。此外， 菌体本身也具有对染料进行物理性吸附的作。
10、用。 0009 本发明通过常规的方法从自然界中进行菌株分离、 纯化、 培养， 然后经过五次驯化 处理， 使其具有超强的脱色高效性。 在孔雀绿的浓度高达2000mg/L时， 1小时对其脱色率可 高达861。 本发明的菌株对三苯甲烷类染料中的结晶紫有较好的脱色的作用， 能够作为 制备生物脱色剂的应用。 0010 本发明具有能扩宽降解染料的菌种范围， 使得环境中的孔雀绿、 结晶紫多了一条 人工降解的途径， 降低环境污染治理成本的优点。 附图说明 ： 0011 图 1 为氧化木糖无色杆菌 MG1 的菌落形态照片及其光镜下的菌体。其中图 1-a 为 氧化木糖无色杆菌 MG1 的菌落形态 ； 图 1-b 。
11、为光镜观察的氧化木糖无色杆菌 MG1。 0012 图 2 显示氧化木糖无色杆菌 MG1 在不同孔雀绿浓度下的脱色率。 0013 图 3 为氧化木糖无色杆菌 MG1 中基因 tmr 的克隆和序列的比对结果。其中 3-a 为 PCR 扩增基因 tmr 的琼脂糖电泳图 ； 图 3-b 为基因 tmr 和 Citrobacter 来源的同源序列比 对的结果。 具体实施方式 ： 0014 以下是本发明的实施例， 但本发明的内容并不局限于此。 0015 本发明是这样实现的 ： 0016 筛选纯化出氧化木糖无色杆菌后， 用孔雀绿对其进行多次驯化。然后测其最终的 脱色活性。并对其胞内和胞外的脱色机理进行探究。。
12、 0017 氧化木糖无色杆菌 MG1 的纯化、 培养及驯化方法 ( 以下为重量百分比 ) ： 0018 1、 平板纯化培养 0019 LB 平板培养基配方为 ： 0.5 YeastExtract， 1 Tryptone， 1 NaCl， 1.5-2 Agar， pH 自然。将混合菌体接种到平板培养基上， 37下培养， 获得单菌落。 0020 2、 液体扩大培养 0021 LB 液体培养基配方为 ： 0.5 Yeast Extract， 1 Tryptone， 1 NaCl， 余下的为 水， pH 自然。将平板上的单菌落接种进液体培养基， 过夜培养直到 OD600为 0.50 0.60。恒 温摇。
13、床温度为 38， 转速为 190rpm。 0022 3、 菌株的驯化 0023 驯 化 培 养 基 的 配 方 为 ： KH2PO40.05 ， K2HPO40.15 ， NaCl 0.05 ， MgSO47H2O0.05， NH4Cl 0.1， 孔雀绿的浓度由 50mg/L 增至最后的 100mg/L。每次驯化 的时间为 5 天。驯化在 38的恒温摇床上进行， 转速为 190rpm。 0024 氧化木糖无色杆菌 MG1 对孔雀绿的脱色试验 ： 0025 1、 不同菌株脱色能力的测试 0026 脱色培养基成分为 ： 0.5Yeast Extract， 1Tryptone， 1NaCl， 40m。
14、g/L的孔雀 说 明 书 CN 102181379 A CN 102181381 A3/4 页 5 绿。将经过过夜培养的菌液按一定的接种量接种进脱色培养基， 定时测试不同菌株的脱色 率， 筛选出其中脱色能力最强的一株。 0027 2、 脱色率的计算方法 0028 孔雀绿的特征性吸收波峰为 617nm， 脱色率就是通过紫外 - 可见光扫描式分光光 度仪测试在最大吸收波峰处峰值的降低情况来进行计算的。将脱色后的培养液离心处理 (12,000rpm， 2 分钟 )， 上清在 617nm 处测吸光度。脱色率的计算公式为 ： 0029 脱色率 ( ) 100(A-B)/A 0030 其中 A 是未经细菌。
15、脱色的 617nm 吸光度 0031 B 为细菌脱色后的 617nm 吸光度 0032 3、 外界不同环境对脱色率的影响 0033 (1) 测试温度、 PH、 溶氧对脱色率影响实验， 方法如下 ： 0034 菌种接种在含 90ml LB 液体培养基的 250ml 三角瓶中过夜培养， 温度 38， 转 速 190rpm， 使最终菌体的 OD600为 0.50 0.60。为测试温度对脱色率的影响， 无菌接入 10ml400mg/l 的孔雀绿 ( 终浓度为 40mg/l)， 将培养物分别放入 28、 38及 48恒温摇床 上进行脱色培养， 转速 190rpm。测试 PH 值因素时， 将接入孔雀绿 (。
16、 浓度同上 ) 的培养物用 HCl 和 NaOH 将其最终 PH 分别调至 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0、 11.0、 12.0， 然后 置于190rpm、 38的恒温摇床上。 溶氧也是影响脱色的一个因素， 我们通过选择不同转速的 摇床(0rpm、 100rpm、 190rpm)对溶氧量的影响进行了测试， 在0rpm的情况下， 还分别用矿物 油对脱色培养物采取液封和不液封两种情形检测其脱 色率的差异。 0035 (2) 不同碳源对菌体脱色影响的实验方法如下 ： 0036 为了测试不同碳源下氧化木糖无色杆菌 MG1 对孔雀绿的降解情况， 我们选择。
17、了常 用的 5 种碳源进行了实验。基础培养基是 M9， 配方如下 ： 12.8g/lNa2HPO4 7H2O， 3g/lKH2PO4， 0.5g/l NaCl， 1.0g/lNH4Cl， 不同的碳源分别为 5.0g/l Yeast extracts， 10g/l Peptone， 3g/l BeefExtract， 10g/l Glucose 和 3g/l Beefextract 与 5g/l Peptone for Fish 的混 合碳源。最后添加孔雀绿， 使其终浓度为 40mg/l。细菌的培养方式同上， 之后将发酵液在 8,000rpm 下离心 10 分钟， 弃去上清， 沉淀的细胞在无菌条。
18、件下加入到上述的含不同碳源的 M9 脱色培养基中， 190rpm， 38下进行脱色培养。 0037 4、 脱色机理的探究实验 0038 (1) 验证脱色过程是否有细胞色素 P450 的参与 ( 甲吡酮抑制实验 ) 0039 将氧化木糖无色杆菌MG1过夜培养， 发酵液8,500rpm、 4离心15分钟。 沉淀用含 1mM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液(PH为7)吹洗悬浮， 然后在冰上通过超声将菌体破碎(超声 5秒， 停7秒， 破碎时间15分钟， 48振幅)， 之后加入MgCl2使其终浓度为2mM。 12,000rpm、 4离心 1 分钟去掉未破碎的细胞， 12,000rpm、 4离心 30 分。
19、钟将细胞膜碎片 ( 沉淀 ) 和可 溶性物质 ( 上清 ) 分开后， 沉淀用含 1mM EDTA 的 50mM 磷酸钠缓冲液吹洗悬浮， 然后分别加 入甲吡酮使其终浓度为10mM(对照组不添加甲吡酮)， 37温浴10分钟后， 加入一定量的孔 雀绿测其脱色活性。 0040 (2) 脱色基因的克隆 ： 巢式 PCR 0041 设 计 巢 式 PCR 的 两 对 引 物，分 别 为 P1(F)5 AGTCAAATCATTGCCATCGTG 3； P1(R)5GGTTTCCTTCAGAGGGGTC 3； P2(F)5GCTCTTTATCTCAGGTCCGC 3； 说 明 书 CN 102181379 A。
20、 CN 102181381 A4/4 页 6 P2(R)5 ACACCAGCGTTTACGAGGA 3 。 PCR 50tl的体系为 ： 模板1l， 正向引物(10M)1l， 反 向 引 物 (10M)1l， 10Taq Buffer 5l， dNTP Mixture(2.5mM)4l， Taq(2.5U/ l)1l， ddH2O 37l。扩增的条件为 94 30 秒， 56 30 秒， 72 1 分钟， 总共 35 个循 环。扩增出的片段测序后在 GenBank 中进行比对。 0042 (3) 胞外脱色活性实验 0043 将细菌在含100ml LB培养基的250ml的三角瓶中38、 190r。
21、pm过夜培养， 当OD600 为 0.50 时， 8,000rpm 离心 10 分钟， 然后再 10,000rpm 离心 20 分钟以充分地去除菌体。上 清中加入孔雀绿使其终浓度为 40mg/l， 在不同的时间段内取样测脱色活性。对照组为不接 菌的 LB 和不经离心处理的发酵液。 0044 5、 实验结果 0045 从现在已有的报道来看， 能对孔雀绿脱色的最高浓度是 500mol/l( 约 182mg/ l)， Pseudomonas otitidis W/L3 在 12 小时内能降解到 95， 而氧化木糖无色杆菌 MG1 在 孔 雀绿的浓度高达 2000mg/L 时， 1 小时对其脱色率可高。
22、达 861。具体数据如下表。脱 色的最佳条件为 ： 190rpm， 38， PH 为 6 时。在所测试的碳源中， 最佳营养为 Beefextract 与 Peptone for Fish 的混合碳源。巢式 PCR 结果显示， 该菌株含有三苯甲烷还原酶的基因 tmr。甲吡酮抑制实验证明， 尽管具有如此高效的脱色率， 脱色过程并没有细胞色素 P450 的 参与。而胞外物质则具有很强的脱色活性。 0046 表氧化木糖无色杆菌 MG1 在不同孔雀绿浓度下的脱色率 0047 0048 本发明的氧化木糖无色杆菌菌株 MG1 同已报道的其它降解孔雀绿的菌株相比， 具有超强的脱色高效性， 在孔雀绿的浓度高达 2000mg/L 时， 1 小时对其脱色率可高达 861。 说 明 书 CN 102181379 A CN 102181381 A1/2 页 7 图 2 说 明 书 附 图 CN 102181379 A CN 102181381 A2/2 页 8 图 3-a 图 3-b 说 明 书 附 图 CN 102181379 A 。