一种用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续发酵方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102242075 A (43)申请公布日 2011.11.16 CN 102242075 A *CN102242075A* (21)申请号 201110099929.0 (22)申请日 2011.04.21 C12N 1/20(2006.01) C05F 11/08(2006.01) C12R 1/125(2006.01) C12R 1/11(2006.01) C12R 1/10(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 马鞍山科邦生态肥有限公司 地址 243100 安徽省马鞍山市当涂县经济开 发区 (72)发明人 杨柳 唐旺全 杨红兵。

2、 (74)专利代理机构 安徽合肥华信知识产权代理 有限公司 34112 代理人 张和平 (54) 发明名称 一种用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续发 酵方法 (57) 摘要 本发明涉及一种用于微生物肥料的芽孢杆菌 液的半连续发酵方法， 通过两步培养法制备芽孢 杆菌发酵液。将发酵液培养至对数期末期或稳定 期初期， 流出部分发酵液至另一发酵罐培养至成 熟发酵液， 而对原发酵罐进行补料培养。 补料可进 行 16-20 次， 大大减少了种子扩培次数， 缩短生产 周期， 提高生产效率， 可实现半连续的工业生产。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书。

3、 1 页 说明书 4 页 CN 102242079 A1/1 页 2 1. 用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续发酵方法， 其特征在于 ： 在发酵罐 1 培养芽孢 杆菌至对数期末期或稳定期初期， 取出一半以上发酵液至发酵罐 2， 在发酵罐 2 中促进芽孢 形成 ； 补充新鲜培养基到发酵罐 1 内至发酵液达到原体积， 继续培养至稳定期， 反复进行上 述步骤。发酵液最后作什么用， 什么时间停止？发酵液是不是最后的目标物？ 2. 根据权利要求 1 所述的用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续发酵方法， 其特征在于 具体操作步骤如下 ： (1) 将 培 养 基 加 入 到 灭 菌 罐 中， 充 分 搅 拌 均 。

4、匀 后， 通 入 蒸 汽， 于 121-126 、 0.11-0.13Mpa 下灭菌 20-25 分钟 ； 降温至 35-50， 将培养基转移至灭过菌的发酵罐 1 中， 按 5-15的重量比率将处于对数生长期中后期的芽孢杆菌种子液接入发酵罐 1， 按罐压 0.02-0.05Mpa， 通风量 1 1.0-1.2 体积 / 体积 / 分， 搅拌转速 250-400rpm， 罐温 30-40 的条件下， 培养 24-40h 至微生物处于对数期末期或稳定期初期 ； 通风量 1 1.0-1.2 体积 / 体积 / 分， 意思不明确？ (2) 取 出 发 酵 罐 1 中 1/2-2/3 体 积 的 发 酵。

5、 液 至 灭 过 菌 的 发 酵 罐 2 中， 按 罐 压 0.02-0.05Mpa， 通风量 1 0.6-0.8v 体积 / 体积 / 分， 搅拌转速 200-300rpm， 罐温 32-37 的条件下， 培养 18-24h ； (3) 补充灭过菌的培养基到发酵罐 1 中， 按 (1) 中培养条件培养 16-24h 至微生物处于 对数期末期或稳定期初期 ； (4) 重复 2)、 3) 过程。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 每当发酵罐1菌体至对数期末期或稳定期 初期， 就取出部分发酵液另外培养。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。

6、、 胶质芽 孢杆菌、 地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 连续发酵时间为 12-18 天。 权 利 要 求 书 CN 102242075 A CN 102242079 A1/4 页 3 一种用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续发酵方法 技术领域 0001 本发明属于微生物培养技术领域， 涉及一种发酵方法， 具体设计一种用于微生物 肥料的芽孢杆菌液的半连续发酵方法。 背景技术 0002 多年来， 化肥对农业增产增收起到了重要作用， 但其对环境的损害已经为人们广 泛关注。微生物肥料对改善土壤营养结构 , 增强土壤肥力 , 促进作物生长 , 增强作物抗病 。

7、能力等方面具有重要作用。 微生物肥料因具有无毒、 无害、 肥效显著持久、 施用方便、 适用范 围广泛等优点而成为各国肥料研究的重点。 中华人民共和国农业部陆续颁布了微生物肥料 系列标准， 如 NY227-1994、 NY/T798-2004 等， 标准中明确规定了肥料中微生物的种类与数 量， 有效微生物的安全性与数量是肥料质量的核心。 0003 微生物在不良环境 （如干旱、 高温等） 下容易死亡， 从而失去其应用价值。而微生物 的休眠体 “芽孢” 具有抗逆性强、 耐高温和干燥， 、 耐存储等优点， 便于生产与应用。芽孢易 在固体培养基上形成， 但固体发酵存在易染菌、 劳动强度大、 效率低的不足。

8、， 难以满足生产 的要求。液体发酵中， 需控制一定的发酵条件 （如碳源浓度、 氮源浓度、 pH、 溶氧等） 才能形 成芽孢， 且芽孢形成所需的时间较长。 0004 目前， 关于微生物芽孢培养方法的描述都是用分批或补料分批的培养方法。一般 微生物肥料生产工艺是 ： 保藏菌种斜面菌种培养活化摇瓶扩大培养种子罐扩大培养 发酵罐液体发酵吸附后包装或按稀释后直接包装。每批培养都需要种子扩培环节， 导 致整个生产周期较长， 设备的利用率不高， 且无菌操作要求高。 分批操作还给生产控制带来 困难。 发明内容 0005 本发明的目的在于解决目前芽孢生产周期长、 生产效率低， 提供一种在大规模的 液体发酵条件下。

9、， 缩短生产周期并提高生产效率的用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续培 养方法。 0006 本发明的目的是通过如下的技术方案实现的 ： 用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续发酵方法， 其特征在于 ： 在发酵罐 1 培养芽孢杆 菌至对数期末期或稳定期初期， 取出一半以上发酵液至发酵罐 2， 在发酵罐 2 中促进芽孢形 成 ； 补充新鲜培养基到发酵罐 1 内至发酵液达到原体积， 继续培养至稳定期， 反复进行上述 步骤。发酵液最后作什么用， 什么时间停止？发酵液是不是最后的目标物？ 所述的用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续发酵方法， 其特征在于具体操作步骤如 下 ： （1） 将培养基加入到灭菌罐中， 充分搅拌。

10、均匀后， 通入蒸汽， 于 121-126、 0.11-0.13Mpa 下灭菌 20-25 分钟 ； 降温至 35-50， 将培养基转移至灭过菌的发酵罐 1 中， 按 5-15% 的重量比率将处于对数生长期中后期的芽孢杆菌种子液接入发酵罐 1， 按罐压 说 明 书 CN 102242075 A CN 102242079 A2/4 页 4 0.02-0.05Mpa， 通风量 1:1.0-1.2 体积 / 体积 / 分， 搅拌转速 250-400rpm， 罐温 30-40的 条件下， 培养 24-40h 至微生物处于对数期末期或稳定期初期 ； 通风量 1:1.0-1.2 体积 / 体 积 / 分， 。

11、意思不明确？ （2） 取出发酵罐 1 中 1/2- 2/3 体积的发酵液至灭过菌的发酵罐 2 中， 按罐压 0.02-0.05Mpa， 通风量 1:0.6-0.8v 体积 / 体积 / 分， 搅拌转速 200-300rpm， 罐温 32-37的 条件下， 培养 18-24h ； （3） 补充灭过菌的培养基到发酵罐 1 中， 按 （1） 中培养条件培养 16-24h 至微生物处于 对数期末期或稳定期初期 ； （4） 重复 2） 、 3） 过程。 0007 每当发酵罐 1 菌体至对数期末期或稳定期初期， 就取出部分发酵液另外培养。 0008 所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、 胶质芽孢杆菌、 地衣芽孢。

12、杆菌或巨大芽孢杆菌。 0009 连续发酵时间为 12-18 天。 0010 本发明的方法已经在枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、 胶质芽孢杆菌、 巨大芽孢杆 菌等有肥料功能的芽孢杆菌的液体发酵生产中应用， 该半连续生产可进行 12-18d， 发酵 15-20 批次， 芽孢形成率 90-95%。 0011 本发明提供的发酵方法是在发酵罐生产过程中， 采取带放的方式进行芽孢杆菌发 酵， 可实现半连续的进行菌种的培养， 使该法易于在工业生产中应用。 与现有的分批培养相 比， 优点在于 ：（1） 将菌体生长与生成芽孢分开进行， 便于生产控制， 对设备要求降低。 （2） 大大减少量种子扩培次数， 缩短了生产。

13、周期、 降低了生产成本， 效果显著。3） 该方法操作简 便， 降低了因操作带来污染的几率。 具体实施方式 0012 下列实施例是对本发明的进一步解释和说明， 对本发明不构成任何限制。 0013 实验装置 本发明的实验是在机械搅拌发酵罐中进行的， 搅拌罐包括通风管、 排气管、 接种管、 取 样管、 温度指示、 罐压表、 转子流量计、 换热夹套等。发酵罐 1 体积为 1m3， 发酵罐 2 体积为 0.7 m3。 0014 实施例 1 将枯草芽孢杆菌的培养基 （按重量百分比计， 小麦粉 2%， 玉米浆 0.2%， 磷酸氢二钾 0.5%， 黄豆饼粉 0.5%， 菜籽油 0.2%， pH7.2-7.4，。

14、 其余为水） 700 公斤加入到发酵罐 1 中， 搅拌 均匀， 蒸汽通入夹套， 培养基升温至 121， 表压 0.11Mpa， 保温保压 25 分钟进行灭菌。降温 至 40， 通过接种管道将枯草芽孢杆菌种子液 70 公斤加入到发酵罐 1 中， 在罐温 37、 罐 压 0.02-0.05Mpa、 搅拌转速每分钟 320 转、 通气量 1:1.2 体积 / 体积 / 分进行培养， 培养 36 小时， 镜检培养开始出现芽孢， 通过管道将发酵液 500 公斤运至发酵罐 2。发酵罐 2 在罐温 37、 罐压0.02-0.05Mpa、 搅拌转速每分钟250转、 通气量1:1.0体积/体积/分进行培养， 培。

15、养 18 小时， 细胞浓度为 30 亿 CFU、 ml， 芽孢形成率约 95%。补充灭过菌的培养基 500 公斤 至发酵罐 1 中， 应用上述罐 1 培养条件 （罐温 37、 罐压 0.05Mpa、 搅拌转速每分钟 320 转、 通气量 1:1.2 体积 / 体积 / 分） 进行培养 20 小时， 将发酵液 500 公斤运至发酵罐 2， 应用发 酵罐 2 培养条件进行培养 18 小时， 如此反复， 共进行 18 批次， 芽孢形成率 90-95%。18 批次 说 明 书 CN 102242075 A CN 102242079 A3/4 页 5 耗时 384 小时， 得到芽孢发酵液 9270 公斤。

16、。 0015 对比例 1 将枯草芽孢杆菌采用与实施例 1 相同的培养基和灭菌方法， 培养基灭菌结束后， 接入 种子液， 在前 36 小时采用上述罐 1 培养条件， 后 18 小时采用罐 2 培养条件， 1 个周期共 64 小时， 包括发酵培养 54 小时， 清洗灭菌 10 小时， 罐 1（投料 700 公斤 ,70 公斤种子液） 、 罐 2 （投料 450 公斤， 种子液 50 公斤） 同时进行发酵， 每罐各进行 6 批次， 共进行 12 批次， 耗时 384 小时， 得到芽孢发酵液 7620 公斤。 0016 实施例 2 将胶质芽孢杆菌的培养基 （按重量百分比计， 小麦粉 1%， 黄豆饼粉 。

17、0.5%， 磷酸氢二钾 0.05%， 硫酸镁 0.25%， 硫酸铵 0.1%， 泡敌 0.002%， pH7.2-7.4， 其余为水） 700 公斤加入到发 酵罐 1 中， 搅拌均匀， 蒸汽通入夹套， 培养基升温至 121， 表压 0.11Mpa， 保温保压 25 分钟 进行灭菌。 降温至40， 通过接种管道将胶质芽孢杆菌种子液100公斤加入到发酵罐1中， 在罐温 352、 罐压 0.05Mpa、 搅拌转速每分钟 280 转、 通气量 1:1.0 体积 / 体积 / 分进行 培养， 培养 40 小时， 镜检培养开始出现芽孢， 通过管道将发酵液 400 公斤运至发酵罐 2。发 酵罐 2 在罐温 。

18、37、 罐压 0.05Mpa、 搅拌转速每分钟 250 转、 通气量 1:0.8 体积 / 体积 / 分 进行培养， 培养 18 小时， 芽孢形成率约 95%。补充灭过菌的培养基 400 公斤至发酵罐 1 中， 应用上述罐 1 培养条件 （罐温 37、 罐压 0.05Mpa、 转速每分钟 300 转、 通气量 1:1.0 体积 / 体积 / 分） 进行培养 20 小时， 将发酵液 400 公斤运至发酵罐 2， 应用发酵罐 2 培养条件进行 培养 18 小时， 如此反复， 共进行 18 批次， 芽孢形成率 90-95%。18 批次耗时 398 小时， 得到 芽孢发酵液 9200 公斤。 0017。

19、 对比例 2 将胶质芽孢杆菌采用与实施例 2 相同的培养基和灭菌方法， 培养基灭菌结束后， 接入 种子液， 在前 36 小时采用上述罐 1 培养条件， 后 24 小时采用罐 2 培养条件， 1 个周期共 68 小时， 包括发酵培养 58 小时， 清洗灭菌 10 小时， 罐 1（投料 700 公斤 ,100 公斤种子液） 、 罐 2（投料 360 公斤， 种子液 40 公斤） 同时进行发酵， 每罐各进行 6 批次， 共进行 12 批次， 耗时 408 小时， 得到芽孢发酵液 7200 公斤。 0018 实施例 3 将地衣芽孢杆菌的培养基 （按重量百分比计， 小麦粉 1%， 玉米粉 1.0%， 黄。

20、豆饼粉 2.5%， 玉米浆 0.3%， 七水合硫酸镁 0.2%， 一水合硫酸锰 0.04%， 菜籽油 0.2%， pH7.2-7.4， 其余 为水） 700 公斤加入到发酵罐 1 中， 搅拌均匀， 蒸汽通入夹套， 培养基升温至 121， 表压 0.11Mpa， 保温保压25分钟进行灭菌。 降温至40， 通过接种管道将地衣芽孢杆菌种子液70 公斤加入到发酵罐 1 中， 在罐温 37、 罐压 0.05Mpa、 搅拌转速每分钟 300 转、 通气量 1:1.0 体积 / 体积 / 分进行培养， 培养 36 小时， 镜检培养开始出现芽孢， 通过管道将发酵液 500 公 斤运至发酵罐2。 发酵罐2在罐温。

21、37、 罐压0.05Mpa、 搅拌转速每分钟250转、 通气量1:0.8 体积 / 体积 / 分进行培养， 培养 16 小时， 芽孢形成率约 95%。补充灭过菌的培养基 500 公斤 至发酵罐 1 中， 应用上述罐 1 培养条件 （罐温 37、 罐压 0.05Mpa、 转速每分钟 300 转、 通气 量 1:1.0 体积 / 体积 / 分） 进行培养 16 小时， 将发酵液 500 公斤运至发酵罐 2， 应用发酵罐 2 培养条件进行培养 16 小时， 如此反复， 共进行 18 批次， 芽孢形成率 90-95%。18 批次耗时 324 小时， 得到芽孢发酵液 9270 公斤。 说 明 书 CN 。

22、102242075 A CN 102242079 A4/4 页 6 0019 对比例 3 将地衣芽孢杆菌采用与实施例 3 相同的培养基和灭菌方法， 培养基灭菌结束后， 接入 种子液， 在前 36 小时采用上述罐 1 培养条件， 后 16 小时采用罐 2 培养条件， 1 个周期共 62 小时， 包括发酵培养 52 小时， 清洗灭菌 10 小时， 罐 1（投料 700 公斤 , 种子液 70 公斤） 、 罐 2（投料 450 公斤， 种子液 50 公斤） 同时进行发酵， 每罐各进行 6 批次， 共进行 12 批次， 耗时 372 小时， 得到芽孢发酵液 7620 公斤。 0020 实施例 4 将巨。

23、大芽孢杆菌的培养基 （按重量百分比计， 小麦粉 2%， 玉米浆 0.1%， 黄豆饼粉 0.5%， 磷酸氢二钾 0.15%， 七水合硫酸镁 0.2%， pH7.2-7.4， 其余为水） 700 公斤加入到发酵罐 1 中， 搅拌均匀， 蒸汽通入夹套， 培养基升温至 121， 表压 0.11Mpa， 保温保压 25 分钟进行灭 菌。降温至 40， 通过接种管道将巨大芽孢杆菌种子液 70 公斤加入到发酵罐 1 中， 在罐温 37、 罐压0.02-0.05Mpa、 搅拌转速每分钟280转、 通气量1:0.9体积/体积/分进行培养， 培养 32 小时， 镜检培养开始出现芽孢， 通过管道将发酵液 500 公。

24、斤运至发酵罐 2。发酵罐 2 在罐温 37、 罐压 0.02-0.05Mpa、 转速每分钟 250 转、 通气量 1:0.8 体积 / 体积 / 分进行培 养， 培养 16 小时， 芽孢形成率约 95%。补充灭过菌的培养基 500 公斤至发酵罐 1 中， 应用上 述罐 1 培养条件 （罐温 37、 罐压 0.02-0.05Mpa、 搅拌转速每分钟 280 转、 通气量 1:0.9 体 积 / 体积 / 分） 进行培养 18 小时， 将发酵液 500 公斤运至发酵罐 2， 应用发酵罐 2 培养条件 进行培养 16 小时， 如此反复， 共进行 18 批次， 芽孢形成率 90-95%。18 批次耗时。

25、 354 小时， 得到芽孢发酵液 9270 公斤。 0021 对比例 4 将巨大芽孢杆菌采用与实施例 4 相同的培养基和灭菌方法， 培养基灭菌结束后， 接入 种子液， 在前 32 小时采用上述罐 1 培养条件， 后 16 小时采用罐 2 培养条件， 1 个周期共 58 小时， 包括发酵培养 48 小时， 清洗灭菌 10 小时， 罐 1（投料 700 公斤 , 种子液 70 公斤） 、 罐 2（投料 450 公斤， 种子液 50 公斤） 同时进行发酵， 每罐各进行 6 批次， 共进行 12 批次， 耗时 348 小时， 得到芽孢发酵液 7620 公斤。 0022 在前 32 小时采用上述罐 1 培养条件， 后 16 小时采用罐 2 培养条件， 是什么意思？ 罐 1 与罐 2 本身培养条件是不同的， 而且， 如何区分前 32 小时、 后 16 小时。 说 明 书 CN 102242075 A 。