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1、10申请公布号CN104140961A43申请公布日20141112CN104140961A21申请号201410321112722申请日20140704C12N11/08200601C12P7/6420060171申请人浙江大学地址310027浙江省杭州市西湖区浙大路38号申请人杭州康源食品科技有限公司72发明人冯凤琴李阳韦伟付官文74专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限公司33224代理人胡红娟54发明名称一种固定化SN1,3专一性脂肪酶及其制备方法和应用57摘要本发明公开了一种固定化SN1,3专一性脂肪酶及其制备方法和应用，所述制备方法包括将SN1,3专一性脂肪酶溶于PH为90100的缓。
2、冲液中，获得酶液；取树脂，预处理后置于所述的酶液中进行吸附，吸附完成后洗涤干燥，制得固定化SN1,3专一性脂肪酶；所述的树脂为苯乙烯型大孔吸附树脂，比表面积为200600M2/G，平均孔径为本发明还公开了所述制备方法制得的固定化SN1,3专一性脂肪酶及其应用。本发明制得的固定化脂肪酶酶活比游离脂肪酶有显著提高，且SN1,3专一性保持稳定，用于合成OPO反应中，缩短反应时间。51INTCL权利要求书1页说明书8页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图1页10申请公布号CN104140961ACN104140961A1/1页21一种固定化SN1,3专一。
3、性脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括1将SN1,3专一性脂肪酶溶于PH为90100的缓冲液中，获得酶液；2取树脂，预处理后置于所述的酶液中进行吸附，吸附完成后洗涤干燥，制得固定化SN1,3专一性脂肪酶；所述的树脂为苯乙烯型大孔吸附树脂，比表面积为200600M2/G，平均孔径为2如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的SN1,3专一性脂肪酶来源于米曲霉。3如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的树脂的比表面积为450600M2/G，平均孔径为4如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为甘氨酸氢氧化钠缓冲液。5如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述甘氨酸氢氧化钠缓冲。
4、液中，甘氨酸的浓度为00501MOL/L。6如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，酶与树脂的质量比为011021。7如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述吸附的温度为2535，时间为13H。8如权利要求17任一项制备方法制备得到的固定化SN1,3专一性脂肪酶。9如权利要求8所述的固定化SN1,3专一性脂肪酶在合成1,3二油酸2棕榈酸甘油三酯中的应用。权利要求书CN104140961A1/8页3一种固定化SN1,3专一性脂肪酶及其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及母乳脂肪替代品领域，尤其涉及一种固定化SN1,3专一性脂肪酶及其制备方法和应用。背景技术00021,3二油酸2。
5、棕榈酸甘油三酯1,3DIOLEOYL2PALMITOYLTRIGLYCERIDE，OPO是我国2008年新批准使用的一种营养强化剂，主要用于婴幼儿配方食品。GB148802012食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准中，也将OPO列入食品营养强化剂。OPO的制备目前主要以脂肪酶催化酯交换合成为主。0003公开号为CN101273118A的中国专利文献公开了采用油酸或者其酯与甘油三酯催化合成OPO的方法。但其所采用的催化剂一般为市售的固定化脂肪酶，因其价格较高而限制了此类固定化脂肪酶在油脂工业中的大规模应用。因此，制备适于要求且成本低廉的固定化脂肪酶来合成OPO成为了相关领域的研究重点。0004。
6、脂肪酶的固定化，是用固体材料将脂肪酶束缚或限制于一定区域内，但仍能保证其特有的催化活性的方法。固定化脂肪酶具有游离酶所不能比拟的优越性，例如催化效率高、酶可以重复使用进而降低成本、容易与产物分离、提高了酶的稳定性、延长了酶的使用寿命、可以实现连续化操作等。0005大孔吸附树脂固定化脂肪酶的基本原理为吸附，此法反应条件温和，对酶分子结构破坏性较小，酶活不易损失，酶的专一性不易受影响。且大孔吸附树脂自身结构简单，材料安全，前处理容易，适于油脂工业中脂肪酶的固定化。0006米曲霉来源的SN1,3专一性脂肪酶安全性好，在催化甘油三酯与脂肪酸的酸解反应中具有较高的区域专一性，能特定地针对甘油三酯SN1,。
7、3位置进行酸解或酯交换，定向合成所需物质如OPO。0007公开号为CN101280297A的中国专利文献公开了一种固定化脂肪酶的制备方法，具体步骤为大孔树脂经预处理后，加入脂肪酶液和印迹分子，振荡吸附，冷冻干燥后进行界面激活技术处理，过滤脱除激活剂庚烷，再次冷冻干燥，获得固定化脂肪酶。该专利制备的固定化脂肪酶具有较好的催化活力和使用稳定性，其催化甲酯转化率可达97以上，重复利用批次为200次。公开号为CN101575594A的中国专利文献公开了一种固定化南极假丝酵母脂肪酶B的工艺方法，包括1树脂的预处理；2固定化酶的制备将预处理过的树脂加入到反应器中，再加入有机介质，静置后加入酶液，加入量为质。
8、量比南极假丝酵母脂肪酶B树脂160100密封后放置到恒温水浴摇床中，2535条件下13H，然后真空冷冻干燥即得。该专利以有机溶剂为固定介质，在微水相中实现脂肪酶固定化的方法，酶活性损失较小，酶活回收率达到654833。0008正如上述专利，目前一般脂肪酶固定化的研究大部分在于提高其重复利用次数、增强其反应稳定性及减少酶活的损失，脂肪酶酶活损失小或略有提高，且在固定化过程中仍需要使用一些有机溶剂CN101575594A、激活剂CN101280297A、蛋白交联剂说明书CN104140961A2/8页4CN102839166A等，步骤繁琐、成本高。而在食品工业中，尽可能减少有机溶剂的使用以保证食品。
9、应用的安全性是必须要考虑的问题。0009目前在用树脂进行脂肪酶固定化的研究中，大多未对所选用树脂的特性进行细化的描述，也未探索固定化过程对SN1,3专一性脂肪酶专一性的影响。作为专一性脂肪酶，在固定过程中，不仅要考虑酶活性的问题，如何保证其区域专一性也是必须要考虑的问题。发明内容0010本发明提供了一种固定化SN1,3专一性脂肪酶的制备方法，制得的固定化酶专一性好，酶活力高，且固定化过程不使用有机溶剂，在食品中可安全使用。0011一种固定化SN1,3专一性脂肪酶的制备方法，包括00121将SN1,3专一性脂肪酶溶于PH为90100的缓冲液中，获得酶液；00132取树脂，预处理后置于所述的酶液中。
10、进行吸附，吸附完成后洗涤干燥，制得固定化SN1,3专一性脂肪酶；0014所述的树脂为苯乙烯型大孔吸附树脂，比表面积为200600M2/G，平均孔径为0015本申请采用吸附法固定化SN1,3专一性脂肪酶，利用比表面积为200600M2/G、平均孔径为的苯乙烯型大孔吸附树脂进行吸附，能够吸附适量的酶蛋白，使酶蛋白分子均匀地固定在树脂上，且酶蛋白分子处于最佳的构象，从而保证了酶的专一性，且大大提高了比酶活。优选的，树脂的比表面积为450600M2/G，平均孔径为更优选的，树脂的比表面积为480520M2/G，平均孔径为0016树脂在吸附前，需先进行预处理，即活化处理，可采用常规手段，如可按照树脂使用。
11、说明进行。所述的SN1,3专一性脂肪酶为区域特异性脂肪酶，来源于微生物，所述微生物可以为黑曲霉、白地霉、米曲霉等。更优选的，可以选择米曲霉来源的SN1,3专一性脂肪酶。0017作为SN1,3专一性脂肪酶的分散剂，缓冲液维持在适宜的PH能够使酶液、树脂上酶蛋白分子处于最佳构象，从而保证固定化脂肪酶的专一性，优选的，所述缓冲液的PH为9496，所述的缓冲液具体可以为甘氨酸氢氧化钠缓冲液。0018所述甘氨酸氢氧化钠缓冲液中，甘氨酸的浓度为00501MOL/L。当缓冲液离子强度相对较低时，脂肪酶分子的活性位点易于暴露出来，能提高固定化脂肪酶的酶活力。优选的，甘氨酸的浓度为01MOL/L。0019给酶量。
12、也能够影响固定化脂肪酶的专一性和酶活，步骤2中，酶与树脂的质量比为011021，优选为01010151，更优选为0151。该给酶量条件下，制备的固定化脂肪酶酶活高，稳定性好，比酶活较游离酶最高可提高10倍以上。0020吸附时间对酶的专一性影响不大，但是会影响酶的吸附量，从而影响固定化脂肪酶的酶活，为保证固定化脂肪酶的酶活，所述吸附的时间为13小时，所述吸附的温度一般为2535。0021另外，在脂肪酶的固定化过程中，为使树脂与酶充分接触，吸附可在振荡条件下进行。说明书CN104140961A3/8页50022吸附完成后，通常需要对树脂进行洗涤，以除去未吸附的脂肪酶，洗涤用的溶液可以为甘氨酸氢氧化。
13、钠缓冲溶液。0023本发明还提供了所述制备方法制备得到的固定化SN1,3专一性脂肪酶。本发明得到的固定化脂肪酶专一性好，比活力高，用于OPO合成中可大大的缩短反应时间。0024本发明还提供了所述的固定化SN1,3专一性脂肪酶在合成1,3二油酸2棕榈酸甘油三酯中的应用。0025所述应用具体包括以棕榈油和油酸为底物，以所述的固定化SN1,3专一性脂肪酶为催化剂进行反应，从反应物中分离纯化得到OPO。0026合成OPO的过程中，反应可在水浴摇床或反应釜中进行，摇床或搅拌桨转速一般为150250R/MIN。若转速过低则所耗的反应时间较长，若转速过高则反应时对固定化脂肪酶载体的机械损伤较大，不利于固定化。
14、脂肪酶的重复利用。0027所述的棕榈油可选择植物来源的棕榈油熔点为58，来源广，安全性高。所述的油酸也可以选择植物来源的油酸，其纯度最好在75以上。0028所述的棕榈油和油酸的摩尔比优选为14110。产物中OPO含量随着油酸用量的增加而增加，但是当加入过多的油酸时，其中非油酸成分会抑制反应的进行，同时造成能源与资源的浪费。0029所述的SN1,3专一性固定化脂肪酶的添加量一般为610占反应底物的量，优选为8。0030所述的反应的温度为5070，该温度在所制得的固定化脂肪酶的适宜反应温度内，且所用的棕榈油的熔点在58左右，与油酸混合后熔点有所降低，若反应温度过低则棕榈油难以融化成液态，不利于反应。
15、的进行，反应温度过高，则会加快酶的失活。优选的，所述反应的温度为500031不同的加酶量及底物摩尔比都会影响反应的时间。具体的反应时间可根据具体的反应参数及具体的产物指标而定。一般的，所述的反应时间为14H。0032所述的从反应物中分离纯化得到OPO，即在反应结束后从反应体系中分离出固定化脂肪酶，然后除去反应产物中的游离脂肪酸，纯化得到OPO含量较高的产品。除去游离脂肪酸可以采用酸碱中和法或分子蒸馏法。0033与现有技术相比，本发明的有益效果为00341本发明采用吸附法，并利用适宜的大孔吸附树脂对SN1,3专一性脂肪酶进行固定化，制得的固定化脂肪酶的酶活对比游离脂肪酶有显著提高最高可提高10倍。
16、以上，且SN1,3专一性保持稳定，专一性较游离酶相当或略有提高。另外，本发明还明确了优化的给酶量、PH等反应条件，以保证固定化酶的专一性和酶活。00352本发明固定化条件温和，方法简单，使用选定的树脂与酶液在一定条件下吸附即可，在酶固定化过程中不使用有机溶剂，以保障固定化酶在食品特别是婴幼儿食品原料制备中的安全性，且原料来源广，廉价易得。00363本发明制备的固定化SN1,3专一性脂肪酶可用于催化棕榈油与油酸或油酸酯反应生成OPO，能够大大缩短反应时间本发明固定化脂肪酶反应1H就能使产物中各项指标达标，而使用市售的固定化脂肪酶RMIM则需6H，能耗低，生成的反应产物中OPO纯度较高，PPP含量。
17、较低，符合相关国标规定，能作为食品营养强化剂用于调配婴幼儿配方奶粉。说明书CN104140961A4/8页6附图说明0037图1为实施例27固定化脂肪酶RMIM中不同反应时间反应体系中各物质含量。0038图2为实施例28本发明制备的固定化脂肪酶中不同反应时间反应体系中各物质含量。具体实施方式0039除特别说明外，本发明中使用的技术手段均为本领域技术人员公知的方法，下述实施例目的是为了更好地理解本发明，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围前提下，对这些实施方案中的反应条件、分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范。
18、围。0040树脂对脂肪酶的固定化率按以下公式计算0041固定化率吸附前酶液蛋白浓度吸附后酶液蛋白浓度/吸附前酶液蛋白浓度1000042固定化脂肪酶的酶活力用比酶活来表示。比酶活的测定以反应温度为50、棕榈油与油酸的摩尔比为18、加酶量为8、搅拌转速为200R/MIN条件下每毫克脂肪酶蛋白的酶活来计算。而酶活由单位时间内OPO的UMOL增量来决定。0043固定化脂肪酶的SN1,3专一性以类区域异构体过量百分数ANALOGYREGIOISOMERICEXCESS,ARE表示0044ARESN1,3OLEINSN2OLEIN/SN1,3OLEINSN2OLEIN0045据食品安全国家标准食品添加剂1。
19、,3二油酸2棕榈酸甘油酯中规定1,3二油酸2棕榈酸甘油酯OPO含量以C52甘油三酯计，且产品中三棕榈酸甘油酯PPP含量亦是产品的重要指标之一产品中OPO40，PPP10。0046据食品安全国家标准食品添加剂1,3二油酸2棕榈酸甘油酯中规定2位棕榈酸占所有棕榈酸的质量分数W1以表示W152，计算公式为0047W1WP2/3WP100；0048式中WP2表示2位棕榈酸含量，WP表示样品所有棕榈酸含量，3为换算系数。0049脂肪酸的检测方法参照GB/T173772008动植物油脂脂肪酸甲酯的气相色谱分析。0050实施例17不同树脂固定化SN1,3专一性脂肪酶并合成OPO0051用苯乙烯骨架的七种大孔。
20、吸附树脂DM11、DM130、AB8、D3520、NKA、SD300、SD600分别固定SN1,3专一性脂肪酶，制备固定化脂肪酶。七种树脂的具体特性见表1。0052固定化脂肪酶的制备方法为00531将3G脂肪酶粉SN1,3专一性脂肪酶溶于100MLPH95、01MOL/L的甘氨酸氢氧化钠缓冲溶液中浸提1H，常温下2000R/MIN离心10MIN，取上清液即酶液用于固定化。00542将4G预处理过的树脂加入20ML酶液中，在30、200R/MIN水浴摇床中振荡吸说明书CN104140961A5/8页7附2H，洗涤抽滤，冷冻干燥得固定化脂肪酶即固定化SN1,3专一性脂肪酶。0055大孔吸附树脂的预。
21、处理方法为将树脂浸泡在10NACL溶液中1H，水洗抽滤；再在95乙醇中浸泡1H，水洗抽滤；再在5HCL溶液中浸泡1H，水洗抽滤至中性；再在2NAOH溶液中浸泡1H，水洗抽滤至中性。0056利用制备的固定化脂肪酶合成OPO，方法为0057取4G棕榈油及11G油酸加入50ML圆底烧瓶，于50、200R/MIN水浴摇床中振荡一定时间，待反应底物混合均匀且处于液态时，加入12G固定化脂肪酶，反应1H；分离出固定化脂肪酶后，反应混合物用正己烷溶解，再以KOH水醇溶液除去游离脂肪酸，再旋转蒸发除去正己烷得到高含量的OPO产品。0058以GCFID检测器测得反应产物中各物质含量及固定化脂肪酶的酶学性质见表1。
22、。0059表1七种树脂固定化SN1,3专一性脂肪酶并合成OPO00600061注相同条件下游离脂肪酶的比酶活为0104U/MG，专一性ARE90。0062如表1，在七种大孔吸附树脂中，DM11、DM130、AB8、D3520、NKA的效果D3520固定化效果最好要显著优于SD300和SD600。这是因为SD300和SD600树脂的比表面积过大，在1000M2/G左右，且其平均孔径较小，仅为而酶蛋白分子很大，使得在本实验条件下，其表面吸附的酶蛋白较少，从而使酶蛋白分子在其表面过分“舒展”，导致酶蛋白分子构象朝不利方向改变，因而固定化得到的酶的比酶活较低，且专一性有所下降，所合成的产品各项指标未达。
23、标。而DM11、DM130、AB8、D3520、NKA五种树脂的比表面积都在200600M2/G之间，平均孔径在之间，在本实验条件下，树脂表面所吸附酶蛋白量适中，酶蛋白分子处于最佳构象，因而其比酶活比游离脂肪酶有较大提高，专一性保持稳定或稍有提高，所合成的产品各项指标能达标，且反应时间较短仅1H。0063实施例815不同PH缓冲液制备固定化SN1,3专一性脂肪酶并合成OPO0064改变甘氨酸氢氧化钠缓冲溶液的PH，制备固定化脂肪酶。0065固定化脂肪酶的制备方法为00661将3G脂肪酶粉溶于100ML01MOL/L的甘氨酸氢氧化钠缓冲溶液中浸提1H，常温下2000R/MIN离心10MIN，取上。
24、清液用于固定化。00672将4G预处理过的D3520树脂加入20ML酶液中，在30、200R/MIN水浴摇床中振荡吸附2H，洗涤抽滤，冷冻干燥得固定化脂肪酶。0068D3520树脂的预处理方法同实施例4。说明书CN104140961A6/8页80069利用制备的固定化脂肪酶合成OPO，方法为0070取4G棕榈油及11G油酸加入50ML圆底烧瓶，于50、200R/MIN水浴摇床中振荡一定时间，待反应底物混合均匀且处于液态时，加入12G固定化脂肪酶，反应1H；分离出固定化脂肪酶后，反应混合物用正己烷溶解，再以KOH水醇溶液除去游离脂肪酸，再旋转蒸发除去正己烷得到高含量的OPO产品。0071以GCF。
25、ID检测器测得反应产物中各物质含量及固定化脂肪酶的酶学性质见表2。0072表2不同缓冲液PH制备的固定化SN1,3专一性脂肪酶并合成OPO00730074注相同条件下游离脂肪酶的比酶活为0104U/MG，专一性ARE90。0075如表2，本实验所用的脂肪酶为碱性脂肪酶，当缓冲液PH在90100之间时，酶液中酶蛋白分子处于最佳构象，固定于树脂上的酶蛋白分子亦处于最佳构象，因而其比酶活比游离脂肪酶有较大提高，专一性保持稳定，所合成的产品各项指标能达标，且反应时间较短。而当缓冲液PH碱性过低或过高时，酶液中酶蛋白分子的构象发生不可逆转的破坏，从而使固定于树脂上的酶蛋白分子处于不利构象，导致固定化得到。
26、的酶的比酶活较低，且专一性有所下降，所合成的产品各项指标难以达标。0076实施例1620不同给酶量制备的固定化SN1,3专一性脂肪酶并合成OPO0077改变给酶量，制备固定化脂肪酶。0078固定化脂肪酶的制备方法为00791将一定量脂肪酶粉溶于一定量PH95、01MOL/L的甘氨酸氢氧化钠缓冲溶液中浸提1H，常温下2000R/MIN离心10MIN，取上清液用于固定化。00802将4G预处理过的D3520树脂加入20ML的酶液中，在30、200R/MIN水浴摇床中振荡吸附2H，洗涤抽滤，冷冻干燥得固定化脂肪酶。0081D3520树脂的预处理方法同实施例4。0082利用制备的固定化脂肪酶合成OPO。
27、，方法为0083取4G棕榈油及11G油酸加入50ML圆底烧瓶，于50、200R/MIN水浴摇床中振荡一定时间，待反应底物混合均匀且处于液态时，加入12G固定化脂肪酶，反应1H；分离出固定化脂肪酶后，反应混合物用正己烷溶解，再以KOH水醇溶液除去游离脂肪酸，再旋转蒸发除去正己烷得到高含量的OPO产品。0084以GCFID检测器测得反应产物中各物质含量及固定化脂肪酶的酶学性质见表说明书CN104140961A7/8页93。0085表3不同给酶量制备的固定化SN1,3专一性脂肪酶并合成OPO00860087注相同条件下游离脂肪酶的比酶活为0104U/MG，专一性ARE90。0088如表3，当给酶量较。
28、小时，树脂表面吸附的酶蛋白较少，从而使酶蛋白分子在其表面过分“舒展”，导致酶蛋白分子构象朝不利方向改变，因而固定化得到的酶的比酶活较低，且专一性有所下降，所合成的产品各项指标未达标。当给酶量为01010151时，树脂表面所吸附酶蛋白量适中，酶蛋白分子处于最佳构象，因而比酶活对比游离脂肪酶有较大提高，专一性保持稳定，所合成的产品各项指标能达标，且反应时间较短。0089当给酶量为02010251时，树脂表面吸附了过多的酶蛋白，酶蛋白分子之间形成的传质阻力使固定化脂肪酶的比酶活降低。但在合成OPO时，由于其给酶量较大，所以在1H的反应时间内，其产品中各项指标仍能达标。0090实施例2126不同吸附时。
29、间制备的固定化SN1,3专一性脂肪酶并合成OPO0091改变酶液和树脂的吸附时间，制备固定化脂肪酶。0092固定化脂肪酶的制备方法为00931将3G脂肪酶粉溶于100MLPH95、01MOL/L的甘氨酸氢氧化钠缓冲溶液中浸提1H，常温下2000R/MIN离心10MIN，取上清液用于固定化。00942将4G预处理过的D3520树脂加入20ML原酶液中，在30、200R/MIN水浴摇床中振荡吸附一定时间，洗涤抽滤，冷冻干燥得固定化脂肪酶。0095D3520树脂的预处理方法同实施例4。0096利用制备的固定化脂肪酶合成OPO，方法为0097取4G棕榈油及11G油酸加入50ML圆底烧瓶，于50、200。
30、R/MIN水浴摇床中振荡一定时间，待反应底物混合均匀且处于液态时，加入12G固定化脂肪酶，反应1H；分离出固定化脂肪酶后，反应混合物用正己烷溶解，再以KOH水醇溶液除去游离脂肪酸，再旋转蒸发除去正己烷得到高含量的OPO产品。0098以GCFID检测器测得反应产物中各物质含量及固定化脂肪酶的酶学性质见表4。0099表4不同吸附时间制备的固定化SN1,3专一性脂肪酶并合成OPO0100说明书CN104140961A8/8页100101注相同条件下游离脂肪酶的比酶活为0104U/MG，专一性ARE90。0102如表4，当吸附时间较短时05H，树脂表面未吸附足够多量的酶蛋白分子，导致其固定化率、比酶活。
31、稍低，产品中各项指标未达标。当吸附时间为1H时，树脂对酶液中酶蛋白分子的吸附已经平衡，再延长吸附时间，树脂对酶蛋白分子的吸附量也不再增加，故其比酶活不再改变。另外，吸附时间对酶的专一性影响不大。0103实施例27固定化脂肪酶RMIMNOVOZYMES催化合成OPO0104取14076G棕榈油及38352G油酸加入1L反应釜中，于50、200R/MIN条件下搅拌一定时间，待反应底物混合均匀且处于液态时，加入3146GRMIM，反应9H。从第4小时开始，每隔一小时取少量反应混合物用正己烷溶解，再以KOH水醇溶液除去游离脂肪酸，再旋转蒸发除去正己烷得到高含量的OPO产品。以GCFID检测器测得反应产。
32、物中各物质含量见图1。0105实施例28固定化SN1,3专一性脂肪酶催化合成OPO0106将60G脂肪酶粉溶于2000MLPH95、01MOL/L的甘氨酸氢氧化钠缓冲溶液中浸提1H，常温下3000R/MIN离心30MIN，取上清液用于固定化。0107将200G预处理过的D3520树脂加入1000ML原酶液中，在30、200R/MIN水浴摇床中振荡吸附1H，洗涤抽滤，冷冻干燥得固定化脂肪酶。0108D3520树脂的预处理方法同实施例4。0109取14076G棕榈油及38352G油酸加入1L反应釜中，于50、200R/MIN条件下搅拌一定时间，待反应底物混合均匀且处于液态时，加入3146G固定化S。
33、N1,3专一性脂肪酶，反应9H。每隔一小时取少量反应混合物用正己烷溶解，再以KOH水醇溶液除去游离脂肪酸，再旋转蒸发除去正己烷得到高含量的OPO产品。以GCFID检测器测得反应产物中各物质含量见图2。0110由图1和图2知，在反应温度50，底物摩尔比18棕榈油油酸，加酶量6的反应条件下催化合成OPO，本发明所制备的固定化脂肪酶反应1H就能使产物中各项指标达标，而使用市售的固定化脂肪酶RMIM，则需6H。说明本发明所制备的固定化脂肪酶酶活较高，在合成OPO的反应中，能较好地缩短反应时间。且本发明所制备的固定化脂肪酶的制备成本较低，适于OPO的工业化大量合成。说明书CN104140961A101/1页11图1图2说明书附图CN104140961A11。