用作抗有丝分裂以及抗肿瘤药物的氟化喹诺酮 Kuo-Hsiung Lee，YiXia，Zheng-Yu Yang和Sheng-Chu Kuo
本发明在国立癌症研究所(National Cancer Institute)资助号CA-17625的政府资助下完成。政府对本发明具有一定权益。
发明领域
本发明涉及喹诺酮盐衍生物、包含该化合物的药用制剂、所述化合物作为抗有丝分裂以及抗肿瘤药物的使用方法，特别用于治疗肿瘤例如乳腺癌和卵巢癌。
发明背景
微管是开发抗癌化疗化合物最重要的亚细胞靶之一。长春花生物碱类以及紫杉类(taxoids)为众所周知的抗有丝分裂药物实例，此类药物临床广泛用于治疗不同的癌症(E.Rowinsky等，Pharmacol. & Ther.1992，52，35-84；J.Verweij等，Ann.Oncol.1994，5，495-505)。秋水仙碱(图1)是另一种众所周知的抑制微管装配药物(S.Hastie，Pharm. & Ther.1991，51，377-401；S.Hastie，Pharm. & Ther.1991，51，377-401)。尽管秋水仙碱用于癌症治疗效果有限，但是该药物已成为研究微管结构和功能的重要工具。长春花生物碱类、紫杉类以及秋水仙碱各自通过独特的机制与微管蛋白相互作用，所述机制可能涉及微管蛋白的独特结合部位。
作为抗有丝分裂和抗肿瘤药物的2-苯基-4-喹诺酮系列的合成及生物学评价已有报道(S.Kuo等，J.Med.Chem.1993，36，1146-1156；L.Li等，J.Med.Chem.1994，37，1126-1135；L.Li等，J.Med.Chem.1994，37，3400-3407)。用国立癌症研究所的60种人肿瘤细胞系(HTCL)的体外筛选以及微管蛋白聚合抑制作用分析来评价所述化合物。HTCL筛选显示大多数化合物具有细胞毒性，其GI50值在低的微摩尔至纳摩尔浓度范围。一般来说，细胞毒性与微管蛋白聚合抑制间具有良好相关性。SAR研究发现2’-氟-6，7-亚甲二氧基-2-苯基-4-喹诺酮(化合物1；图1)(L.Li等，J.Med.Chem.1994，37，1126-1135)，在HTCL筛选中显示其细胞毒性的log GI50平均值为-6.47(使细胞生长减少50％的对数浓度)。化合物1也是微管蛋白聚合的抑制剂，其IC50值为0.85μM。还证实化合物1具有良好的抗OVCAR-3卵巢细胞系的体内活性，延长带有肿瘤的小鼠地生命期达130％。
因此，本发明的目的是开发可以用作抗有丝分裂药物、抗肿瘤药物或者两种作用的药物的其它化合物。
发明概述
因此，本发明的第一方面是一种式I化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1选自以下基团：H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基(优选H或低级烷基；最优选H)；
R2选自以下基团：H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基(优选H或低级烷基；最优选H)；
R3选自以下基团：H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基(优选H或低级烷基；最优选H)；
R4选自以下基团：H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基(优选H或低级烷基；最优选H)；
R5选自以下基团：H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤代和氨基(优选H或低级烷基；最优选H)；
n为0、1、2、3或4(应当理解的是当n为0时，则所有位置都由H取代)。
作为以下结构的化合物或其药学上可接受的盐，F取代优选在苯基的邻位，或者多个F取代位于邻位和其它位置：
本发明第二方面是药用制剂，所述制剂包含或本质上包含式I化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体(例如水性载体)。
本发明第三方面是治疗肿瘤的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐。
本发明第四方面是抑制细胞有丝分裂的方法，所述方法包括使细胞与抑制细胞有丝分裂有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐接触。
本发明第五方面是式II化合物或其药学上可接受的盐：其中：
R1选自以下基团：H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、卤代、氨基以及杂环；
R2选自以下基团：H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、卤代和氨基(优选H或低级烷基；最优选H)；
R3选自以下基团：H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、卤代和氨基(优选H或低级烷基；最优选H)；
R4选自以下基团：H、羟基、低级烷基、低级烷氧基、卤代和氨基(优选H或低级烷基；最优选H)。
作为以下结构的化合物或其药学上可接受的盐，优选F取代在苯基的邻位，或者多个F取代在邻位和其它位置：
本发明第六方面是药用制剂，所述制剂包含或本质上包含式II化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体(例如水性载体)。 本发明第七方面是治疗肿瘤的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的式II化合物或其药学上可接受的盐。
本发明第八方面是抑制细胞有丝分裂的方法，所述方法包括使细胞与抑制细胞有丝分裂有效量的式II化合物或其药学上可接受的盐接触。
本发明上述以及其它目的和方面利用本发明附图以及以下说明书详细说明。
附图简要说明
图1图示本发明部分化合物以及现有技术部分化合物。
图2图示制备本发明化合物的第一个流程，即流程1。
图3图示制备本发明化合物的第二个流程，即流程2。
图4图示制备本发明化合物的第三个流程，即流程3。
优选实施方案的详细说明
本文使用的“烷基”是指直链或支链、饱和或不饱和烃基链，包括例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
本文使用的“烷氧基”是指直链或支链、饱和或不饱和烃氧基链，包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基和叔丁氧基。
本文使用的“氨基”是指取代基-NR1R2，其中R1和R2各自独立选自H和C1-C4烷基。
本文使用的“卤代”、“卤化物”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
本文使用的“杂环”是指任何杂环，特别是包含一个或两个选自N、S和O的杂原子的5元或6元杂环。
本文使用的“治疗”是指使患有疾病的患者受益的任何类型的治疗，包括改善患者病情(例如改善一种或多种症状)、延缓疾病发展等。
本文使用的“药学上可接受”是指所述化合物或组合物适合给予患者以实现本文所述治疗，而且根据疾病严重性和治疗需要没有过度的有害副作用。1.活性化合物
2’-氟-6，7-亚甲二氧基-2-苯基-4-喹诺酮(1)的合成以前已有报道(L.Li等，J.Med.Chem.1994，37，1126-1135)。烯醇醚衍生物(2-5)的合成如流程1所示。用NaH的DMF溶液处理1，接着用氯代乙酸乙酯或4-氯代丁酸乙酯烷基化获得2和4。用10％NaOH的MeOH溶液分别水解2和4获得羧酸3和5。用Lawesson氏试剂的甲苯溶液处理1获得硫酮6。在室温下用叔丁氧基羰基(Boc)的CH2Cl2溶液将1中的氮原子转化成氨基甲酸酯(7)。
根据文献方法(L.Li等，J.Med.Chem.1994，37，1126-1135)合成13(图2)。硝化3’-氯代苯乙酮(8)获得2’-硝基-5’-氯代苯乙酮。用吡咯啉亲核置换5’-氯基团，接着氢化获得11。在THF中使11和2-氟代苯甲酰氯缩合生成联芳酰胺(12)。在叔丁氧化物(叔丁氧钾)存在下环化12获得13。
图4所示化合物的制备可以通过缩合适当的2-氨基苯乙酮和2-氟代苯甲醛，接着在酸催化下环化获得终产物。
本发明公开的活性化合物可以如上所述制备成它们的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐保持所需要的母体化合物生物学活性并且不会产生不需要的毒性作用。这样的盐的实例有：(a)与以下无机酸生成的盐：例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；以及与以下有机酸生成的盐：例如乙酸、乙二酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；(b)与元素阴离子(例如氯、溴和碘)形成的盐；(c)由碱获得的盐，例如铵盐、碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)以及与有机碱(例如二环己胺和N-甲基-D-葡糖胺)形成的盐。2.药用制剂
上述活性化合物可以按照已知技术以药用载体配制用于给药。参见例如Remington，The Science And Practice of Pharmacy(第9版，1995)。在制造根据本发明药用制剂时，所述活性化合物(包括其生理学可接受的盐)通常还特别与可接受的载体混合。所述载体当然必须为可接受的，也就是与制剂任何其它成分相容，并且必须对患者无害。所述载体可以为固体或液体，或者固体和液体两种状态，并且优选用所述化合物配制为单位剂量制剂(例如片剂)，它可以包含从0.0％或0.5％至95％或99％(重量)的所述活性化合物。一种或多种活性化合物可以加入本发明制剂中，它可以通过药学上已知的任何技术制备，基本包括混合各种组分，任选包含一种或多种辅助成分。
本发明制剂包括适合以下给药途径的制剂：口服、直肠、局部、口腔(例如舌下)、阴道、胃肠外(例如皮下、肌内、真皮内或静脉内)、局部(即皮肤以及粘膜表面，包括气道表面)以及透皮，但是在任何特定情况下最适合的给药途径取决于所治疗病症的性质和严重性以及所用具体活性化合物的性质。
适合口服给药的制剂可以为独立单位，例如胶囊剂、扁囊剂、锭剂或片剂，每个单位包含预定量的活性化合物；粉剂或颗粒剂；水性或非水性液体的溶液剂或混悬剂；或者水包油或油包水乳剂。所述制剂可以用任何药学上适当的方法制备，包括使活性化合物与适当载体(可以包括一种或多种上述辅助成分)混合的步骤。通常，本发明制剂的制备是将活性化合物与液体或微细固体载体或这两类载体均匀、紧密地混合，如果需要，然后将所得混合物成型。例如可以通过压制或模塑包含所述活性化合物以及任选与一种或多种辅助成分的粉末或颗粒制备片剂。压缩片剂的制备是可以用合适的机器压制自由流动形式的所述化合物(例如粉末或颗粒)，任选混合粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性/分散剂。模塑片剂的制备可以用合适的机器模塑经惰性液体粘合剂润湿的粉状化合物。
适合口腔(舌下)给药的制剂包括所述活性化合物包含在调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中的锭剂以及所述活性化合物包含在惰性基质(例如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯胶)中的锭剂。
适合胃肠外给药的本发明制剂包括所述活性化合物的无菌水性和非水性注射溶液，优选与预定接受者血液等渗的制剂。这些制剂可以包含抗氧剂、缓冲剂、制菌剂以及使所述制剂与预定接受者血液等渗的溶质。水性或非水性无菌混悬剂可以包括混悬剂以及增稠剂。所述制剂可以装在单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿以及小瓶，可以贮存在冷冻干燥环境下，在临用前只需要直接加入无菌液体载体，例如盐水或注射用水。临时配制的注射溶液剂和混悬剂可以用前述类型的无菌粉剂、颗粒剂及以及片剂制备。例如本发明一个方面提供包含式(I)化合物或其盐的可注射的稳定无菌组合物，该组合物以单位剂型包装于密封容器中。所述化合物或盐以冻干品的形式提供，冻于制品能够用适当的药学上可接受载体复原以形成适合注射到患者的液体组合物。单位剂型通常包含约10mg～约10g所述化合物或盐。当所述化合物或盐基本不溶于水时，可以用足以使所述化合物或盐在水性载体中乳化的足够量生理学上可接受的乳化剂。一种这样的有效乳化剂为磷脂酰胆碱。
适合直肠给药的制剂优选为单位剂量的栓剂。它们的制备可以是将所述活性化合物与一种或多种常规固体载体(例如可可脂)混合，然后将所得混合物成型。
适合皮肤局部给药的制剂优选采用以下形式：软膏、乳膏、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、烟雾剂或油。可以使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇类、透皮增强剂以及两种或多种所述载体的组合物。
适合透皮给药的制剂可以为离散型贴剂，贴剂适合与接受者表皮保持长时间紧密接触。适合透皮给药的制剂还可以通过离子电渗疗法给药(参见例如Pharmaceutical Research 3(6)：318(1986))，典型采用所述活性化合物的任选缓冲的水溶液形式。合适的制剂包含柠檬酸盐或双\三缓冲剂(pH6)或乙醇/水并且包含0.1～0.2M活性成分。
进一步，本发明提供本文公开的化合物及其盐的脂质体制剂。形成脂质体混悬剂的技术在本领域众所周知。当所述化合物或其盐为水溶性盐时，用常规脂质体技术可以将前述化合物掺入到脂质囊中。在这种情况下，由于所述化合物或盐的水溶性，所述化合物或盐基本上被带入亲水中心或脂质体核。使用的脂质层可以为任何常规组合物，可以包含胆固醇也可以不包含胆固醇。当目标化合物或盐不溶于水时，再使用常规脂质体形成技术，则所述盐可能基本上被带入形成脂质体结构的疏水性脂质双分子层。在任一情况下，所制备的脂质体可以通过使用标准超声处理或者均化技术减小粒径。
当然，可以冷冻干燥包含本文公开的化合物或其盐的脂质体制剂制备冻干制品，该制品可以用药学上可接受载体(例如水)复原再生脂质体混悬剂。
其它药用组合物可以用本文公开的不溶于水的化合物或其盐制备，例如水性基质乳剂。在这样的情况下，所述组合物包含足够量的药学上可接受的乳化剂以乳化需要量的所述化合物或其盐。特别有效的乳化剂包括磷脂酰胆碱以及卵磷脂。
除了式(I)化合物或它们的盐外，药用组合物还可以包含其它添加剂，例如pH-调节添加剂。具体地讲，有效的pH-调节剂包括酸(例如盐酸)、碱或缓冲剂(例如乳酸钠、乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或葡萄糖酸钠)。进一步，所述组合物可以包含微生物防腐剂。有效的微生物防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯以及苄醇。通常在所述制剂置于多剂量使用的小瓶时使用微生物防腐剂。当然，如上所述，本发明药用制剂可以用本领域熟知的技术冷冻干燥。3.给药剂量和给药途径
本文介绍的活性化合物抑制微管蛋白聚合和/或具有抗有丝分裂活性。这样的化合物用于治疗的病症包括：牛皮癣、痛风、乳头状瘤(papiloma)、疣以及各种肿瘤，特别是实体瘤，包括但不限于肺癌(例如非小细胞肺癌)、结肠癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌以及乳腺癌。
用本发明方法治疗的患者通常为人类患者，但是本发明方法可以用于任何本领域熟练技术人员已知的合适患者，特别是哺乳动物患者，除人外还包括马、牛、狗、兔、鸡、绵羊等。如上所述，本发明提供药用制剂，所述制剂包含式I化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的以下给药途径的载体：口服、直肠、局部、口腔、胃肠外、真皮内或静脉内以及透皮。
任何具体化合物(其用途属于本发明范围)的治疗有效剂量在化合物与化合物之间、患者与患者之间略有不同并且取决于患者的病症以及给药途径。一般建议是，剂量约0.1～约50mg/kg具有治疗作用，但是口服和/或烟雾剂给药时可能使用更高剂量。在更高水平涉及的毒性可能限制静脉内剂量至更低的水平，例如至多约10mg/kg，所有重量计算基于活性基质的重量，包括使用盐的情况。静脉内或肌内给药可以使用的典型剂量为约0.5mg/kg～约5mg/kg。口服给药可以使用的剂量为约10mg/kg～约50mg/kg。
本发明用以下的非限制性实施例作更详细的说明。
实施例1
抗有丝分裂、抗肿瘤药物氟化2-苯基-4-喹诺酮
合成氟化2-苯基-4-喹诺酮衍生物并用NCI的60种人肿瘤细胞系在体外筛选评价。所得结果说明酮部分起关键的活性作用。在所测试的化合物中，发现2’-氟-6-吡咯-2-苯基-4-喹诺酮(13)对肾肿瘤细胞系和黑素瘤肿瘤细胞系具有最有效的细胞毒性活性(log GI50＜-8.00)。化合物13也是有效的微管蛋白聚合抑制剂(IC50＝0.46μM)，放射性标记的秋水仙碱结合微管蛋白，其活性相当于有效抗有丝分裂天然产物秋水仙碱、鬼臼毒素以及考布他汀A-4。A.实验
熔点用Fisher-Johns熔点装置测定，没有校正。用AtlanticMicrolabs，Atlanta，GA进行元素分析。旋光性用DIP-1000旋光计测定。1H-NMR谱用Bruker AC-300分光计测定，用TMS作内标，CDCl3作溶剂。快速色谱法在硅胶上进行(筛目25-150μM)，用己烷-乙酸乙酯混合物作洗提液。2’-氟-6，7-(亚甲二氧基)-2-苯基-4-喹诺酮(1)
将2-乙酰基-4，5-(亚甲二氧基)-苯胺(3.0mmol)溶于20mL THF和10mL三乙胺。混合物在冰浴中冷却。滴加2-氟代苯甲酰氯(3.0mmol)溶液。在0℃30分钟后，将混合物在室温下搅拌过夜，倾入50mL冰水中。收集沉淀，依次用水和甲醇洗涤。真空干燥固体，然后悬浮于20mL叔丁醇中。加入叔丁醇钾(1.17g，10.5mmol)，再将混合物在氮气氛下于70℃加热24小时。将混合物冷却后倾入到30mLNH4Cl水溶液。收集固体，依次用水以及CHCl3和MeOH的混合物(10∶1)洗涤。粗产物用CHCl3和MeOH的混合物(20∶1)重结晶。1HNMR(DMSO-d6)δ 6.20(s，1H，H-3)，6.17(s，2H，OCH2O)，7.09(s，1H，H-8)，7.43(s，1H，H-5)，7.44(m，2H，H-3’，H-6’)，7.62，7.69(两者均为t，J＝7.5Hz，分别为1H，H-4’，H-5’)；分析(C16H10FNO3)C，H，N。2’-氟-6，7-(亚甲二氧基)-2-苯基-4-(O-乙酸乙酯)喹啉(2)。
将化合物1(283mg，1mmol)溶于无水DMF(12mL)，然后在40℃搅拌下分批加入NaH(60％的油溶液，110mg，2.8mmol)。加入氯代乙酸乙酯(500mg，4.08mmol)，然后在60℃将反应物搅拌2小时。将反应混合物倾入冰水后过滤。所得沉淀用水洗涤，用CH2Cl2-MeOH重结晶获得260mg化合物2，收率71.2％；mp 119-120℃；1HNMR(CDCl3)δ1.31(t，J＝3.7Hz，3H，CH3)，4.32(q，J＝7.2Hz，2H，CH2CH3)，4.88(s，2H，OCH2COO)，6.13(s，2H，OCH2O)，7.04(s，1H，H-3)，7.17(m，1H，H-3’)，7.30(m，1H，H-5’)，7.40(m，1H，H-4’)，7.42(s，1H，H-8)，7.60(s，1H，H-5)，8.06(m，1H，H-6’)；分析(C20H16FNO5)C，H，N。2’-氟-6，7-(亚甲二氧基)-2-苯基-4-(O-乙酸)喹啉(3)。
将化合物2(160mg，0.44mmol)用NaOH水溶液(10％，15mL)处理。将反应混和物回流2小时，冷却至室温。加入HCl水溶液(10％)直至pH＝1～2。过滤收集所得沉淀，用MeOH/CHCl3重结晶获得浅黄色固体化合物3，130mg，收率87.0％；mp＞300℃；1H NMR(DMSO-d6)δ5.18(s，2H，OCH2COO)，6.33(s，2H，OCH2O)，7.42(s，1H，H-3)，7.45(s，1H，H-8)，7.48(m，2H，H-3’和H-5’)，7.54(s，1H，H-5)，7.65(m，1H，H-4’)，7.91(m，1H，H-6’)；分析(C18H12FNO5·0.25H2O)C，H，N。2’-氟-6，7-(亚甲二氧基)-2-苯基-4-(O-4’-丁酸乙酯)喹啉(4)
由化合物1和4-氯代丁酸乙酯获得；收率77.6％；mp 93-94℃；1H NMR(CDCl3)δ1.27(t，3H，CH3，J＝7.0Hz)，2.29(m，2H，CH2CH2CH3)，2.62(t，J＝7.29Hz，2H，H-3’)，4.18(q，J＝7.0Hz，2H，OCH2CH3)，4.28(q，J＝6.0Hz，2H，OCH2CH2)，6.12(s，2H，OCH2O)，7.13(s，1H，H-3)，7.15-7.30(m，3H，H-3’，H-4’，H-5’)，7.41(s，1H，H-8)，7.46(s，1H，H-5)，8.02(m，1H，H-6’)；分析(C22H20FNO5)C，H，N。2’-氟-6，7-(亚甲二氧基)-2-苯基-4-(O-乙基4’-丁基乙酸)喹啉(5)
按照合成3的相同步骤用NaOH水溶液水解4获得以上化合物；收率82.5％；mp＞300℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.10(m，2H，CH2CH2CH2)，2.49(t，2H，CH2COO)，4.29(t，2H，OCH2)，6.22(s，2H，OCH2O)，7.23(s，1H，H-3)，7.33(m，1H，H-3’)，7.35(m，1H，H-5’)，7.38(s，1H，H-8)，7.44.(s，1H，H-5)，7.52(m，1H，H-4’)，7.95(m，1H，H-6’)；分析(C20H16FNO5)C，H，N。2’-氟-6，7-(亚甲二氧基)-2-苯基喹啉基-4-硫酮(6)
将化合物1(500mg，1.77mmol)的30mL无水甲苯溶液在室温下搅拌几分钟，在连续搅拌下加入Lawessen试剂(1.07g，2.65mmol)。将混合物在110-120℃搅拌24小时，变为深橙色澄清溶液。将混合物冷却至室温，倾入水中，用CH2Cl2萃取。有机层用硫酸钠干燥，浓缩。用洗提液为CH2Cl2/CH3OH的色谱法处理获得430.6mg 6；收率81.5％；mp 226-228℃；1H NMR(DMSO-d6)δ6.24(s，2H，、OCH2O)，7.18(s，1H，H-3)，7.33(s，1H，H-8)，7.50(m，2H，H-3’，H-5’)，7.72(m，1H，H-4’)，7.77(m，1H，H-6’)，8.08(s，1H，H-5)，12.93(s，1H，NH)；分析结果(C16H10FNO2S·1.05 H2O)C，H，N。N-Boc-2’-氟-6，7-(亚甲二氧基)-2-苯基-4-喹诺酮(7)
1(283mg，1mmol)的6ml二氯甲烷溶液中加入三乙胺(0.15mL，1mmol)、二碳酸二叔丁酯(436mg，2mmol)和4-二甲基氨基吡啶(61.25mg，1mmol)。将溶液在氮气氛下于室温搅拌24小时。将混合物倾入水中，用CH2Cl2萃取，用水洗涤。有机层用硫酸钠干燥，浓缩。用洗提液为EtOAc/己烷的色谱法处理获得7；收率86.8％；mp 118-120℃，1H NMR(CDCl3)δ1.61(s，9H，3xCH3)，6.14(s，2H，OCH2O)，7.14(m，1H，H-3’)，7.20(s，1H，H-3)，7.29(s，1H，H-5)，7.40(m，1H，H-5’)，7.46(s，1H，H-8)，7.71(m，1H，H-4’)，8.07(m，1H，H-6’)；分析结果(C21H18FNO5)C，H，N。2’-氟-6-吡咯甲酰-2-苯基-4-喹诺酮(13)
将2-氨基-5-吡咯甲酰-苯乙酮(8，1g，4.9mmol)溶于10mL THF和2ml三乙胺。混合物在冰浴中冷却。滴加2-氟代苯甲酰氯(855mg，5.39mmol)溶液。在0℃30分钟后，将混合物在室温下搅拌过夜，倾入50mL冰水中。收集沉淀，依次用水和甲醇洗涤。真空干燥固体，悬浮于20mL叔丁醇中。加入叔丁醇钾(1.65g，14.7mmol)，将混合物在氮气氛下于70℃加热16小时。将混合物冷却，倾入30mL冰水中。加入10％HCl水溶液至pH＝6。收集固体，用水洗涤几次。粗产物用CH2Cl2和MeOH的混合物重结晶获得13；收率59.3％；1HNMR(DMSO-d6)δ2.01(m，4H，CH2CH2CH2CH2)，3.33(m，4H，CH2CH2CH2CH2)，6.04(s，1H，H-3)，7.04(d，J＝2.5Hz，1H，H-8)，7.10(dd，J＝2.5，9.1Hz，1H，H-7)，7.39(d，J＝9.0Hz，1H，H-5)，7.43-7.71(M，4H，H-3’，H-4’，H-5’，H-6’)；分析(C19H17FN2O·0.25 H2O)C，H，N。
化合物1-7和13用国立癌症研究所的HTCL筛选法(M.Grever等，Seminars Oncol.1992，19，622-638；A.Monks等，J.Natl.CancerInst.1991，83，757-766)测试。该分析涉及测定受试药物对一组约60种人肿瘤细胞系(大部分来自实体瘤)的生长参数的影响。各化合物的细胞毒性效能用log GI50值表示，它表示对所选择的细胞系产生50％抑制作用所需要的克分子药物浓度对数。还分析这些化合物的微管蛋白聚合抑制剂作用，并分析结合微管蛋白的最有效抑制剂[3H]秋水仙碱。
所述微管蛋白聚合以及[3H]秋水仙碱结合分析按照以前的介绍进行(S.Kuo等，J.Med.Chem.1993，36，1146-1156)。在所述聚合分析中，反应混合物包含10μM微管蛋白，而在秋水仙碱结合分析中包含1.0μM微管蛋白和5.0μM[3H]秋水仙碱。B.结果与讨论
1-7和13的细胞毒性活性总结于表1，对基于微管蛋白的影响分析总结于表2。结果显示当酮型1转化为烯醇醚(2-5)时，细胞毒性降低约100倍。化合物2-5缺少胺氢以及酮O，这两个官能团都在B环，而这些化合物对微管蛋白聚合影响很小或没有影响。发现6的细胞毒性活性也降低，而其中只是由硫酮部分代替了酮基。硫酮6类似于烯醇醚，对微管蛋白聚合只有极小的影响。这些观测结果说明在2-苯基-4-喹诺酮衍生物与微管蛋白的相互作用中以及所述相互作用引起的细胞生长抑制作用中，其酮部分起决定性作用。尽管还不确定准确的原因，可能的因素有立体化学以及电子的影响和/或药物与靶蛋白间H-键合的能力减弱。当保护基团取代胺氢，所得化合物(7)显示了有趣的细胞毒性数据。化合物7在抗HCT-116结肠癌细胞系、OVCAR-3卵巢癌细胞系时与1等效，而抗SF-295 CNS肿瘤细胞系活性低于1，抗NCI-H226非小细胞肺癌的活性几乎为1的20倍。这些细胞为对抗微管蛋白药物特别敏感的细胞(K.Paull等，CancerRes.1992，52，3892-3900)，而7保持微管蛋白聚合抑制剂适度活性。也有可能是7细胞内转化为更有效的化合物。相对于1，7与微管蛋白相互作用的减弱可能源于立体化学的因素(庞大的叔丁基)或失去胺氢(改变与微管蛋白的H键性相互作用)。N-甲基喹诺酮(15对14，图1)(S.Kuo等，J.Med Chem.1993，36，1146-1156)和2-苯基-喹唑啉酮(17对16)(E.Hamel等，Biochem.Pharmacol.1996，51，53-59)的抗微管蛋白活性丧失支持需要氮氢的观点。但是，当非活性化合物17的苯基被苯乙烯基替代(化合物18)时，出现活性显著增强(E.Hamel等，Biochem.Pharmacol.1996，51，53-59)。支持由于某些因素使7相对1活性丧失，但是也有可能是2-苯基-4-喹诺酮以及喹唑啉酮(苯基C环直接连接B环)的结合位点不完全重叠在苯基C环和B环间含连接基的2-苯乙烯基喹唑啉-4(3H)-酮(18)的结合位点。
在所述新化合物中，在6位含杂环的氟化喹诺酮13在所有的分析中是最有效的化合物。事实上在所有情况下，它比1有更强的细胞毒性，尤其是抗RXF-393肾癌细胞和SK-Mel5黑素瘤癌细胞，logGI50值＜-8.00。如log GI50平均值所示，对所有60种细胞系13的活性约为1的6倍。具有较强的细胞毒性的同时，作为微管蛋白装配抑制剂13比6更有效，但是13相对于6有更大亲和力的最有力证明是13作为[3H]秋水仙碱结合到微管蛋白的抑制剂的活性明显更高。在后一分析中，13的活性几乎与具有高度有效活性的考布他汀A-4一样(C.Lin等，Biochemistry 1989，28，6984-6991)。
以前发现2-苯基-4-喹诺酮抑制微管蛋白聚合并且抑制放射性标记的秋水仙碱结合到微管蛋白(C.Lin等，Biochemistry 1989，28，6984-6991；S.Kuo等，J Med Chem.1993，36，1146-1156；S.Kuo等，J.Med.Chem.1993，36，1146-1156)。研究了许多在A环和C环具有各种取代基的化合物。由A环和C环组成的“联芳体系”很可能(Y.Xia等，J.Med.Chem.，1998，41，1155-1162)类似于在许多抗有丝分裂天然产物(例如秋水仙碱、鬼臼毒素或考布他汀A-4)中存在的类似联芳体系(S.Hastie，Pharm. & Ther.1991，51，377-401)(图1)。但是，苯基喹诺酮中B环的药效基团几乎没有研究，而本文指出酮基官能团部分是与微管蛋白产生强相互作用的关键，为配体在秋水仙碱位置结合的机制提供新的见解。所述酮基氧以及最重要的酮型B环似乎参与此类化合物与微管蛋白的结合。7的活性降低提示，B环的胺氢也可能对最大抗微管蛋白活性很重要，但是在解释该化合物活性降低时尚需排除立体因素。
表1.氟化喹诺酮衍生物体外抑制肿瘤细胞生长a，b
细胞毒性log GI50(M)c 平均化合物
K562 NCI-H226 HCT116 OVCAR-3 RXF-393 SK-Mel5 SF-268 SF-295 log GI50 1 ntd -6.35 -7.22 -7.09 nt -7.68 -5.64 -7.26 -6.87 2 -4.42 ＞-4.00 -4.14 nt ＞-4.00 -4.14 ＞-4.00 ＞-4.00 -4.10 3 ＞-4.00 ＞-4.00 ＞-4.00 ＞-4.00 ＞-4.00 ＞-4.00 ＞-4.00 ＞-4.00 ＞-4.00 4 -4.41 -4.31 ＞-4.00 -4.82 -4.60 -4.24 ＞-4.00 -4.21 -4.32 5 -5.68 -5.07 -5.40 -5.63 -5.11 -5.40 -4.79 -5.56 -5.33 6 -4.25 -4.78 -5.26 -4.67 -4.53 -5.39 -4.70 -4.93 -4.81 7 ＞-4.00 -7.60 -7.35 -7.49 ＞-4.00 nt nt -6.93 -6.23 13 -7.49 -7.51 -7.47 -7.35 ＜-8.00 ＜-8.00 -7.41 -7.73 -7.62
a数据从NCI疾病定向性人肿瘤细胞的体外筛选获得。bK-562，白血病细胞系；NCI-H226，非小细胞肺癌细胞系；HCT-116，结肠癌细胞系；OVCAR-3，卵巢癌细胞系；RXF-393，肾癌细胞系；RXF-393，肾癌细胞系；SK-Mel5，黑素瘤；SF-286和SF-295，CNS肿瘤细胞系。c减少细胞生长50％的Log浓度。d“nt”表示没有测试
表2.氟化喹诺酮衍生物的抗微管蛋白作用
ITPa ICBb(％抑制±SD)
化合物
IC50(μM)±SD 5μMc 1μMc
1 0.68±0.02 39±2
2 ＞40
3 ＞20
4 ＞40
5 12±3
6 24±2
7 3.2±1
13 0.46±0.003 93±1 76±5
14d 7.3±1
15d ＞40
16e 14±0.9
17e ＞40
18e 50±0.6
秋水仙碱f 0.80±0.07
鬼臼毒素f 0.46±0.02
考布他汀A-4f 0.53±0.05 92±3 88±0.4
aITP＝对微管蛋白聚合的抑制作用。bICB＝对秋水仙碱结合的抑制作用；仅当聚合作用IC50≤1.0μM时评价。c在秋水仙碱结合实验中，这些值是指使用的抑制剂浓度。[3H]秋水仙碱浓度为5μM，微管蛋白浓度为1μM。d数据得自S.Kuo等，J.Med.Chem.1993，36，1146-1156.6.。e数据得自E.Hamel等，biochem.Pharmacol.1996，51，53-59。f数据得自Y.Xia等，J.Med.Chem.1998，4，1155-1162。
前面为本发明的示例性说明，不能解释为对本发明的限制。本发明通过以下权利要求限定，与权利要求等同的实施方案也包括在本发明内。